هیداتیدوز یک عفونت انگلی است که توسط مرحله‌ی لاروی کرم اکینوکوکوس گرانولوزوس ایجاد می‌شود و به عنوان یک بیماری زئونوز مهم در علم پزشکی و دامپزشکی مطرح است. در سیر تکاملی این انگل دو میزبان پستاندار وجود دارد. کرم بالغ در روده کوچک سگ و سگ‌سانان (میزبان نهایی) ایجاد تخم‌هایی می‌‌کند که حاوی جنین شش ‌قلابه آلوده‌کننده است. بعد از خوردن تخم توسط میزبان واسط (انسان و علفخواران) مرحله لاروی در ارگان‌های داخلی، اساسا کبد و ریه رشد و تکامل‌یافته و ایجاد کیسه‌های پر از مایع می‌‌کند(6,17).

توانایی زنده‌ماندن کیست هیداتید درون میزبان واسط به مدت طولانی  نشان‌دهنده آن است که انگل دارای استراتژی‌هایی برای فرار از سیستم دفاعی میزبان است. علاوه بر سد فیزیکی لایه فیبروزی کیست، ترکیبات آنتی‌‌ژنیک مایع کیست هم در فرار انگل از سیستم ایمنی میزبان درگیر است (20). در سال‌های اخیر مطالعات متعددی بر روی مکانیسم‌های درگیر در استقرار کیست هیداتید انجام شده است که نقش مولکول‌‌های تنظیم ایمنی را مهم دانسته‌اند. این مولکول‌ها یا بطور مستقیم عملکرد بعضی از سلول‌های ایمنی را تضعیف می‌کنند یا سبب تحریک جمعیتی دیگر از سلول‌ها می‌شوند که زمینه فرار انگل از سیستم ایمنی میزبان را فراهم می‌کند (10). سپس این سوال طرح شد که انگل برای تعدیل سیستم ایمنی میزبان از چه راهکارهایی استفاده می‌کند؟ در پاسخ به این سوال پژوهش‌هایی انجام شد که نتایج نشان داد کیست هیداتید قادر به ایجاد تغییراتی در الگوی سیتوکین‌های تولید شده از میزبان در پاسخ Th₂ و نقش مهم سلول‌های تنظیم‌گر (Treg) در تکامل عفونت هیداتید است که ارتباط با بقای انگل در بدن میزبان دارد (5,14). همچنین نتایج مطالعات نشان داد که فاکتورهای محلول داخل مایع کیست هیداتید ممکن است به سیستم لنفاوی میزبان دسترسی پیدا کرده و با فعال‌ کردن سلول‌های Treg سیتوکین های مهم در تعدیل و سرکوب التهاب مثل IL₁₀ و(Transforming Growth Factor beta) TGF-ß تولید می گردد. در این صورت با توقف تحریک پاسخ Th₁/Th₂  عملکرد سیستم ایمنی میزبان تنظیم می شود (24).

به طور کلی، انگل با کمک دو مکانیسم، پاسخ ایمنی میزبان را مهار می‌‌کند: اولین مکانیسم، فرار از سیستم ایمنی و تبدیل به کیست است که از اثرات آسیب پاسخ ایمنی میزبان جلوگیری می‌‌کند و دومین مکانیسم، واسطه‌های ایمنی است که به طور فعال در کاهش و تعدیل پاسخ سیستم ایمنی میزبان تاثیر دارد. ملکول‌های واسط ایمنی موجود در مایع کیست هیداتید در پاسخ ایمنی ذاتی، پاسخ ایمنی اکتسابی، ظهور پاسخ‌های ایمنی هومورال و سلولی نقش دارند (21). اخیرا آپوپتوز به‌ عنوان بخش مهمی از ایمنی ذاتی میزبان در سرکوب انگل‌ها و همچنین دفاع انگل در مقابل سیستم دفاعی میزبان و تعدیل آن مورد بررسی قرار گرفته است.

