بررسی تأثیر ژن AtEXPA18 آرابیدوپسیس بر صفات ریشه و بذر لاین های تراریخته توتون

بسیاری از گیاهان بوسیله بذر تکثیر پیدا می­کنند. رشد و توسعه بذر به ژنتیک و مواد مغذی که از والدین به آن منتقل می­شود بستگی دارد. بر اساس مطالعات ژنتیک عوامل مادری و غیر مادری در تنظیم اندازه بذر دخالت دارند و ارتباط بین بافت مادری و تخم می­تواند هماهنگ کننده اندازه بذر باشد (Garcia et al., 2005). اطراف سلول­های گیاهی بوسیله دیواره سلولی احاطه شده است. دیواره سلولی از عناصر مهمی چون پلی­ساکاریدها، پروتئین­ها (Carpita & Gibeaut, 1993) و ترکیبات فنلی و سایر مواد تشکیل شده است و تعیین اندازه و شکل سلول گیاهی توسط دیواره تنظیم می­شود (Varner & Lin, 1989). دیواره سلولی دارای عملکردهای پشتیبانی ساختاری، تعیین شکل سلول، حفاظت در برابر عوامل بیماری زا (پاتوژن ها) و سایر مهاجم­های موجود در محیط زیست، ذخیره سازی و رها کردن سیگنال­های مولکولی، ذخیره کردن کربوهیدرات­ها، یون­ها و مواد دیگر است
(Cosgrove, 1999). برای طویل شدن و به بلوغ رسیدن، سلول گیاهی به صورت انتخابی تغییراتی را در اجزءای دیواره شامل: اکسپنسین­ها، اندوگلوکان­ها، زایلوگلوکان، رادیکال­های آزاد ایجاد می­کند (Cosgrove, 1999, 2000a). اکسپنسین­ها شامل خانواده چند ژنی بزرگی از پروتئین­های سست کننده دیواره سلولی هستند. بر اساس آنالیز توالی­های اکسپنسین چهار خانواده حفاظت شده تکاملی اکسپنسین­ها در همه گیاهان روی زمین وجود دارند، این چهار خانواده شامل: آلفا اکسپنسین (EXPA)، بتا اکسپنسین (EXPB)، شبه آلفا اکسپنسین و شبه بتا اکسپنسین می­باشند (Choi et al., 2006). اکسپنسین­ها جزء عوامل اولیه مختل شدن پیوندهای دیواره و تضعیف پیوندهای غیر­کووالانسی مانند پیوندهای هیدروژنی در لایه سلولز- همی سلولز و در نتیجه افزایش سطح دیواره سلولی هستند، این پروتئین­ها مسئول تنظیم اندازه سلول­های گیاهی هستند که در دیواره سلولی وجود دارند. و وابسته به تغییرات pH می­باشند (McQueen-Mason & Cosgrove, 1994). به عنوان نمونه اکسپنسین A در دیواره­های سلولی میان گره­های برنج با pH اسیدی فعال شده و سبب افزایش رشد دیواره سلولی می­شود (Cho & Kende, 1997). اکسپنسین­ها به عنوان عامل اصلی برای افزایش طول دیواره سلولی درنظرگرفته می­شوند و سایر عوامل به عنوان عامل کمکی برای اکسپنسین­ها محسوب می­شوند (Vissenberg et al., 2000). اکسپنسین­ها به عنوان خانواده­هایی چند ژنی در آرابیدوپسیس، برنج، خیار و گوجه فرنگی شناسایی شده­اند (Cosgrove, 1999). اکسپنسین­ها در طول رسیدگی و حتی بعد از توقف رشد در نرم کردن بافت میوه (Brummell et al., 1999)، در ریزش برگ­ها^[1] (Cho & Cosgrove, 2000)، در ساخته شدن لوله گرده (Pezzotti et al., 2002)، تشکیل ریشه موئین (Cho & Cosgrove, 2002)، تمایز آوند چوبی (Milioni et al., 2001)، همزیستی و آلودگی پاتوژن (Fudali et al.,2008) نقش ایفا می­کنند. دو ژن AtEXPA18 و AtEXPA7 بطور اختصاصی در سلول­های ریشه موئین Arabidopsis thaliana بیان شدند (Cho & Cosgrove,2002). با توجه به حضور فیتوهورمون­های اکسین، جیبرلین، اتیلن، سیتوکینین و اسید آبسیزیک بیان ژن­های اکسپنسین در سلول­ها تنظیم می­شود. آنالیز ناحیه پروموتوری اکسپنسین­های برنج نشان می­دهد که آبسیزیک اسید، اکسین، جیبرلین(GA) و اتیلن عناصر پاسخگو[2] و فعال هستند  (Lee et al., 2001). ژن AtEXPA18 در توتون باعث افزایش سطح برگ و طول ساقه و در نتیجه افزایش کلروفیل و فتوسنتز در گیاهان تراریخته نسبت به گیاهان غیرتراریخته گردید، این افزایش رشد به دلیل خاصیت سست شدن دیواره سلولی و افزایش توسعه دیواره سلولی توسط اکسپنسین­ها در نظر گرفته شده است (Malek pour et al., 2013). در تحقیق حاضر تأثیر ژن اکسپنسین AtEXPA18 روی طول ریشه، وزن خشک و تر ریشه و اندام هوایی، اندازه کپسول، تعداد کپسول، وزن بذر و تعداد بذر در کپسول در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روش ها

