تأثیر اسانسهای رزماری، آویشن، مرزه، ویتامین E و روغنهای گیاهی بر سیستم ایمنی و میکروبیولوژی روده جوجه های گوشتی

تغذیه دام نقش اساسی در حفظ سلامتی، تولید و تولیدمثل در مزارع دام و طیور دارد. در میان عوامل تغذیه‌ای، آنتی‌اکسیدان‌ها نقش مهمی در بهبود رشد، تولیدمثل و سیستم ایمنی طیور دارند (36). این حقیقت شاید ناشی از نقش آنتی‌اکسیدان‌ها در کاهش اثرات مضر رادیکال‌های آزاد و متابولیت‌های سمی در حیوانات باشد. سیستم آنتی‌اکسیدانی شامل آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز می‌باشد که به‌ترتیب رادیکال‌های سوپراکسید، هیدروژن پراکسید و پراکسیدهای آلی را در درون سلول‌ها خنثی می‌نمایند، همچنین در این سیستم عوامل غیرآنزیمی شامل ویتامین E، کاروتنوئیدها، ویتامین C، پلی‌فنل‌ها، اسید‌اوریک، بیلی‌روبین و غیره به‌عنوان آنتی‌اکسیدان در خنثی‌سازی بسیاری از رادیکال‌های آزاد و گونه‌های فعال اکسیژن دخالت دارند. به‌علاوه، تعدادی از مواد مغذی از قبیل ویتامین‌ها، عناصر کمیاب، اسیدهای آمینه و مشتقات آن‌ها و فنول‌های گیاهی دارای اثرات آنتی‌اکسیدانی هستند (37).

چربی‌ها و روغن‌ها، نقش ارزنده‌ای را در تغذیه طیور ایفا می‌کنند. نقش بارز آن‌ها علاوه بر تولید انرژی، شرکت در ساخت غشای سلولی و پیش‌ساز ترکیباتی نظیر پروستاگلاندین‌ها، ایکوزانوئیدها و برخی هورمون‌های بدن نیز می‌باشد (44). طی تحقیقات مختلف به عمل آمده در رابطه با اثرات انواع چربی‌ها بر روی طیور، مشخص شده که این مواد مغذی موجب تغییراتی در عملکرد، وزن اندام‌های مختلف، میزان تری گلیسرید و لیپوپروتئین‌ها، میزان و ترکیب اسیدهای چرب گوشت و چربی محوطه بطنی در جوجه‌های گوشتی می‌گردد (30). به‌طور کلی، چربی‌های با غلظت بالای اسیدهای چرب اشباع در جیره، موجب افزایش سطوح تری گلیسرید و لیپوپروتئین با دانسیته پایین (LDL) و همچنین کاهش نسبت اسیدهای چرب غیراشباع به اشباع در چربی‌های ذخیره‌ای بدن می‌گردد، ولی چربی‌های غیراشباع موجب افزایش عملکرد کلی طیور می‌شوند (40). از طرف دیگر، در سال‌های اخیر توجه زیادی به تحقیقات مرتبط با کاهش میزان چربی، کلسترول و تغییر ترکیب اسید‌های چرب در گوشت دام‌های مختلف به‌خصوص مرغ معطوف شده است. تحقیقات نشان داده است که ترکیب اسیدهای چرب لاشه مرغ و نسبت اسید‌های چرب خانواده امگا6 به امگا3 در گوشت مرغ، همبستگی بسیار بالایی با این خصوصیات در جیره غذایی پرنده دارد. با این وجود، تغییر مزه و بوی گوشت به‌دلیل کاهش پایداری چربی‌ها و افزایش حساسیت آن‌ها به اکسیداسیون از تبعات ناخواسته تدابیر تغذیه‌ای برای تغییر ترکیب اسیدهای چرب لاشه مرغ است. محتوای بالاتر اسیدهای چرب غیراشباع در گوشت مرغ، درجه غیراشباع‌ را افزایش و در نتیجه، حساسیت به اکسیداسیون را افزایش می‌دهد. این رخداد ممکن است منجر به ایجاد طعم و بوی نامطلوب و در نتیجه، پذیرش کمتر توسط مصرف‌کننده شود. استفاده از آنتی‌اکسیدان‌ها در جیره طیور می‌‌تواند راه کار مناسبی جهت جلوگیری از اکسیداسیون گوشت مرغ باشد. در صنعت طیور، با توجه به مواد خوراکی رایج مورد استفاده در جیره و به‌دلیل عدم بالانس در جیره‌های بر پایه کنجاله سویا-ذرت، مصرف اسیدهای چرب غیراشباع امگا 6 افزایش و مصرف اسیدهای چرب امگا 3 کاهش می‌یابد. مصرف اسیدهای چرب غیراشباع امگا3 سبب وارد شدن آن‌ها به ترکیب لیپیدهای غشا بافت‌های مختلف از جمله سلول‌های سیستم ایمنی می‌شود. اسیدهای چرب غیراشباع امگا3، بهبود پاسخ ایمنی و کاهش التهاب را در گونه‌های مختلف مانند پرندگان، موش و ماهی‌ها نشان داده‌اند. عدم تعادل در نسبت اسیدهای چرب و خانواده‌های مختلف آن‌ها عامل مهمی برای بروز و تشدید بسیاری از بیماری‌ها و عوارض رایج از جمله نارسایی‌های قلب، روماتیسم و دیابت در انسان است (41).

درمیان مکانیسم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی مختلف، ویتامین E به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدان بسیار مؤثر شناخته شده است که از آسیب رادیکال‌های آزاد در بافت‌های مختلف به‌خصوص اسیدهای چرب غیر اشباع جلوگیری می‌کند. محققان مختلف، غلظت‌های مختلفی از ویتامین E را برای جلوگیری از استرس اکسیداتیو در مقابل اسیدهای چرب غیراشباع در تغذیه پرندگان پیشنهاد نموده‌اند. Leeson و Summers در سال 2001، 3 واحد بین‌المللی از ویتامین E را به ازای هر گرم اسیدهای چرب غیر اشباع در یک کیلوگرم خوراک و آلمانی‌ها 6/0 واحد بین‌المللی را به ازای هر گرم اسیدهای چرب غیر اشباع پیشنهاد نموده‌اند. بعلاوه، استفاده از سطوح بالای ویتامین E برای بهبود پایداری اکسیداتیو گوشت جوجه‌های گوشتی شناخته شده است (9).