آپوپتوز یک نوع مرگ برنامه ریزی شده سلول است که توسط تغییرات مرفولوژیک و بیوشمیایی شناسایی می‌شود. در این مکانیسم 2 مسیر مهم خارجی (رسپتورهای مرگ) و داخلی (میتوکندریال) نقش دارند که فاکتورهای متعدد در این مسیرها فعالیت دارند. آبشار آنزیمی کاسپازها و پروتئین‌های خانوادهBcl-2،دو عضو مهم مرگ برنامه‌ریزی شده داخلی می‌باشند. در آبشار آنزیمی، Caspase 3 و در خانواده Bcl-2 پروتئین‌ پروآپوپتوتیکBax  و آنتی آپوپتوتیک Bcl-2، مهمترین نقش را در آپوپتوز ایفا می‌کنند (7).

مرگ‌های ایجاد شده توسط عفونت‌های انگلی اغلب در اثر آسیب‌های بافتی است که نتیجه یک نوع مرگ سلول میزبان است که تحت عنوان آپوپتوز شناخته شده است (3). با بررسی تحقیقات انجام شده در آپوپتوز سلول‌های سیستم ایمنی میزبان توسط انگل‌ها، به این نتیجه می‌توان دست یافت که تعدادی از انگل‌ها قادر به تعدیل پاسخ ایمنی میزبان از طریق القای آپوپتوز سلول‌های ایمنی بوده و در واقع انگل از سیستم ایمنی میزبان فرار می‌کند (8،18،22). در مورد انگل اکینوکوکوس کمتر به این مساله پرداخته شده است بنابراین کشف و شناسایی طرز عمل و نقش آپوپتوزی که توسط انگل ایجاد و یا کنترل می شود مهم است در مطالعه حاضر اثر سیتوتوکسیسیتی، القاء آپوپتوز و سازوکار القاء آپوپتوز مایع هیداتید گاوی بر روی سلول‌های لنفوسیت گاو به عنوان سلول‌های موثر ایمنی علیه اکینوکوکوس گرانولوزوس بررسی شد. از آنجایی که مطالعات تاکید بر تنوع ترکیبات نمونه‌های مایع هیداتید دارد و این تنوع ممکن است در عملکرد تنظیم سیستم ایمنی علیه کیست موثر باشد، لذا در این مطالعه اثر مایع هیداتید کیست‌های بارور و غیربارور در القاء آپوپتوز نیز مقایسه گردید.

مواد و روش‌کار

به ‌دست ‌آوردن کیست‌ها: با مراجعه به کشتارگاه فساران اصفهان کبدهای آلوده به کیست هیداتید گاوی به آزمایشگاه انگل شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان انتقال داده شد. جهت به‌ دست‌ آوردن مایع کیست و مشخص‌کردن وضعیت کیست‌ها (بارور یا استریل بودن)، مایع کیست از نظر وجود یا عدم وجود پروتواسکولکس و قلاب‌ها بررسی گردید (1). مایع 3 عدد کیست بارور و 3 عدد کیست غیربارور جهت انجام آزمایشات انتخاب شدند. به منظور ته‌نشین‌شدن پروتواسکولکس‌ها و باقیمانده لایه‌ها، مایع کیست جمع‌آوری شده در لوله‌های فالکون استریل50میلی‌لیتر، در دور ×g 2000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردید. مایع رویی در لوله‌های فالکون جدید استریل جمع‌آوری و برای انجام مطالعات بعدی در -20  درجه سانتی‌گراد نگه داری شد.‌

 به‌دست‌آوردن نمونه خون گاو غیرآلوده به کیست هیداتید: به ‌منظور بررسی بیان ژن‌های آپوپتوز  Bax، Bcl-2و Caspase 3 القا شده در لنفوسیت‌های گاو توسط مایع کیست هیداتید بارور و غیربارور، با مراجعه به کشتارگاه فساران، از ورید گردن 10 عدد گاو  با سرنگ 50 میلی‌لیتر آغشته به هپارین خونگیری انجام شد. طی مرحله کشتار و بررسی اعضا و احشای داخلی (کبد، ریه، طحال و ...) گاو، دام غیرآلوده به کیست هیداتید شناسایی و نمونه خون آن به آزمایشگاه کشت سلولی گروه انگل‌شناسی دانشکده پزشکی انتقال داده شد.