تراریختگی توتون با سازه pBI121:AtEXPA18  

قطعه ژن AtEXPA18 از DNA استخراج شده گیاه Arabidopsis thaliana جدا و به درون ناقل pGEM-T وارد گردید. این ناقل به همراه ژن مورد نظر ابتدا به باکتری Escherichia coli DH5a مستعدشده منتقل و سپس قطعه ژنی تحت پیش برنده CaMV 35s و خاتمه‌دهنده  NOS‌ به درون ناقل بیانی pBI121 (Clonetech) همسانه­سازی گردید. سازه ساخته شده به سلول­های مستعد آگروباکتریوم سویه LBA4404 منتقل گردید (Shahnejat Bushehri et al., 2010; Malk por et al., 2013).  کلونی­های رشد کرده در محیط LB انتخابی (حاوی کانامایسین و ریفامپسین) برای تلقیح برگ­های توتون استفاده گردید. انتقال­ ژن با روش آگرواینفکشن (Ohta et al., 1990) به گیاه توتون (Nicotiana tabacum) انجام شد.

بررسی گیاهان تراریخته

به منظور جداسازی بذرهای تراریخته شده با سازهpBI121:AtEXPA18  از بذرهای غیر­تراریخته، بذرهای ضدعفونی شده در محیط کشت حاوی کانامایسین کشت شدند. بذرها ابتدا با آب دو بار تقطیر شده، شستشه شده و سپس بعد از قرارگیری به مدت یک دقیقه در الکل 70­% ، مجدداً دو تا سه بار با آب دو بارتقطیر شده شستشو شدند. در مرحله بعد به منظور ضدعفونی سطحی، بذرها به مدت 10 تا 15 دقیقه در هیپوکلرید سدیم 5% قرار گرفتند و درآخر 4 تا 5 باربوسیله آب دو بارتقطیر شده شستشو داده شدند. پتری دیش­های حاوی بذرها به منظور رشد بهینه به اتاق کشت (دمای 2 23، 60‌% رطوبت و 16ساعت روشنایی) منتقل شدند. از بین گیاهان غیرتراریخته و تراریخته که به مرحله چهار برگی رسیدند تعدادی به گلدان­های پلاستیکی کوچک (200 گرمی) حاوی کوکوپیت و پرلیت منتقل شدند و بعد از رشد مناسب، گیاهان به گلدان­های بزرگتر (دو کیلوگرمی) حاوی ترکیبات خاک: ماسه بادی: کوکوپیت و پرلیت با نسبت های 1:2:2:2 منتقل شدند و گلدان­ها به محیط گلخانه (دمای 2 25 و 16ساعت روشنایی) منتقل و تا انتهای مرحله زایشی نگهداری‌شدند. صفات تعداد کپسول، وزن کپسول و  بذرهای داخل کپسول و وزن صد دانه بررسی شدند. گیاهان در این مرحله در قالب طرح کاملاً تصادفی با هشت تکرار مورد مطالعه قرار‌گرفتند.