رزماری یا آکلیل کوهی (Rosmarinus  officinalis) به‌طور گسترده به‌عنوان یک گیاه دارویی و آروماتیک که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی بالا می‌باشد، شناخته شده است. دی‌ترپن‌ها شامل کارنوزول، ایزورزمانول، کارنوزوئیک اسید و کافئیک اسید ترکیبات فعال رزماری می‌باشند که دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی هستند. از طرف دیگر ترکیبات اصلی اسیدهای چرب رزماری مونوترپن‌هایی شامل آلفا پینن، میرزین، سینئول و برونئول هستند که این ترکیبات امکان فعالیت‌های ضدباکتریایی و ضد‌میکروبی قوی دارند (29).

آویشن (Thymus vulgaris) یک گیاه دارویی است که به‌عنوان جایگزین طبیعی آنتی‌بیوتیک‌ها در تولیدات طیور می‌تواند مورد استفاده قرار بگیرد، به‌علاوه دارای تأثیرات بازدارندگی بر صفات چربی بطنی جوجه‌های گوشتی است به طوریکه اضافه نمودن 200 میلی‌گرم بر کیلوگرم اسانس آویشن به جیره جوجه‌های گوشتی سبب کاهش معنی‌دار درصد چربی بطنی در مقایسه با گروه کنترل گردید که این کاهش معنی‌دار در چربی بطنی می‌تواند به‌دلیل ترکیب ساپونین موجود در آویشن باشد که دارای تأثیرات بازدارندگی بر لیپوژنز می‌باشد. ترکیبات اصلی اسانس آویشن دو ترکیب اصلی تیمول و کارواکرول هستند که حدود 3 تا 60 درصد از کل اسانس‌های آویشن را شامل می‌شوند (2).

مرزه (Satureja hortensis) به‌عنوان یک ترکیب دارویی و آروماتیک شناخته شده که بومی مناطق اروپای جنوبی و بخش‌هایی از آمریکای شمالی است. اسانس آن حاوی مقادیر قابل‌توجهی از دو کتون فنولیک کارواکرول و تیمول می‌باشد. گونه‌های مختلف مرزه به‌دلیل تأثیرات ضدقارچی، ضد‌ویروسی، ضدپروتوزوآیی، ضد‌التهابی و آنتی‌اکسیدانی آن‌ها معروف می‌باشند (28).

با این وجود مطالعات در راستای بررسی اثرات متقابل منابع مختلف آنتی‌اکسیدان با منابع روغن‌های گیاهی بر فراسنجه‌های خونی، میکروبیولوژی روده و سیستم ایمنی هومورال جوجه‌های گوشتی محدود و دارای نتایج متغیر است. لذا، این مطالعه با هدف بررسی اثرات استفاده از منابع مختلف آنتی‌اکسیدان همراه با منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا بر پاسخ‌های ایمنی هومورال، میکروبیولوژی روده و برخی از فراسنجه‌های خونی جوجه‌های گوشتی طراحی و اجرا گردید.

مواد و روش‌کار

آزمایش حاضر در فارم پردیس ابوریحان-دانشگاه تهران در سال 1394 اجرا گردید. تعداد 480 قطعه جوجه خروس گوشتی سویه راس 308 در قالب یک طرح کاملاًً تصادفی با آزمایش فاکتوریل 5×2 (چهار تکرار و 12 قطعه جوجه گوشتی به ازاء هر تکرار) استفاده شد. سالن پرورش به صورت سیستم قفس بود. دو فاکتور آزمایشی شامل دو منبع روغن گیاهی (روغن سویا و روغن کلزا) و منابع آنتی‌اکسیدان (اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه هر کدام در سطح mg/kg 300  و ویتامین E به میزان mg/kg 200 جیره و بدون آنتی‌اکسیدان) بودند.جیره‌های آزمایشی براساس ذرت-کنجاله سویا برای دوره‌های مختلف آغازین (1-10روزگی)، رشد (11-24 روزگی) و پایانی (25-42 روزگی) با استفاده از نرم‌افزار جیره نویسی UFFDA تنظیم گردیدند (جدول ۱).

شرایط محیطی برای همه گروه‌های آزمایشی یکسان بود. برنامه واکسیناسیون بر اساس توصیه دامپزشک و آلوده بودن منطقه پرورش طبق جدول 2 اجرا شد. اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه از شرکت باریج اسانس (کاشان) تهیه شد. آنالیز شیمیایی اسانس‌های گیاهی توسط دستگاه GC/MASS انجام گردید. اسانس‌ها ابتدا با روغن کلزا و سویا مورد استفاده در جیره مخلوط شده و پس از آن مخلوط همگن حاصل به جیره اضافه شد.

به منظور بررسی فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون، در پایان آزمایش (42 روزگی) از هر تکرار دو پرنده با وزن نزدیک به میانگین تکرار انتخاب و مقدار 4 cc خون از طریق سیاهرگ بال از هر پرنده گرفته شد. سرم نمونه‌ها به کمک سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه و به‌مدت 10 دقیقه در دمای C° 25 جدا شد. میزان کلسترول تام و تری‌گلیسرید‌های سرم با استفاده از کیت آنزیمی شرکت زیست شیمی و دستگاه اتوآنالایزر، بر حسب میلی‌گرم در دسی‌لیتر تعیین شد. لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL) نمونه‌های سرم خون بعد از رسوب لیپوپروتئین‌های با دانسیته کم (LDL) و خیلی کم (VLDL) و با روش اندازه‌گیری کلسترول تام، اندازه‌گیری شد (11). برای تعیین غلظت LDL کلسترول سرم، از فرمول فرید والد استفاده شد (11)

برای بررسی غلظت تیتر آنتی‌بادی، واکسن نیوکاسل به صورت آشامیدنی در 16روزگی استفاده شد. 12 روز بعد از مصرف واکسن، نمونه‌های خون از سیاهرگ بال دو پرنده از هر تکرار جمع‌آوری گردید. سرم نمونه‌های خون با 10 دقیقه سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه جـدا گردیده و تا انجام آزمایش تعیین میزان آنتی‌بادی، به صورت منجمد در دمای C° 20-  نگهداری شد و در نهایت جهت اندازه‌گیری تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل توسط تست مهار هماگلوتیناسیون، به آزمایشگاه انتقال داده شدند. تیترهای آنتی‌بادی به‌دست آمده به‌صورت Log 2 بیان گردیدند.