جداسازی و کشت لنفوسیت‌های گاوی: 20 میلی‌لیتر از خون کامل گاو آغشته به هپارین با ml20 بافر HBSS فاقدca²⁺وMg²⁺(8M NaCl, 0.4M KCl, 0.12M Na₂Hpo₄, 0.35M NaHco₃, 1M D-Glucose) مخلوط و لنفوسیت‌ها با استفاده از روش Ficoll (Lymphodex, inno-train, H9L6095) با سرعت ×g1500، در دمای20-18 درجه سانتی‌گراد، به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ و جداسازی شد. سلول‌های به دست آمده پس از شستشو، شمارش شده و با رنگ حیاتی تریپان‌بلو از نظر زنده بودن بررسی و در پلیت‌های  5/3 سانتی‌متر حاوی محیط RPMI مغذی تقسیم شد (4).

به ‌منظور بررسی اثر سیتوتوکسیسیتی مایع کیست بر روی لنفوسیت‌ها از آزمون MTS استفاده شد. آزمون MTS یک روش رنگ سنجی است با فرمول شیمیایی که در زیر آمده است :

3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2 (4-sulfophenyl)2H-tetrazolium inner salt

این روش تعداد سلول‌های زنده را در پلیت‌های چند خانه‌ای شمارش می‌کند که بر اساس احیای رنگ توسط آنزیم ردوکتاز میتوکندری در سلول‌های زنده استوار است که با استفاده از نمک زردرنگ تترازولیوم شناسایی می‌شود. این ماده به ‌وسیله سلول‌های زنده جذب و کریستال‌های بنفش رنگ محلول فورمازان تشکیل می‌گردد. میزان این ترکیب رنگی توسط اسپکتروفتومتر خوانش می‌شود.

روش انجام MTS: تعداد 10⁵ سلول در حجم 100 میکرولیتر محیط مغذی در هر چاهک پلیت 96 تایی ته ‌صاف تقسیم شد. به‌ منظور سازگارشدن لنفوسیت‌ها در محیط تازه، پلیت‌ها در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5 درصد CO₂ و رطوبت 95درصد به مدت 2 ساعت نگه‌داری شدند. سپس از مایع کیست‌های بارور و غیربارور 10درصد و 15درصد به چاهک‌های مربوطه اضافه و از سلول‌های بدون تیمار با مایع کیست به ‌عنوان کنترل منفی استفاده شد. آزمایش برای هر غلظت 3 بار تکرار گردید و سلول‌ها به مدت 24 ساعت در شرایط کشت نگه‌داری شدند. پس از گذشت مدت زمان تیمار، پلیت از انکوباتور خارج و با سیتوسانتریفیوژ با سرعت ×rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی به‌ آرامی از کنار هر چاهک به کمک سمپلر جمع‌آوری و دور ریخته شد. سپسlµ80RPMI  خالص و 20 میکرولیتر معرف MTS به هر چاهک اضافه و مخلوط شد، پلیت‌ها با فویل پوشانده و به مدت 3 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید. جذب نوری چاهک‌ها پس از 3 ساعت انکوباسیون با دستگاه Elisa Reader در طول موج  490 نانومتر خوانش شد (23).

بررسی بیان ژن‌های آپوپتوز به روشReal Time PCR : بررسی بیان ژن‌های آپوپتوزBax, Bcl2و Caspase 3در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع هیداتید بارور و غیربارور طبق مراحل زیر انجام گردید.