تعدادی دیگر از گیاهچه­ها برای بررسی مناسب­تر خصوصیات ریشه به محلول غذایی هوگلند (بدون هوادهی) منتقل شدند و در شرایط اتاقک رشد (دمای  2 23، 60‌% رطوبت و 16ساعت روشنایی) به­منظور بررسی بهتر ریشه نگهداری ‌شدند. طی آزمایش همه روزه مقداری از حجم محلول از پای گیاهان کاهش و به همان میزان محلول تازه هوگلند اضافه می‌شد. در این بخش صفات ارتفاع ریشه، وزن تر اندام هوایی، وزن خشک اندام هوایی، وزن­تر ریشه، وزن خشک ریشه، نسبت ریشه به اندام هوایی تر و نسبت ریشه به اندام هوایی خشک مورد بررسی قرار گرفت. گیاهان در  این مرحله در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار مورد مطالعه قرار­گرفتند.

نتایج و بحث

انتقال ژن و تأیید تراریختگی لاین‌های انتخابی

بعد از رشد گیاهچه‌های توتون در محیط کشت، انتقال ژن به قطعات برگی تهیه شده به روش آگرواینفکشن انجام گرفت و بعد از دو روز قرار گرفتن در محیط همکشت به محیط انتخابی جدید منتقل شدند (شکل 1-a). سپس بازا شدن ریز نمونه­های گیاهی در محیط کشت MS انتخابی حاوی کانامایسین (برای گزینش گیاه تراریخته احتمالی) و سفوتاکسیم (کاهش رشد باکتری در محیط کشت) صورت گرفت. براساس (شکل 1-b) باززایی سلول­ها به این صورت بود که سلول­ها از قسمت­های زخم خورده برگ­ها رشد کردند. گیاهچه­های بازا شده به محیط انتخابی داخل لیوان انتقال پیدا کردند و برای گلخانه انتخاب شدند. بر اساس (شکل1- c) گیاهچه­های بازا شده تراریخته سبز باقی ماندند و رشد کرده و توانستند تولید ریشه و ساقه  قوی کنند.   

شکل1- انتقال سازه ژنی به برگ­های توتون بوسیله آگروباکتریوم و بررسی تراریختگی­لاین­های انتخابی. -a برگ­های تلقیح شده با آگروباکتریوم در محیط انتخابی با کانامایسین و سفوتاکسیم، -b باززایی سلول‌های تراریخته احتمالی در محیط­کشتMS  ،  -c گیاهان تراریخته احتمالی رشد کرده در محیط انتخابی، -d قطعات حاصل از تکثیر DNA توتون با آغازگرهای ویژه آن روی ژل آگارز یک درصد(گیاهان غیرتراریخته (control)، L1-L5: گیاهان تراریخته مثبت، :Plasmid نمونه پلاسمید اگروباکتری حاوی پلاسمیدpBI121::AtEXPA18 (کنترل مثبت)، :Ladderنشانگر وزن مولکولی  λ/EcoRI +HindIII. )، e- قطعات حاصل از تکثیر cDNA توتون با آغازگرهای ویژه آن روی ژل آگارز یک و نیم درصد. -f بذور گیاهان تراریخته  35S::AtEXPA18و گیاهان غیرتراریخته در محیط کشت MS  انتخابی حاوی آنتی بیوتیک.

Fig.1- transformation gene construct into tobacco leaves by Agrobacterium  and evaluation of selected lines. a- incubated leaves with Agrobacterium on the selective medium containing kanamycin and cefotaxime., b- Regeneration of putative transgenic cells on MS medium, c- Putative transgenic plants grown on selective MS medium,  d- fragments of tobacco DNA amplification by specific primers on 1 percent agarose gel.( non-transgenic plants (control), L1-L5: Positive transgenic plants, Plasmid: Samples of the agrobacterium plasmids containing plasmid pBI121::AtEXPA18 (Positive control), Ladder: Molecular weight markers λ/EcoRI +HindIII (Qiagen).),  e-fragments of tobacco cDNA amplification by specific primers on 1.5 percent agarose gel, .f- Seeds of transgenic plants  35S::AtEXPA18  and non- transgenic plants in selective MS medium containing antibiotic.