همچنین در سن 23 روزگی، دو قطعه پرنده از هر تکرار با 1 میلی‌لیتر سوسپانسیون 7 درصد گلبول قرمز گوسفندی (SRBC) از طریق عضله ران (5/0 ml در هر عضله) مورد تزریق واقع شده، و تزریق در روز 33 نیز تکرار گردید. در روزهای 29 و 42، از پرندگان مذکور (دو قطعه به ازاء هر قفس)، خون‌گیری به‌عمل آمد. سرم نمونه‌های خون با 10 دقیقه سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه جدا گردیده و تا انجام آزمایش تعیین میزان آنتی‌بادی، به صورت منجمد در دمای C° 20- نگهداری شد. تیترهای آنتی بادی علیه SRBC با استفاده از روش آگلوتیناسیون مورد سنجش قرار گرفتند. تیترهای آنتی‌بادی اندازه‌گیری شده، به صورت Log2 عکس بالاترین رقتی که در آن آگلوتیناسیون کامل اتفاق افتاده بود، بیان گردیدند (1).

برای بررسی شمارش تفکیکی گلبول‌های سفید، در پایان دوره آزمایش، از دو پرنده در هر تکرار خون‌گیری به عمل آمد و نمونه‌های خون در لوله‌های حاوی هپارین نگهداری شد و شمارش تفکیکی گلبول‌های سفید خون با روش رنگ‌آمیزی رایت مطابق با آزمایش Mahdavi و همکاران در سال 2010 مورد سنجش قرار گرفت.

به منظور شمارش باکتریایی، 1 گرم مواد دفعی از محل ایلئوم پرنده‌های کشتار شده در انتهای دوره (از هر تکرار یک پرنده) برداشته شد و به 5 ml محلول گلیسرین اضافه کرده سپس نمونه‌ها فریز شدند. برای انجام آزمایش از روشCFU  (شمارش تعداد کلنی) در محلول استریل بافر فسفات استفاده گردید. در آزمایشگاه ظروف حاوی نمونه، به مدت نیم ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند تا به آرامی یخ آن آب شود و به باکتری‌ها شوک وارد نشود. سپس توسط ورتکس هم زده شدند تا باکتری‌ها از نمونه جدا شده و در محیط مایع آزاد شوند. برای این عمل 1 g نمونه به ml 9 بافر فسفات اضافه و سری‌های رقت با ضریب رقیق‌سازی 10 تهیه شد. از هر کدام از رقت‌ها µl 35 به هر کدام از محیط‌هایی کشت اختصاصی تلقیح شد. محیط‌هایی کشت مورد استفاده به‌صورت تجاری از شرکت مرک آلمان تهیه شدند. مقدار مورد نیاز از محیط کشت پس از تهیه، در اتوکلاو استریل و پس از رسیدن دمای محیط کشت به C° 45، به پتری دیش‌ها منتقل شده و مورد استفاده قرار گرفت. برای شمارش باکتری‌های اسید‌لاکتیک از محیط کشت ام آر اس آگار (MRS) استفاده شد و مدت 72 ساعت در دمای C° 37  انکوباسیون انجام گردید. برای شمارش اشرشیاکلی از محیط کشت مکانکی آگار (Mac agar) استفاده شد و به مدت 24 ساعت در دمای C° 37 قرار گردید. پس از طی زمان انکوباسیون تعداد کلنی‌ها بر روی پلت‌های مربوط به رقت‌هایی که تعداد کلنی‌هایی بین 30 تا 300 عدد داشتند، شمارش شدند. برای محاسبه تعداد باکتری‌ها، تعداد کلنی شمارش شده بر‌اساس واحد کلنی شکل یافته در هر گرم نمونه در عکس رقتشان ضرب و لگاریتم آن‌ها گرفته شد (17).

داده‌های به دست آمده به صورت آزمایش فاکتوریل 5×2 در قالب طرح کاملاً تصادفی با 10 تیمار و 4 تکرار با استفاده از مدل خطی(GLM) در نرم‌افزار SAS نسخه 9 تجزیه آماری گردید. تفاوت بین میانگین تیمارها بوسیله آزمون چند دامنه‌ای توکی آزمون شد و معنی‌داری در سطح 5 درصد مورد بررسی قرار گرفت.

Y_ijk = µ + A_i + B_j + (AB)_ij + e_ijk

Yijk= مقدار هر مشاهده، µ= میانگین مشاهدات، Ai= اثر سطح i از عامل A (منبع روغن گیاهی)،Bj= اثر سطح j از عامل B (منبع آنتی‌اکسیدان)، ij(AB)= اثر متقابل بین دو فاکتور A×B و eijk= اثر خطای آزمایشی می‌باشد.

نتایج

ترکیبات مؤثره اسانس‌های گیاهی: طبق آنالیز شیمیایی اسانس‌های گیاهی توسط دستگاه GC/MASS، اسانس رزماری دارای 92/24 درصد آلفا پینن و 15 درصد سینئول، اسانس آویشن دارای 53/28 درصد تیمول و 06/25 درصد کارواکرول و اسانس مرزه دارای 46/50 درصد کارواکرول می‌باشد.

فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون: اثر منابع مختلف آنتی‌اکسیدان و روغن‌های کلزا و سویا بر فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون، در جدول 3 نشان داده شده است. در این مطالعه، منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا تأثیری بر فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون نداشت. با این‌حال منابع مختلف اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه سبب افزایش معنی‌دار (001/0>P) سطح HDL و کاهش معنی‌دار (001/0>P) سطح  LDL سرم خون نسبت به تیمارهای بدون آنتی‌اکسیدان و ویتامین E گردید. اختلاف معنی‌داری بین تیمارهای بدون آنتی‌اکسیدان و ویتامین E از نظر سطح HDL مشاهده نشد ولی تیمار ویتامین E دارای سطح LDL پایین‌تری نسبت به تیمار بدون آنتی‌اکسیدان بود (001/0>P). همچنین، تیمارهای حاوی اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه دارای پایین‌ترین سطح کلسترول نسبت به تیمار بدون آنتی‌اکسیدان بودند و اسانس رزماری دارای کمترین سطح کلسترول نسبت به سایر تیمارهای اسانس‌های آویشن و مرزه بود (001/0>P). پایین‌ترین سطح تری‌گلیسیرید خون درتیمار حاوی اسانس رزماری نسبت به سایر تیمارها مشاهده شد (001/0>P).

تیتر آنتی‌بادی سرم خون:‌ اثر منابع مختلف آنتی‌اکسیدان و روغن‌های کلزا و سویا بر تیتر آنتی‌بادی علیه نیوکاسل و SRBC در طی پاسخ‌های اولیه و ثانویه، در جدول 4 نشان داده شده است. یافته‌های آزمایش حاضر بیان‌گر آن است که هر چند استفاده از منابع مختلف آنتی‌اکسیدان و روغن‌های کلزا و سویا در جیره، تأثیری معنی‌داری بر تیتر آنتی‌بادی علیه SRBC در پاسخ ایمنی اولیه و ثانویه نگذاشت، اما استفاده از منابع مختلف آنتی‌آکسیدان در جیره سبب افزایش پاسخ‌های ایمنی علیه نیوکاسل شد (001/0>P).

صفات ایمنی خون:‌اثر منابع مختلف آنتی‌اکسیدان و روغن‌های کلزا و سویا بر صفات ایمنی خون، در جدول 5 نشان داده شده است. هر چند شمارش تفکیکی اکثر گلبول‌های سفید (لنفوسیت، هتروفیل،مونوسیت،ائوزینوفیل و نسبت هتروفیل به لنفوسیت) تحت تأثیر منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا قرار نگرفت، اما با این‌حال منابع مختلف آنتی‌اکسیدان سبب افزایش عددی (08/0=P)درصد لنفوسیت‌های خون و کاهش عددی (09/0=P) درصد هتروفیل‌های خون در یک سطح حاشیه‌ای گردید. از سوی دیگر، استفاده از منابع مختلف آنتی‌اکسیدان سبب کاهش معنی‌دارنسبت هتروفیل به لنفوسیت (05/0>P) شد؛ اما تأثیر معنی‌داری بر میزان مونوسیت‌ها نداشت. استفاده از ویتامین E در جیره جوجه‌های گوشتی سبب کاهش معنی‌دار درصد ائوزینوفیل‌های خون شد و بالاترین درصد ائوزینوفیل‌ها در تیمارهای حاوی اسانس‌های رزماری و مرزه نسبت به تیمار ویتامین E مشاهده گردید (05/0>P).

جمعیت میکروبی روده:‌ اثر منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بر جمعیت میکروبی ایلئوم در جدول 6 نشان داده شده است. اگرچه جمعیت میکروبی روده تحت تأثیر منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا قرار نگرفت، اما با این‌حال اسانس‌های رزماری و آویشن سبب کاهش معنی‌دار (05/0>P) نسبت باکتری‌های اشرشیاکلی به لاکتوباسیلوس‌ها شد. به‌علاوه تیمار بدون آنتی‌اکسیدان حاوی روغن کلزا بالاترین نسبت باکتری‌های اشرشیاکلی به لاکتوباسیلوس‌ها را نسبت به سایر تیمارها (بجز تیمار ویتامین E حاوی روغن سویا) داشت (01/0>P).

جدول 1- ترکیب جیره غذایی پایه دوره­های مختلف رشدی در جوجه­های گوشتی

Table 1: Composition of basal diet at different growth periods in broiler chickens

*ترکیب مکمل ویتامینی استفاده شده به ازای هر کیلوگرم شامل :3500000 واحد بین­المللی ویتامین A، 1000000 واحد بین‌المللی ویتامین D₃، 9000 واحد بین­المللی ویتامین E، 900 mg ویتامین تیامین،3300 mg ویتامین ریبوفلاوین، 5000 mg ویتامین اسید پانتوتنیک، 15000 mg ویتامین نیاسین، 150 mg ویتامین پیریدوکسین، 500 mg ویتامین B₉، 5/7 mg ویتامینB₁₂،1000 mg منادیون، 250000 mg کولین، 500 mg بیوتین می باشد.

**ترکیب مکمل معدنی استفاده شده به ازای هر کیلوگرم شامل: 40 g منگنز، 20 g آهن، 4 g مس، 400 mg ید،  33880 mg روی.

*Vitamin mix supplied the following per kilogram of diet: vitamin A, 3500000 IU; D3, 1000000 IU; vitamin E, 9000 IU;tiamin, 900mg; vitamin B12, 7.5 mg; riboflavine, 3300 mg; niacin, 15000 mg; pantothenic acid, 5000 mg; menadion, 1000 mg; pirodoxine, 150 mg; biotine, 500 mg; choline , 250000 mg.

**Mineral mix supplied the following per kilogram of diet: Mn. 40 g; Zn, 50 g; Fe, 20 g; Cu, 4 g; I, 400 mg; Zn, 33880 mg.