استخراج RNA از لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع هیداتید کیست‌های بارور و غیربارور: cell/ تعداد 10⁶×2 لنفوسیت به ‌دست آمده با روش فایکول، با 200میکرولیتر (10 درصد) مایع کیست‌های بارور و غیربارور تیمار شد. مراحل استخراج RNA با کیت استخراج (Jena Bioscience PP-210S) و سپس سنتز cDNA با کیت cDNA )فرمنتاز (Fermentas, #k1621 طبق دستورالعمل کیت‌ها انجام گردید.

 Real Time-PCR: توالی ژن‌های مورد نظر از سایت http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene گرفته و با استفاده از برنامه‌هایgene runner وOligo Analyzer طراحی پرایمر اختصاصی انجام شد. سپس با استفاده از سایت NCBI پرایمرها به منظور بررسی عدم اتصال به توالی‌های غیراختصاصیBLAST شدند. ژن GAPDH در این مطالعه به عنوان ژن مرجع و یاhousekeeping  مورد استفاده قرار گرفت (جدول 1).

برای انجام آزمایش از کیت Syber green Ampliqon, A325402)) استفاده شد. مقدار  µl10Master Mix  و  µl 5/1 cDNA و 1میکرولیتر از پرایمرهای رفت و برگشت با 5/6 میکرولیتر آب مقطر مخلوط و داخل دستگاه ترموسیکلر Real time PCR (شرکت ABI-ساخت آمریکا) قرار داده شد. در این مرحله برای هر نمونه 3 بار تکرار و از cDNA لنفوسیت‌های بدون تیمار به عنوان کنترل منفی استفاده شد. پس از انجام واکنش میزان سیکل آستانه (CT) نمونه‌ها توسط دستگاه به صورت مقادیر کمی اندازه‌گیری می‌شد. برنامه زمان‌بندی دستگاه و دماهای مربوطه در جدول 2 آمده است.

بررسی‌های آماری: آنالیز نتایج حاصل از آزمون MTS با استفاده از آزمون T تک نمونه‌ای و آنالیز نتایج حاصل از واکنش
Real-Time PCR، با استفاده از فرمول 2^-ΔΔCT (9) که در زیر آمده است و نرم‌افزارهای REST (version2.0.13,2009) و SPSS (version 20) با آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفهANOVA  انجام شد. در این مطالعه 05/0P   معنی دار تلقی گردید.

2^-ΔΔCT=2^{-ΔCT(Treated Group) - ΔCT(Untreated Group)}

ΔCT=CT Gene – CT Housekeeping Gene

نتایج

نتایج آزمون MTS: اولین گام در بررسی آپوپتوز بررسی سیتوتوکسیسیتی است که در این مطالعه با روش MTS میزان سیتوتوکسیسیتی مایع کیست هیداتید بارور و غیربارور بر روی لنفوسیت‌های گاو مورد ارزیابی قرار گرفت. از مقایسه داده‌های به دست آمده از سنجش درصد حیات و فعالیت متابولیکی سلول‌های لنفوسیت تیمار شده با مایع هیداتید کیست‌های بارور و غیربارور با آزمون T تک نمونه‌ای مشخص شد که تفاوت میانگین درصد حیات سلول‌ها در غلظت‌های 10درصد و 15درصد در زمان 24 ساعت در گروه تیمار با مایع کیست هیداتید بارور و غیربارور به ترتیب در سطح 001/0= P و 002/0= P نسبت به گروه کنترل معنی‌دار بود. در زمان انکوباسیون 24 ساعته درصد مرگ سلولی با افزایش غلظت مایع هیداتید بارور و غیربارور در لنفوسیت‌ها افزایش یافته است (نمودارهای 1 و 2). همچنین میانگین زیستی لنفوسیت‌ها در گروه‌های تیمارشده با مایع کیست هیداتید بارور و غیربارور نسبت به یکدیگر اختلاف معنی‌دار (05/0 >P) داشت.