.

 به منظور اثبات تراریختگی گیاهان، استخراجaseDNA آنها به روش CTAB انجام گرفت. سپس ژن AtEXPA18با استفاده از آغازگرهای طراحی شده و به کمک تکنیک PCR تکثیر شد. مرحله اول PCR، واسرشت ­سازی 94درجه و به مدت 3 ساعت، مرحله دوم اتصال در 60 درجه و به مدت 1 ساعت و مرحله تکثیر در دما 72 درجه و به مدت 2 ساعت به طول انجامید. محصول PCR هر کدام از نمونه­های گیاهی در چاهک­های مشخصی بر روی ژل آگارز، الکتروفورز شد و پس از آن، ژل توسط دستگاه ژل داک^[3] و زیر نور فرابنفش مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به (شکل 1-d) در چاهک اول از سمت راست نمونه گیاه غیرتراریخته (به عنوان کنترل منفی) بارگیری شد و همانطور که انتظار می­رفت هیچ باندی نشان نداد. چاهکهای 2 الی 5 و 7 الی 9 حاوی  DNAتکثیر شده گیاهان مورد آزمون می­باشند. چاهک6 نیز نشانگر وزن مولکولی را داراست که حاوی دی­ان­ای(DNA)ِ لاندای هضم شده با آنزیم­های   EcoRIو  HindIمی­باشد. همچنین پلاسمید استخراج شده از آگروباکتریوم (به عنوان کنترل مثبت) در چاهک 9 بارگذاری شد. در نهایت، باندهای  DNAایجاد شده زیر نور فرابنفش مشاهده و عکسبرداری شد. در نتیجه با توجه به اندازه قطعات تکثیر شده در نمونه­های   DNAاستخراج شده، پنج لاین تراریخته (L1-L5)که باندی هم ردیف با باند حاصل از کنترل مثبت و در حدود 1228 جفت باز (طول CDSژن (AtEXPA18 را نشان دادند، مشخص شدند به این ترتیب تراریختگی پنج لاین از گیاهان توتون در سطح ژنوم تأیید شد و لاین­های تراریخته L2، L4 و L5 برای آنالیزهای بعدی انتخاب شدند. برای اثبات بیشتر تراریختگی cDNA ساخته شد و از لاین های تراریخته و گیاهان غیرتراریخته نمونه­گیری انجام شد و با استفاده از دو پرایمر اختصاصی، PCR انجام شد و محصولات پرایمر در لاین­های تراریخته L2,L4,L5 و پلاسمید به عنوان کنترل مثبت دارای قطعه تکثیری 183 جفت باز مشخص شدند و در گیاهان غیرتراریخته باندی مشاهده نشد (شکل1-e ). به منظور تأیید نتایج PCR و اثبات انتقال ژن به نسل بعدی بذرهای گیاهان تراریخته و غیر­تراریخته در گلخانه جمع‌آوری و پس از ضدعفونی در محیط کشت انتخابی (حاوی کانامایسین) کشت شدند. بذور گیاهان تراریخته به دلیل دارا بودن ژن مقاومت به کانامایسین می­توانند در محیط­کشت حاوی این آنتی­بیوتیک رشد کنند که پس از چهار برگی شدن به رشدشان ادامه دادند اما گیاهان غیرتراریخته و تفرق­یافته زردشده ( یا سفید شده) و از بین‌­رفتند. در این مرحله تعداد بذور جوانه زده و سبز مانده شمارش شد و نسبت جوانه زنی (برای تعیین تعداد درج ژن در ژنوم توتون) محاسبه شد و نسبت 3:1 مشاهده شد (شکل1-f).