جدول2- برنامه واکسیناسیون جوجه­های گوشتی

Table 2: vaccination program of broiler chicken

جدول 3- اثر منابع مختلف آنتی­اکسیدان و روغن­های گیاهی بر فراسنجه های بیوشیمیایی سرم خون (mg/dl) جوجه­های گوشتی

Table 3- Effect of antioxidants and vegetable oils different sources on blood serum biochemistry parameters (mg/dl) of broiler chickens

^a.b.cمیانگین­های دارای حروف غیر مشابه در هر ستون دارای اختلاف معنی­دار (05/0>P) می­باشند.HDL: لیپوپروتئین با چگالی بالا،LDL: لیپوپروتئین با چگالی پایین، SEM: خطایاستانداردمیانگین

^a,b,cMeans within a column with different superscripts are significantly different (P<0.05). HDL: High density lipoprotein, LDL: Low density lipoprotein, SEM: standard error of means.

جدول 4- اثر منابع مختلف آنتی­اکسیدان و روغن­های گیاهی بر تیتر آنتی بادی سرم خون جوجه­های گوشتی

Table 4- Effect of antioxidants and vegetable oils different sources on blood serum antibody titre of broiler chickens

^a.b.cمیانگین­های دارای حروف غیر مشابه در هر ستون دارای اختلاف معنی­دار (05/0>P) می­باشند. SRBC: سلول قرمز خون گوسفندی، SEM: خطایاستانداردمیانگین

^a,b,cMeans within a column with different superscripts are significantly different (P<0.05). SRBC: Sheep Red Blood Cell, SEM: standard error of means.

جدول 5- اثر منابع مختلف آنتی­اکسیدان و روغن­های گیاهی بر صفات ایمنی خون جوجه­های گوشتی

Table 5- Effect of antioxidants and vegetable oils different sources on blood immune traits of broiler chickens

^a.b.cمیانگین­های دارای حروف غیر مشابه در هر ستون دارای اختلاف معنی­دار (05/0>P) می­باشند.SEM: خطایاستانداردمیانگین

^a,b,cMeans within a column with different superscripts are significantly different (P<0.05). SEM: standard error of means.

جدول 6- اثر منابع مختلف آنتی­اکسیدان و روغن­های گیاهی بر جمعیت میکروبی ایلئوم روده جوجه­های گوشتی

Table 6- Effect of antioxidants and vegetable oils different sources on ileum microflora population of broiler chickens

^a.b.cمیانگین­های دارای حروف غیر مشابه در هر ستون دارای اختلاف معنی­دار (05/0>P) می­باشند.SEM: خطایاستانداردمیانگین

^a,b,cMeans within a column with different superscripts are significantly different (P<0.05). SEM: standard error of means.

بحث

فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون: ‌در این تحقیق، استفاده از اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه در جیره جوجه‌های گوشتی تأثیر معنی‌داری بر فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون گذاشت. بطوریکه استفاده از اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه در جیره باعث افزایش سطح HDL‌ و کاهش سطح LDL سرم خون شد. همچنین استفاده از اسانس رزماری در جیره جوجه‌های گوشتی باعث کاهش معنی‌دار کلسترول و تری‌گلیسرید سرم خون نسبت به سایر تیمارهای آزمایشی گردید (001/0>P). نحوه تأثیر اسانس‌ها بر کلسترول سرم خون ممکن است به‌طور غیر‌مستقیم از طریق تأثیری بر باکتری‌های موجود در دستگاه گوارش باشد بطوریکه اسانس‌های گیاهی می‌توانند رشد و نمو بسیاری از گونه‌های باکتریایی بیماریزا و غیر‌بیماریزا را در روده کنترل کرده و محدود نمایند. به‌علاوه، اسانس‌ها به طور مستقیم، یعنی از طریق تأثیری بر سنتز درون‌زادی کلسترول، نیز می‌توانند بر میزان کلسترول سرم خون تأثیری گذارند. مهار کامل سنتز کلسترول، نیاز به دو تنظیم کننده دارد که عبارتند از: کلسترول مشتق شده از LDL و یا یک ترکیب غیراسترول مشتق شده از موالونات که هر دو ترکیب فعالیت آنزیم 3- هیدروکسی3- متیل گلوتاریل کوآنزیم‌آ ردوکتاز را تعدیل می‌نمایند (15). کاهش در سطح کلسترول می‌تواند به‌دلیل جذب کلسترول توسط لاکتوباسیل‌ها و یا دفع کلسترول به‌همراه اسیدهای صفراوی غیر‌مزدوج باشد. بنابراین جیلیلاند و همکاران در سال 1985، این فرضیه را مطرح نمودند که برخی گونه‌های لاکتوباسیلوس قادرند کلسترول را وارد غشای پلاسمایی خود نمایند و بدین ترتیب سبب کاهش جذب کلسترول توسط میزبان ‌شوند (14) که با نتایج حاصل از این تحقیق که در آن اسانس‌های گیاهی سبب کاهش معنی‌دار (05/0>P) نسبت باکتری‌های اشرشیاکلی به لاکتوباسیلوس‌ها شد، مطابقت دارد.

در ارتباط با تأثیر اسانس‌ها بر تری‌گلیسیرید‌های سرم خون نتایج ضدونقیضی وجود دارد. در برخی از این مطالعات، استفاده از اسانس‌ها تأثیری بر تری‌گلیسیرید‌های سرم خون نداشته است (25) و در برخی سبب کاهش (24) تری‌گلیسیرید‌های سرم خون شده است. کاهش غلظت‌تری‌گلیسرید سرم در اثر افزودن مواد فعال آویشن به جیره توسط Al-Kassie در سال 2009 گزارش شد و اثرات هیپوکلسترومیک تیمول و کارواکرول به مهار آنزیم 3-هیدروکسی-3متیل گلوتاریل-کوآنزیم‌آ ردوکتاز کبدی مربوط دانسته شد. به‌علاوه کارواکرول (از مواد مؤثره آویشن) باعث تحریک رشد و تکثیر لاکتوباسیل‌ها می‌شود. لاکتوباسیل‌ها نقش مهمی در بهبود فراسنجه‌های خونی و کاهش لیپیدهای سرم دارند (39). در این مطالعه، افزودن اسانس رزماری سبب کاهش تری‌گلیسیرید‌های سرم خون شد که می‌تواند بیانگر تأثیر این اسانس بر هضم و جذب تری‌گلیسیرید‌های جیره باشد.