نتایج تست Real time PCR : نتایج تیمار لنفوسیت‌ها با غلظت 10درصد (l/mlµ100) مایع کیست بارور و غیربارور نشان داد که بیان ژن Bax در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست بارور نسبت به لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست غیربارور معنی‌دار (046/0P=) بود (نمودار 3-A). اگرچه بیان ژن Caspase 3 در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست بارور در مقایسه با لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع غیربارور بالاتر نشان داده شد ولی از نظر آماری تفاوت معنی‌داری نداشت (نمودار 3-B). همچنین گرچه افزایش بیان ژن آنتی‌آپوپتوز Bcl-2 در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست غیربارور در مقایسه با لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع بارور مشاهده گردید ولی تفاوت معنی‌دار نبود (نمودار3-C).

انگل‌ها دارای استراتژی‌هایی برای فرار از سیستم ایمنی میزبانمی‌باشند. مرحله لاروی کرم اکینوکوکوس گرانولوزوس نیز دارای مکانیسم‌های دفاعی پیچیده است که با فرار از پاسخ‌های ایمنی میزبان و تعدیل آن باعث بقای خود در بدن میزبان می‌شود. اخیرا آپوپتوز به‌عنوان بخش مهمی از دفاع انگل در مقابل سیستم دفاعی میزبان و تعدیل آن مورد بررسی قرار گرفته است. در مطالعات متعددی به خواص توکسینی مایع هیداتید و آپوپتوزی آن در رده‌های مختلف سلول‌های ایمنی اشاره شده است (5,11,16,24,2626). در مطالعه حاضر اثر سیتوتوکسیسیتی، آپوپتوز و سازوکار القاء آپوپتوز مایع هیداتید گاوی بر روی سلول‌های لنفوسیت به عنوان سلول‌های موثر ایمنی علیه انگل اکینوکوکوس بررسی شد.

درمطالعاتگذشتهاثر مایع هیداتید بر توانزیستیبعضیرده‌هایسلولیوالقاءآپوپتوزانجامگرفتهکهسازگار با  یافته‌هایاینپژوهشمی‌باشد. مطالعه Yin و همکاران در سال 2014 که بر روی اثر مایع هیداتید در سلول‌های طحال موش BALB/c  انجام گرفت، نشان داد که مایع هیداتید با کاهش بیان NKG2D که سیتوکین کلیدی برای تحریک سلول‌های کشنده است، اثر سیتوتوکسیسیتی سلول‌های کشنده طبیعی را کاهش می‌دهد (24). Macintyre و همکاران در سال 2000 نیز توان زیستی ماکروفاژهایp388d  تیمار شده با مایع هیداتید را با روش MTT بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد مایع هیداتید باعث کاهش معنی‌داری در میزان زنده بودن ماکروفاژها می‌شود. آنها نتیجه گرفتند که مایع هیداتید پتانسیل کنترل رشد لنفوسیت‌ها را از طریق کاهش ماکروفاژها نیز دارد. همچنین آپوپتوز سلول‌های ماکروفاژ میزبان در اطراف کیست هیداتید کرم اکینوکوکوس گرانولوزوس توسط انگل مشاهده شده است (11). در مطالعه‌ی حاضر نیز نتایج MTS  نشان داد که درصد حیات و فعالیت متابولیکی سلول‌های لنفوسیت تیمار شده با مایع هیداتید کیست‌های بارور و غیربارور نسبت به گروه کنترل در سطح معنی‌داری کاهش یافته است. همچنین میانگین زیستی لنفوسیت‌ها در گروه‌های تیمارشده با مایع کیست هیداتید بارور و غیربارور نسبت به یکدیگر اختلاف معنی‌دار (05/0 >P) داشت.