- بررسی مورفولوژیک گیاهان کشت شده در گلخانه

بعد از رشد مناسب گیاهان غیرتراریخته و تراریخته در گلخانه به منظور بررسی عملکرد گیاهان، صفاتی مورد سنجش قرار گرفت، در ابتدا وزن بذر داخل کپسول اندازه­گیری شد و مشخص شد که لاین تراریخته L4  دارای بیشترین وزن بذر نسبت به گیاهان غیرتراریخته بوده است و گیاهان غیرتراریخته دارای وزن بذر کمتری بودند. بیشترین اثر ژن در لاین L4 دیده شد و  این اثر به میزان کمی هم در لاین L5 و L2 مشاهده شد (شکل2). افزایش وزن بذر می تواند ناشی از دو عامل افزایش در اندازه بذر (افزایش تقسیم سلول ها و یا افزایش اندازه سلول­های بذر) و یا افزایش تعداد بذر داخل کپسول و یا به دلیل هر دو عامل ایجاد شده باشد. برای بررسی این دو فرضیه و رسیدن به جواب مناسب اندازه گیری صفات دیگری چون وزن کپسول، تعداد کپسول پر، تعداد بذر در کپسول و وزن صد دانه انجام شد.

شکل2- مقایسه صفت وزن کل بذر در گیاهان غیرتراریخته(WT) و گیاهان تراریخته L2, L4, L5)) در شرایط گلخانه

Fig. 2- Comparision of seed weight in the non-transgenic plants (WT) and transgenic plants (L2, L4, L5) in greenhouse conditions

مشخص شد بیشترین تعداد کپسول پر برای گیاهان غیرتراریخته و کمترین تعداد کپسول پر برای گیاهان لاین L4 بوده است (شکل3-a)، لاین­های تراریخته L2 و L5 که دارای وزن بذر کمتر از لاین تراریخته L4 بوده­اند دارای تعداد کپسول پر بیشتری بوده­اند. ولی گیاهان غیرتراریخته با وجود دارا بودن وزن بذر کمتر دارای تعداد کپسول پر بیشتری بوده است. بنابراین می­توان نتیجه گرفت که ژن هیچ اثری روی افزایش تعداد کپسول پر نداشته است. بنابراین، در این لاین­ها یا تعداد بذر داخل کپسول بیشتر است و یا اندازه بذر از بذر سایر لاین ها بزرگتر است. برای مشخص شدن موضوع، وزن کپسول و تعداد بذر در کپسول با استفاده از فرمول‌های زیر بررسی شدند.