نتایج تحقیقات مختلف نشان می‌دهد که مصرف چربی‌های مختلف موجب ایجاد تغییراتی در پارامترهای خونی طیور می‌گردد.  Sanzو همکاران در سال 2000 در تحقیق خود نشان دادند که نمونه‌های سرم خون جوجه‌های تغذیه شده با روغن کانولا، نسبت به روغن‌های سویا و آفتابگردان، بیشترین میزان تری‌گلیسیرید و LDL را داشتند. همچنین اسیدهای چرب غیراشباع با چندین پیوند دوگانه (PUFA) بخصوص اسید لینولئیک و اسید لینولنیک، موجب کاهش سنتز اسیدهای چرب و تری‌گلیسیرید کبد شدند، که این عمل از طریق مهار فعالیت آنزیم دلتا-9-دسچوراز و کاهش ترشح لیپوپروتئین با دانسیته بسیار پایین (VLDL) از کبد به پلاسما انجام می‌پذیرد (33). با این حال در آزمایش حاضر، با استفاده از منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا، تغییری بر فراسنجه‌های بیوشیمیایی سرم خون مشاهده نگردید. عدم تأثیر روغن‌های گیاهی بر فراسنجه‌های بیوشیمیایی خون ممکن است به غلظت‌های پایین اسیدهای چرب امگا 3 در ماهیچه‌ها و به‌خصوص عدم حضور کافی متابولیت‌های اسیدهای چرب امگا3 بلندزنجیر مربوط باشد. به‌علاوه اختلاف بین مطالعات بر محتوای لیپیدهای سرم خون می‌تواند مربوط به ژنتیک یا اختلاف در جیره‌ها باشد. نتایج مطالعه حاضر با نتایج مطالعه Washburn و Nix در سال 1974 در توافق است.

تیتر آنتی‌بادی سرم خون: در طیور، بهبود ایمنی برای جلوگیری از بیماری‌های عفونی بسیار مهم است. عوامل گوناگونی مانند نارسایی واکسیناسیون، عفونت‌های حاصل از بیماری‌های سرکوبگر ایمنی بدن و استفاده نادرست از آنتی‌بیوتیک‌ها می‌تواند نقص ایمنی را القا نماید. استفاده از محرک‌های ایمنی یک راه حل برای بهبود ایمنی حیوانات و کاهش حساسیت آن‌ها به بیماری‌های عفونی است (6). در این تحقیق، نشان داده شد که آنتی‌اکسیدان‌ها در بهبود سیستم ایمنی بدن مؤثر می‌باشند. افزایش پاسخ به ویروس نیوکاسل در گروه‌های آنتی‌اکسیدانی انتظار می‌رفت، زیرا این آنتی‌اکسیدان‌ها سیستم ایمنی غیر‌اختصاصی بدن را تحریک می‌‌کنند. مشابه با این تحقیق، در مطالعه Hongو همکاران در سال 2012 نیز تیتر آنتی‌بادی علیه گلبول‌های قرمز گوسفندی تحت تأثیر روغن‌های مختلف کلزا و سویا قرار نگرفت. گیاهان غنی از فلاونوئیدها مانند آویشن (آویشن باغی) فعالیت ویتامینC  را گسترش می‌دهند که به‌عنوان آنتی‌اکسیدان عمل و بنابراین ممکن است عملکرد سیستم ایمنی بدن را بالا ببرند. در مطالعه دیگری اضافه نمودن مرزه به جیره جوجه‌های گوشتی،تیتر بیماری نیوکاسل جوجه‌های گوشتی را افزایش داد، زیرا سطوح بالای ویتامینA  و ویتامین E در این گیاه نقش مثبتی در تولید آنتی‌بادی، افزایش سطح آنتی‌بادی سرم و فعالیت فاگوسیتوز سلول‌های ایمنی ایفا می‌کند (38). در مطالعه Rahimi و همکاران در سال 2011 نیز استفاده از سیر در جیره جوجه‌های گوشتی، سبب بهبود تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل گردید. فلاونوئیدها و ترکیبات پلی‌فنولیک چندین اثر دارویی از جمله فعالیت آنتی‌اکسیدانی، مهار آزاد شدن هیستامین از ماست‌سل‌ها و مهار متابولیسم اسید آراشیدونیک را نشان می‌دهند. بنابراین بهبود پاسخ ایمنی در این بررسی در گروه اسانس‌های رزماری، آویشن و مرزه، احتمالاً مربوط ترکیبات فنولی موجود در این ترکیبات می‌باشد. از طرفی ویتامین E با حفاظت از سلول‌هایی مانند لنفوسیت‌ها، ماکروفاژها و سلول‌های پلاسما در برابر صدمات اکسیداتیو و افزایش فعالیت و تکثیر این سلول‌ها در پاسخ ایمنی نقش دارد. همچنین از طریق تحریک فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و نوتروفیل‌ها، سیستم ایمنی را تقویت می‌کند و باعث تحریک فعالیت لنفوسیت‌های T می‌شود. ویتامین E در تعدیل واکنش‌های متابولیسمی اسید آراشیدونیک از راه واکنش‌های سیکلوژناز و لیپوکسیناژ نقش دارد، بنابراین ویتامین E تولید پروستاگلاندین E2 را از طریق متابولیسم‌های ذکر شده کاهش می‌دهد و پروستاگلاندین E2 یک عامل کاهنده عملکرد سیستم ایمنی است (22).