یافته‌های مطالعه‌ی حاضر و مطالعات فوق‌الذکر نشان می‌دهد که سیستم کشت یک ارزیابی ساده از اثر سیتوتوکسیسیتی از مایع هیداتید را فراهم می‌کند. بعلاوه، به نظر می‌رسد که در مایع هیداتید مولکول‌هایی وجود دارد که سبب مهار سلول‌های ایمنی می‌شود. ممکن است این مولکول‌ها که توسط انگل ایجاد شده است به تدریج به نواحی اطراف کیست آزاد شده و سبب مهار و مرگ سلول های ایمنی مانند ماکروفاژها، لنفوسیت‌ها و سلول‌های کشنده طبیعیمیزبان ‌شود که احتمالا می‌تواند توصیفی برای فرار انگل از کنترل ایمنولوژیکی میزبان خود باشد (11,24).

برای تعیین سازوکار آپوپتوز میانگین بیان ژن پروآپوپتوز Bax و ژن آنتی آپوپتوز Bcl-2 و آنزیم Caspase 3که نقش کلیدی در مکانیسم آپوپتوز را دارند، اندازه گیری شده است. نتایج نشان داد که بیان ژن Bax به طور معنی‌دار (05/0 >P) و بیان Caspase 3 در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست هیداتید بارور در مقایسه با لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع غیربارور و گروه کنترل بالاتر بوده است. با توجه به اینکهیکی از محرک‌های فعال‌کننده مسیر داخلی توکسین‌ها می‌باشند، به نظر می‌رسد که مایع کیست هیداتید با اثر توکسینی خود از طریق مسیر میتوکندریال سبب القای آپوپتوز در لنفوسیت‌ها شده است. افزایش بیان ژن Bax و کاهش بیان ژن آنتی آپوپتوز Bcl-2 با تغییر و نفوذپذیری غشای میتوکندری و به دنبال آن فعال‌کردن آبشار کاسپازی و افزایش بیان Caspase 3 سبب آپوپتوز سلول‌های لنفوسیتی شده است. قابل ذکر است که بیان ژن‌های پروآپوپتوتیک Baxو Caspase 3 در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع هیداتید بارور نسبت به غیربارور و کنترل بیشتر است. از طرف دیگر بیان ژن آنتی‌آپوپتوتیک Bcl-2در این گروه در مقایسه با لنفوسیت های تیمار شده با مایع هیداتید غیربارور و کنترل کمتر  است. یافته‌های مطالعه حاضر با نتایج پژوهش Mokhtari و همکاران در سال 2011 که بیان این ژن‌ها را  در لنفوسیت‌های تیمارشده با مایع‌ کیست هیداتید انسان به روش نیمه کمی RT-PCR اندازه‌گیری کرده بودند، هم‌خوانی دارد (15). در مطالعه‌ای دیگر فعالیت میتوزی و تغییرات غشا لنفوسیت‌های تحت تاثیر غلظت‌های مختلف مایع هیداتید در محیط کشت بررسی شد. نتایج حاکی از اثرات سیتوتوکسیسیتی مایع هیداتید در کاهش فعالیت فازS  سلولی بود، که با تغییرات در غشا لنفوسیت‌ها همراه بود. نتایج پژوهش آن‌ها، افزایش CD38 وCD25 و کاهش CD28 را بر سطح Tcell ها نشان داد که می‌تواند نمایانگر آپوپتوزیا عدم پاسخ Tcell ها در اثر مایع هیداتید باشد. همچنین نتایج آن‌ها نشان داد که مایع هیداتید غیربارور اثر مهاری کمتری از مایع هیداتید بارور دارد (13)، نتایج پزوهش حاضر هم نشان می دهد مایع هیداتید غیربارور اثر سیتوتوکسیسیتی و همچنین اثر آپوپتوزی کمتری از مایع هیداتید بارور دارد. این نتیجه که مایع کیست غیربارور نیز سبب کاهش توان زیستی لنفوسیت‌ها و آپوپتوز آنها شده نمی‌تواند ثابت کند که باروری شرط لازم برای اثر توکسینی یا آپوپتوزی مایع هیداتید باشد ولی می‌تواند نشان دهد که پتانسیل تعادل و تعدیل سیستم ایمنی میزبان توسط ترشحات یک کیست هیداتید ویژگی محیط داخلی انگل است که ممکن است پاسخ علیه میزبان را سازمان‌دهی کند. از طرف دیگر، نتایج نشان می‌دهد که توان زیستی و فعالیت متابولیتی در لنفوسیت تیمار شده با مایع هیداتید غیربارور بیشتر و القا آپوپتوز کمتر بوده است. به نظر می‌رسد که مولکول‌های موجود در دو نوع کیست متفاوت می‌باشند، احتمالا آنتی‌ژن های ترشح شده از پروتواسکو-لکس‌های موجود در کیست‌های بارور سبب القای بیشتر آپوپتوز در لنفوسیت‌های میزبان گردیده است. همچنین، پژوهش‌های مختلف نشان داده که مایع کیست هیداتید و پروتواسکولکس‌ها بر کاهش رشد سلول‌های توموری از راه افزایش مرگ سلولی و مهارتکثیرT-cell ها نیز اثر دارد (2,12,25).