تعداد کپسول پر / وزن کل بذر  = وزن کپسول

 وزن صد دانه / 100 × وزن کپسول = تعداد بذر در کپسول

بیشترین میزان وزن کپسول مربوط به لاین تراریخته L4 بود و کمترین میزان وزن کپسول برای گیاهان غیرتراریخته بوده است،  وزن کپسولی لاین­های تراریخته L2 و L5 نیز از گیاهان غیرتراریخته بیشتر بود (شکل3- b). همانطورکه در (شکل3- c) مشخص است، وزن صد دانه گیاهان غیرتراریخته کمترین مقدار و وزن صد دانه لاین تراریخته L4 بیشترین مقدار و دو لاین L2 و L5 حد وسط این دو بوده و با یکدیگر نیزتفاوت معنی­داری داشتند. در نهایت تعداد بذر در کپسول مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد که بیشترین تعداد بذر در کپسول در لاین L4 و کمترین تعداد بذر در کپسول در گیاهان غیرتراریخته بود (شکل3-d). با بررسی­ها مشخص شد که وزن کپسول L5 بیشتر از کپسول گیاهان غیرتراریخته می­باشد بنابراین یکی از دلایل این افزایش وزن می­تواند افزایش تعداد بذر لاین L5 نسبت به گیاهان غیرتراریخته باشد. با این بررسی­ها مشخص شد که وزن کل بذر، وزن کپسول و وزن صد دانه در لاین L4 و بعد از آن در لاین L5 بیشتر از بقیه لاین ها بوده است که این افزایش می­تواند نتیجه افزایش در اندازه بذر باشد و افزایش اندازه بذر یا با افزایش اندازه سلول­ها و یا با افزایش تعداد سلول­ها و یا هر دو ممکن است رخ داده باشد. آزمایشات زیادی وجود یک همبستگی مثبت بین ژن­های اکسپنسین و هورمون­هایی چون اکسین، جیبرلین، سیتوکینین، آبسیزیک اسید و اتیلن را تأیید کرده­اند. این فیتوهورمون­ها با تنظیم میزان بیان ژن­های اکسپنسین فعالیت آنها را تنظیم می­کنند. بر اساس اطلاعات موجود، هورمون‌های اکسین و جیبرلین‌ها به­عنوان تنظیم کننده‌های تقسیم و بسط سلولی شناخته می‌شوند (Davies, 2010)، هورمون اکسین از طریق کاهش pH دیواره سلولی فعالیت اکسپنسین­ها را افزایش می­دهد و به عنوان عامل افزایش طول سلول بیان برخی از ژن­های اکسپنسین را افزایش می­دهد(Cosgrove, 2000b) . بنابراین هورمون­های اکسین و جیبرلین با افزایش تقسیمات سلولی و همچنین تأثیر مثبت بر اکسپنسین­ها و شل شدن پیوند­های موجود در دیواره سلولی سبب افزایش تقسیمات سلولی و افزایش اندازه سلول می­شوند. هورمون های اکسین و جیبرلین نقش مهمی در شروع گلدهی و بذر­دهی پس از لقاح، دارند (Ruan et al., 2012). این دو هورمون در بذرهای نخود فرنگی موجب القای رشد (طولی و وزن تر) پریکارب و در‌نهایت افزایش رشد اندام زایشی می‌شوند (Ozga & Reinecke, 1999) بنابراین افزایش فعالیت هورمون­های اکسین و جیبرلین سبب افزایش اندازه بذر شده و در نتیجه سبب افزایش وزن صد دانه و وزن کپسول­ می­شوند، فعالیت بیشتر این دو هورمون سبب افزایش وزن صد دانه و وزن کپسول در لاین L4 نسبت به گیاهان غیرتراریخته شده است. درگیاه گوجه فرنگی تیمار اکسین موجب افزایش تعداد سلول‌های پریکارب و جیبرلین سبب کاهش تعداد سلول‌های پریکارب ولی افزایش اندازه آن­ها شده است. براساس تحقیق دیگری مشخص شده‌است که جیبرلین‌ها و علاوه بر آن اکسین‌ها نیاز بذر را از نظر حفظ تقسیم و توسعه سلولی خصوصاً در اوایل نمو دانه تأمین می‌کنند و این دو هورمون برای دستیابی به رشد سلولی مناسب تا رشد کامل اندام زایشی مورد نیاز هستند (Ozga et al., 2002).

- بررسی گیاهان رشد یافته در محلول غذایی هوگلند

بعد از حدود 4 هفته رشد مناسب گیاهان در محیط مایع هوگلند، قبل از مرحله گلدهی و در زمان هفت تا هشت برگی بودن، وزن تر اندام هوایی و وزن تر ریشه توسط ترازو حساس و اندازه طول ریشه بوسیله یک خط کش مناسب اندازه گیری شد، سپس اندام هوایی و ریشه گیاهان درون پاکت­های مناسب قرار داده شدند و به مدت 48 ساعت درون آون 70 درجه سانتی گراد قرار گرفته، بعد از این مدت بلافاصله وزن خشک اندام هوایی و وزن خشک ریشه اندازه گیری شدند.

بعد از اندازه گیری وزن تر اندام هوایی لاین های تراریخته و شاهد، مشخص شد که وزن تر اندام هوایی لاین L4 به طور معنی‌داری از بقیه لاین ها بیشتر است ، لاین L2 نیز نسبت به لاین های L5 و WT برتر بود (شکل4-a). وزن خشک اندام هوایی لاین L4 نسبت به سه لاین دیگر به‌طور معنی‌داری بیشتر بود (شکل4-b ). وزن تر ریشه لاین L4 نیز نسبت به بقیه لاین ها بیشتر بود. لاین های تراریخته L2 وL5 نیز وزن تر ریشه بیشتری نسبت به شاهد داشتند. می­توان افزایش وزن تر ریشه لاین های تراریخته را به دلیل بلندتر بودن ریشه نسبت به شاهد و همچنین تولید ریشه های موئین به دلیل عملکرد ژن اکسپنسین در نظر گرفت (شکل4- c). در وزن خشک ریشه لاین ها تفاوت معنی داری با یکدیگر نداشتند.