پاسخ‌های ایمنی پرندگان به واسطه تأثیر بر تکثیر لنفوسیت‌ها و تولید آنتی‌بادی‌ها می‌تواند به‌صورت قابل ملاحظه‌ای تحت تأثیر منبع چربی جیره و ترکیب اسیدهای چرب آن قرار گیرد (12). Fritsche و همکاران در سال 1991 در تحقیق خود سطوح بالایی از منابع مختلف روغن را استفاده و گزارش نمودند که پاسخ‌های ایمنی هومورال در مقابل SRBC در پرندگانی که روغن ماهی تغذیه نمودند نسبت به روغن‌های گیاهی بالاتر بود، اما پاسخ‌های ایمنی سلولی پایین‌تر بود. در میان اسیدهای چرب، اسیدهای چرب n-3 و n-6 به‌عنوان تقویت کننده سیستم ایمنی عمل می‌کنند. اسیدهای چرب n-6 به‌عنوان فاکتور پیش التهابی و اسیدهای چرب n-3 به‌عنوان فاکتور ضد‌التهابی عمل و به این واسطه بر وظایف ایمنی و واکنش‌های التهابی در حیوانات و انسان‌ها تأثیر می‌گذارند. اسید‌اولئیک به‌واسطه فعالسازی مسیرهای مختلف ایمنی سلولی دارای وظایف ضد التهابی می‌باشد. به‌علاوه، اسید‌لینولئیک تولید آنتی بادی در جوجه‌های گوشتی را افزایش و بنابراین بر سیستم ایمنی جوجه‌های گوشتی تأثیر می‌گذارد (5). با این‌حال در آزمایش حاضر استفاده از منابع مختلف روغن‌های کلزا و سویا تأثیری بر تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل و SRBC نداشت. دلیل این امر می‌تواند به دلیل سطح ناکافی روغن‌های گیاهی در جیره و یا منابع این روغن‌های گیاهی باشد زیرا سطح و منبع n-3 PUFA می‌تواند تولید آنتی‌بادی‌‌ها را در پرندگان تحت تأثیر قرار دهد بطوریکه اسیدهای چرب n-3 بلندزنجیر مانند دوکوزاهگزانوئیک اسید و ایکوزاپنتانوئیک اسید توانایی بیشتری در افزایش پاسخ‌های ایمنی در مقایسه با آلفا لینولئیک اسید دارند. مشابه با تحقیق حاضر، گزارشات دیگری از تأثیرات غیرمعنی‌دار جیره‌های غنی شده با آلفالینولئیک اسید بر تولید آنتی‌بادی وجود دارند (42)

صفات ایمنی خون: در بسیاری از تنش‌های محیطی و یا آلودگی‌های میکروبی با حضور اندوتوکسین‌های باکتریایی (مانند لیپوپلی‌ساکاریدها)، نسبت هتروفیل به لنفوسیت معیار بسیار خوبی جهت برآورد وضعیت عملکرد ایمنی سلولی پرنده است (35). با توجه به افزایش درصد لنفوسیت‌ها، به‌‌دنبال استفاده از آنتی‌اکسیدان‌ها در جیره، این احتمال وجود دارد که بهبود تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل، مربوط به افزایش سهم این دسته لوکوسیتی باشد که در حقیقت مسئول تولید آنتی‌بادی‌ها می‌باشند (خصوصاً لنفوسیت‌های نوع B). همچنین نسبت هتروفیل به لنفوسیت به‌عنوان معیاری از شرایط استرس و بحرانی برای موجودات در نظر گرفته می‌شود و یافته‌های این تحقیق نشان‌دهنده تفاوت معنی‌داری در این صفت در نتیجه‌ مصرف منابع مختلف آنتی‌اکسیدان است. بنا به گزارش Arora و همکاران در سال 2005، اعتقاد براین است که گیاهان دارویی به‌عنوان منبع غنی ضد‌اکسیداسیون و حذف کننده رادیکال‌های آزاد می‌باشد و کاهش درصد هتروفیل خون می‌تواند به همین دلیل باشد. Al-Kassie در سال 2010 نشان داد که استفاده از اسانس‌های آویشن و زیره در جیره جوجه‌های گوشتی، سبب افزایش معنی‌دار گلبول‌های قرمز و گلبول‌های سفید خون و سبب کاهش معنی‌دار نسبت هتروفیل به لنفوسیت گردیدند. نسبت هتروفیل به لنفوسیت‌ها شاخص مهمی در ارزیابی سطح ایمنی بدن می‌باشد و هر چقدر این نسبت کمتر باشد به همین مقدار نیز سطح ایمنی بالا بوده و احتمال مقاومت در مقابل عوامل بیماریزا بهبود می‌یابد. سلول‌های سفید خونی CD8، عوامل بیگانه خارجی شناخته شده همانند ویروس، عفونت و تومور را از بین می‌برند و سلول‌های کشنده طبیعی، عوامل بیگانه را نابود می‌کنند. دانشمندان نشان دادند اسانس‌ها با افزایش لنفوسیت‌های سفید CD8 و سلول‌های کشنده طبیعی (NK) باعث افزایش قدرت سیستم ایمنی می‌شوند و این امر بسیار مهم است، چرا که افزایش این سلول‌ها توانایی بدن را در مقابل فساد و تخریب حاصل از رادیکال‌های آزاد افزایش داده و باعث افزایش مقاومت بدن در برابر بیماری و سرطان می‌شود.

شناسایی فاکتورهای تغذیه‌ای که پاسخ‌های ایمنی را تنظیم و بر حساسیت حیوانات بر بیماری‌های عفونی تأثیر می‌گذارند، مورد توجه تحقیقات گسترده‌ای هستند. مسیرهای ارتباط درون سلولی و خارج سلولی لوکوسیت‌ها تحت تأثیر الگوی جیره تغذیه‌ای، نوع مواد مغذی و سطوح بالای برخی از مواد مغذی است. در همین راستا نوع و نسبت PUFA‌ها به‌واسطه عمل بر گیرنده‌های سلولی خاص و تغییرات در الگوی تولید ایکوزانوئیدها، بر وظایف لوکوسیت‌ها تأثیر می‌گذارند. نسبت بالای اسیدهای چرب n-3:n-6 جیره، پاسخ‌های ایمنی را در جهت افزایش آنتی‌بادی و کاهش پاسخ‌های التهابی انتقال می‌دهد (23).