این بررسی‌ها تعیین می‌کندکهمولکول‌های مایع کیست هیداتید و پروتواسکولکس‌ها قادر به ایجاد آپوپتوز در سلول‌های ایمنی میزبان بوده، بنابراین یکی از دلایل بقای انگل اکینوکوکوس گرانولوزوس در بدن میزبان واسط وجود پروتئین‌های ضروری در مایع کیست است. در واقع مایع کیست هیداتید در تنظیم پاسخ ایمنی ذاتی میزبان علیه انگل دخالت دارد. مایع هیداتید مخلوط پیچیده‌ای ازترکیبات مشتق از میزبان و ترکیبات مشتق از فعالیت متابولیکی انگل می‌باشد (19). بنابراین باید مطالعات بیشتری بر روی شناسایی مواد و مولکول‌های موجود در کیست‌های بارور و غیربارور در میزبان‌های مختلف انجام شود.

نتیجه‌گیری نهایی: یافته‌های این مطالعه نشان داد که مایع هیداتید می‌تواند باعث کاهش توان زیستی و فعالیت متابولیتی لنفوسیت‌ها و همچنین با افزایش بیان ژن Bax و آنزیم Caspase 3 و کاهش بیان ژن آنتی آپوپتوز Bcl-2سبب القا آپوپتوز در این سلول‌ها شود. شناسایی و آنالیز ترکیبات مایع هیداتید به‌ عنوان مسئول القای آپوپتوز ممکن است در روشن ‌شدن این مطلب که چگونه این انگل می‌تواند پاسخ ایمنی میزبان را به نفع خود کنترل و تعدیل کند، کمک کننده باشد که البته نیاز به مطالعات بیشتری در این زمینه می باشد.

سپاسگزاری

این مقاله برگرفته از پایان‌نامه کارشناسی ارشد رشته انگل‌شناسی به شماره 394906 است که با همکاری دانشگاه علوم پزشکی اصفهان انجام شده است. از همکاری معاونت پژوهشی و مسئولان بخش انگل‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی و کشتارگاه فساران اصفهان قدردانی می‌شود.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

جدول 1. پرایمرهای طراحی شده

جدول 2. زمان و دماهای مربوط به واکنش Real time PCR

نمودار 1. مقایسه درصد حیات (میانگین ± انحراف معیار)  لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع هیداتیک به تفکیک غلظت در گروه بارور با گروه کنترل (100%)

نمودار 2. مقایسه درصد حیات (میانگین ± انحراف معیار) لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع هیداتیک به  تفکیک غلظت در گروه غیربارور با گروه کنترل (100درصد) ***: 002/0P =

نمودار 3. A مقایسه میانگین بیان ژن Bax در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست بارور و غیربارور وگروه کنترل. B مقایسه میانگین بیان ژن Caspase 3در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست بارور و غیربارور و گروه کنترل. C مقایسه میانگین بیان ژن Bcl-2 در لنفوسیت‌های تیمار شده با مایع کیست بارور و غیربارور و گروه کنترل. *:05/0 >P