بعد از اندازه­گیری ارتفاع ریشه مشخص شد که طول ریشه لاین L4 بیشتر از سه لاین دیگر است و ارتفاع ریشه دو لاین دیگر تراریخته L2 و L5 بیشتر از گیاهان غیرتراریخته می باشد (شکل 4- d).

ریشه برای بدست آوردن آب و غذا شکل می­گیرد (Schiefelbein et al., 1997). سیستم ریشه به عنوان یک سیستم برای توسعه شناسایی شده است. ریشه یک اندام ساده است و از تعداد کمی سلول تمایز یافته تشکیل شده است (Aeschbacher et al., 1994). رشد گیاه در نتیجه تقسیم شدن و بزرگ شدن سلول­ها و همراه با افزایش سطح دیواره سلولی اتفاق می افتد (Cosgrove, 1993). اهمیت دیواره سلولی در رشد و توسعه گیاهان نشان می­دهد که رشد و گسترش آنها تحت مقرراتی منظم کنترل می­شود. برخی از موارد سبب تضعیف پیوندهای دیواره سلولی می­شوند. و برخی از موارد هم سبب افزایش سختی پیوندهای دیواره سلولی می­شوند (Cosgrove, 2000b). در اغلب بذرها یا دانه­ها گسترش ریشه­ چه از طریق ساختارهای اطراف جنین صورت می گیرد که این امر خاتمه جوانه­زنی و آغازی برای رشد نهال است (Bewley, 1997a). در دانه جنین در میان آندوسپرم سخت و محکم تعبیه شده است و در آندوسپرم بخش کوچکی به نام کلاه آندوسپرموجود دارد که محل شروع تقسیمات سلولی برای تولید ساقه­ چه است. در ابتدا برای این قسمت محدودیت تقسیم و رشد وجود دارد زیرا ابتدا باید ریشه چه جوانه زده و رشد کند  (Groot et al., 1988). تضعیف کلاه آندوسپرم با هیدرولیز دیواره سلولی در ارتباط است (Watkins et al., 1985). آنزیم endo-β-mannanase برای کنترل روند تضعیف پیوندهای دیواره سلولی در نظرگرفته شده است و افزایش فعالیت این آنزیم سبب ظهور ریشه چه می­شود  (Nonogaki & Morohashi, 1996; Nonogaki et al., 2000). آنزیم endo-β-mannanase برای جوانه زنی ضروری است ولی قطعاً کافی نیست. علاوه بر آنزیم  endo-β-mannanase، آنزیم­های دیگری شامل: مانوزیداز، گالاکتوزیداز، سلولاز، پکتین متیل استراز، پلی گالاکتوروناز، آرابینوزیداز، زایلوگلوکان اندوترانس گلیکوزیلاز، β-1و3- گلوکاناز و کیتیناز در طول جوانه زنی بذر گوجه فرنگی بیان می­شوند (Groot et al., 1988). آنزیم­های هیدرولاز به تنهایی قادر به تضعیف دیواره سلولی و ظهور ریشه چه نیستند و قطعاً وجود فاکتورهای دیگری ضروری است (Bewley, 1997b; Toorop et al., 2000). پروتئین­های اکسپنسین یکی از فاکتورهای لازم برای تضعیف دیواره و جوانه زنی محسوب می­شوند. آنزیم β-گلوکورونیداز بیان ژن اکسپنسین را در زمان جوانه زدن بذر در کلاهک ریشه و مناطقی از ریشه که تفکیک سلول­ها صورت می گیرد سبب می شود (Cosgrove, 1998).  