جمعیت میکروبی روده: فلور میکروبی دستگاه گوارش نقش مهمی در تغذیه، سم‌زدایی ترکیبات مشخص، رشد و حفاظت در مقابل باکتری‌های پاتوژن ایفا می‌کند. در جوجه‌ها عدم وجود میکروفلور طبیعی یک عامل اصلی برای ایجاد عفونت باکتریایی می‌باشد. از طرفی مشخص شده که فلور میکروبی نرمال دستگاه گوارش دارای آثار مثبتی بر سیستم ایمنی بدن می‌باشد. اسانس‌ها نقش شاخص و عملکردی مهمی در تغییر و اصلاح میکروفلور روده‌ای و موضعی شدن باکتری‌های پاتوژن ایفا می‌کنند. به‌نظر می‌رسد بیشترین خاصیت ضدمیکروبی در تمام اسانس‌های مورد مطالعه از ترکیب‌های مونوترپنی ناشی می‌شود. Ouwehand و همکاران در سال 2010 گزارش کردند که تحت شرایط بی‌هوازی، چندین گونه‌ از کلستریدیوم پرفریژنس به کارواکرول و سینامآلدهید،سیترال، لیمونن‌ها و تیمول حساس هستند.  Ouwehand و همکاران در سال 2010 به این نتیجه رسیدند که ترکیب تیمول و سینامآلدهید موجود در اسانس‌ها می‌تواند بهترین راه برای کنترل تکثیر باکتری‌های بیماریزا باشند و بطور بالقوه به سلامت روده کمک کند.

Croduk و همکاران در سال 2008 گزارش کردند شمار کلی‌فرم‌ها و کل میکروب‌های هوازی دستگاه گوارش جوجه‌های گوشتی تحت تأثیر اسانس‌های گیاهی قرار نگرفتند. اما از سویی Jang و همکاران در سال 2007 نشان دادند که اسانس‌های گیاهی سبب کاهش جمعیت اشرشیاکلی شدند، اما بر جمعیت سالمونلا و لاکتوباسیل تأثیری نداشتند. برخی از افزودنی‌های خوراکی دارای منشا گیاهی، مستقیم و یا غیره مستقیم، اثر قابل‌توجهی بر میکروفلور دستگاه گوارشی می‌گذارند.

 Helanderو همکاران در سال 1998 نشان دادند که تیمول موجود در گیاه آویشن و کارواکرول موجود در پونه کوهی از طریق کاهش در ATP داخل سلولی و افزایش در ATP خارج سلولی سبب گسیختن غشاء سلول باکتری اشرشیاکلی می‌شوند. این ترکیبات در اسانس رزماری نیز وجود دارند. طی بررسی که توسط Greathead در سال 2003 انجام شده است، فعالیت ضدمیکروبی اسانس‌های گیاهی در  شرایط درون تنی به خاطر ماهیت چربی دوستی آن‌ها می‌باشد که باعث تخریب یکپارچگی و ساختار غشای باکتریایی از طریق غیرفعال‌سازی آنزیم‌های خارج سلولی باکتریایی می‌باشد.

به‌علاوه، ترکیب میکروبی دستگاه گوارش می‌تواند توسط فاکتورهای محیطی، ژنتیک و مواد در دسترس روده تحت تأثیر قرار گیرد و این جمعیت باکتریایی در روده، برای ایجاد و حفظ سیستم ایمنی فعال، بسیار مهم هستند. به‌علاوه، میکروفلورای روده یک نقش بسیار مهم در سلامت دستگاه گوارش بازی می‌کند و این جمعیت میکروبی به جیره غذایی به‌عنوان منبع نهایی برای متابولیسم ترکیبات آلی وابسته است و تأثیر چربی‌های جیره بر ترکیب میکروفلورای روده به‌واسطه تأثیر مستقیم بر هضم و جذب مواد غذایی به وسیله پرندگان شناخته شده است. در آزمایش Ghahremani و همکاران در سال 2017 با اضافه کردن روغن سویا به جیره جوجه‌های گوشتی، جمعیت لاکتوباسیلوس‌ها افزایش و جمعیت باکتری‌های اشرشیاکلی کاهش یافت. Freitas و همکاران در سال 2008 گزارش کردند که اضافه کردن روغن سویا می‌تواند سرعت رشد جمعیت باکتریایی را حداکثر نماید. Innis و همکاران در سال 2006 در تحقیق خود گزارش نمودند که روغن کانولا در جیره غذایی، جمعیت باکتری‌های اسید لاکتیکی روده را افزایش داد. تأثیر چربی بر میکروفلورای دستگاه گوارش ممکن است به‌دلیل تأثیر آن بر هضم، ویسکوزیتی، سطح pH و انتقال مواد مغذی در دستگاه گوارش باشد.

نتیجه‌گیری کلی: یافته‌های آزمایش حاضر بیان‌گر آن است که هر چند استفاده از روغن‌های مختلف کلزا و سویا تأثیر معنی‌داری بر صفات ایمنی و خونی جوجه‌های گوشتی نداشت، اما افزودن آنتی‌اکسیدان‌ها به ترکیب غذایی جوجه‌های گوشتی توانست پاسخ‌های ایمنی هومورال و صفات خونی را بهبود داده و نسبت هتروفیلها به لنفوسیت‌ها و همچنین نسبت باکتری‌های اشرشیاکلی به لاکتوباسیلوس‌ها را کاهش دهد. بنابراین به‌نظر می‌رسد که استفاده از آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی در جیره جوجه‌های گوشتی،با افزایش لنفوسیت‌ها و تیتر آنتی‌بادی سرم خون پرندگان، می‌تواند سبب افزایش توان ایمنی و در پی آن افزایش سلامتی آن‌ها گردد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان از دانشگاه تهران-پردیس ابوریحان به خاطر حمایت مالی برای اجرای این طرح کمال سپاس را دارند.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است.