بنابراین می­توان نتیجه گرفت که در گیاهان تراریخته به دلیل داشتن ژن اکسپنسین خود گیاه و همچنین ژن اکسپنسین انتقالی فعالیت این آنزیم ها افزایش پیدا کرده و در نتیجه رشد ریشه و همچنین تشکیل ریشه­های موئین می­تواند افزایش پیدا کند. قابلیت انعطاف پذیری سلول گیاهی به واسطه اسیدی شدن دیواره و فعال شدن بیان پروتئین­های غیر­آنزیمی ویژه ای به نام اکسپنسین­ها تنظیم می­گردد. اکسپنسین­ها اساساً به عنوان عامل اصلی برای طویل شدن سلول محسوب می شوند، درحالیکه دیگر مواد نیز می­توانند ساختار دیواره سلولی را تغییر دهند و با عامل اصلی یعنی اکسپنسین­ها برای بسط دیواره همکاری کنند. در تعریفی دیگر، اکسپنسین­ها پروتئین­های دیواره سلولی هستند که در کل گیاهان روی زمین وجود دارند و توسعه دیواره وابسته به pH یا به عبارتی رشد اسیدی را القا می­کنند. این پروتئین­ها از طریق سست کردن پیوندهای هیدروژنی بین میکروفیبریل­های سلولز و پلیمر ماتریکس باعث تغییر شکل تدریجی دیواره می­شوند  و در نتیجه دیواره شل شده و سلول­ها کشیده می­شوند (McQueen-Mason & Cosgrove 1994, Cosgrove 1999). اکسپنسین­ها پروتئین­های سست­کننده دیواره سلولی و عناصر مهمی در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی گیاهان هستند (Cho & Cosgrove 2002). این پروتئین­ها به عنوان عامل اصلی برای افزایش طول دیواره سلولی درنظرگرفته می­شوند و سایر عوامل به عنوان عامل کمکی برای اکسپنسین­ها محسوب می­شوند .(Vissenberg et al., 2000) در مطالعه دیگری مشخص شد که ریشه­های ذرت در شرایط کم آبی به دلیل افزایش فعالیت اکسپنسین­ها و در نتیجه افزایش توسعه­پذیری دیواره سلولی و افزایش اندازه سلول قادر به ادامه رشد هستند
(Wu et al., 2001). در هیپوکوتیل (ساقه) خیار تعدادی از اکسپنسین­ها مسئول رشد سلول­ها می­باشند (McQueen-Mason, 1995). در برنج­های کشت شده در مناطقی که آب­های زیر زمینی در عمق وجود دارند، افزایش بیان ژن اکسپنسین ارتباط مستقیمی با افزایش رشد میان گره ریشه­ها دارد(Lee & Kende, 2001, 2002) . در شرایط آزمایشگاهی مشخص ­شد که اکسپنسین­ها در رشد سلول­های هیپوکوتیل Arabidopsis thaliana، و ایجاد ریشه موئین خیار نقش دارند (Moore et al., 1995). نتایج نشان داد، بیان اکسپنسین­ها سبب تشکیل ریشه موئین در آرابیدوپسیس شده است.  (Cho & Cosgrove, 2002) همچنین افزایش بیان ژن اکسپنسین A سبب افزایش طول ریشه برنج(Shin et al., 2005) ، ذرت(Kam et al., 2005)  و سویا(Lee et al., 2003)  می­شود. نتایج حاصل از آنالیز لاین­های تراریخته توتون با سازه pBI121:AtEXPA18  مشخص نمود که لاین L4 در اندازه­گیری­های گلخانه و محلول غذایی هوگلند نسبت به تمام لاین­های دیگر بهترین عملکرد را داشته است و می­توان نتیجه گرفت که افزایش بیان ژن اکسپنسین در سلول­ها صورت گرفته که سبب تضعیف پیوندهای هیدروژنی دیواره­های سلولی شده و اندازه سلول­ها افزایش پیدا کرده و در نتیجه طول ریشه لاین­های L4 نیز افزایش پیدا کرده است. در نتیجه با افزایش طول ریشه میزان وزن تر ریشه نیز به دلیل بزرگ تر شدن سلول­ها افزایش می­یابد و میزان وزن خشک ریشه نیز به دلیل طول بیشتر ریشه از سایر لاین­ها بیشتر است. افزایش اندازه سلول­ها در اندام­های هوایی نیز دیده شده است و در نتیجه مشاهده شده است که لاین L4 نیز به دلیل بزرگ شدن سلول­ها و جذب آب بیشتر، دارای بیشترین وزن تر و وزن خشک اندام هوایی نسبت به سایر لاین­ها می­باشد.