آرمیون, محمد, بی همتا, محمدرضا, معالی امیری, رضا, خدارحمی, منوچهر, ایسوبه, ساچیکو. (1399). کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq. , 51(3), 103-114. doi: 10.22059/ijfcs.2019.277138.654586
محمد آرمیون; محمدرضا بی همتا; رضا معالی امیری; منوچهر خدارحمی; ساچیکو ایسوبه. "کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq". , 51, 3, 1399, 103-114. doi: 10.22059/ijfcs.2019.277138.654586
آرمیون, محمد, بی همتا, محمدرضا, معالی امیری, رضا, خدارحمی, منوچهر, ایسوبه, ساچیکو. (1399). 'کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq', , 51(3), pp. 103-114. doi: 10.22059/ijfcs.2019.277138.654586
آرمیون, محمد, بی همتا, محمدرضا, معالی امیری, رضا, خدارحمی, منوچهر, ایسوبه, ساچیکو. کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq. , 1399; 51(3): 103-114. doi: 10.22059/ijfcs.2019.277138.654586
کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq
1مرکز تحقیقات کشاورزی و آموزش و منابع طبیعی استان ایلام ، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، ایلام، ایران
2استاد گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده علوم و مهندس کشاورزی دانشگاه تهران
3دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده علوم و مهندس کشاورزی دانشگاه تهران
4استادیار موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
5رئیس آزمایشگاه ژنومیکس و ژنتیک کاربردی گیاهی موسسه تحقیقات DNA کازوسا ژاپن
چکیده
به‌منظور کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان، از روش ddRAD-Seq استفاده شد. DNAاز برگ گیاهچه استخراج شد و پس از تهیه کتابخانه، از پلاتفرم NextSeq TM 500 Illumina ® برای توالییابی استفاده شد. متوسط نمره کیفیت فرد (Phred) برای تمام افراد برابر30 بود. از مجموع 178811846 خوانش توالی قرائت شده، 150108678 خوانش صحیح و به‌طور متوسط به ازای هر لاین، 2207480 خوانش تولید شد. بالاترین نرخ همردیفی، مربوط به ژنوم B و کمترین، مربوط به ژنوم D بود. با توجه به شرایط فیلتر، (DP≥5)، (Quality score=≥999)، (MAF>5%) و (Het<10%)، تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گمشده برابر با 3342 عدد، که تعداد 1322 روی ژنوم B، 1253 روی ژنوم A و 767 روی ژنوم D و بیشترین SNP روی کروموزوم دوم و سوم از ژنوم B و کمترین آن روی کروموزوم چهارم از ژنوم D شناسائی شد. بیشترین چگالی نشانگری، روی کروموزومهای دوم و پنجم ژنوم B و کمترین، روی کروموزوم چهارم از ژنوم D مشاهده شد. بین چگالی نشانگری و اندازه کروموزوم در سه ژنوم، رابطه خطی بسیار معنیداری مشاهده شد. تجزیه به مولفههای اصلی و ماتریس تشابه و گروهبندی همزمان با استفاده از اطلاعات نشانگر SNP، قادر به شناسائی و تفکیک زیر جمعیتها از یک جمعیت اصلی شد.
1ILam Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ilam, IRAN
2Professor in plant breeding, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Tehran, Karaj, Iran
3Associate Professor in biotechnology, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Tehran, Karaj, Iran
4Assistant Professor in plant breeding, Seed and Plant Improvement Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization, (AREEO), Karaj, Iran
5Senior Scientist, Department of Applied Plant Genomics and Genetics, Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan
چکیده [English]
The aim of this study was todiscover, genotyping and determining the genotype, the number, distribution and density of SNP markers and grouping of an advanced breeding population using the ddRAD-Seqmethod. DNA was extracted from 14-old-day seedlings and the NextSeq TM 500 Illumina ® platform was used for sequencing. The average quality score for all individual was Phred’s 30. The correct reads were 150108678 out of 178811846 and the average of 2207480 reads produced by individual. The highest and the lowest alignment rate were related to B and D genomes, respectively. Based on the filter conditions, (DP≥5), quality score=≥999, MAF>5% and Het<10%, the total number of SNP calling for 50% missing data were 3342 which identified 1322, 1253, and 767 on B, A and D genomes, respectively. The highest SNP markers were identified on 2B and 3B and the lowest on 4D chromosomes. A significant linear regression was observed between marker density (SNP/Mbp) and chromosome size in three genomes. The principal components analysis and the heatmap dendrogram together with the use of SNP marker information were able to identify and segregate sub-populations from a main population.
گندم یک محصول زراعی مهم، اصلی و عمده است که در بیشتر قسمتهای جهان رشد میکند (Kristensen et al, 2018). دو حالت اصلی از آلوپلیپوئیدی گندم یعنی هگزاپلوئید (Triticum aestivum ssp. aestivum) با اندازه ژنوم حدود Gb 17 و تتراپلوئید (Triticum turgidum ssp. durum) با اندازه ژنوم Gb 12 وجود دارد (Borrill et al., 2015). بیش از 95 الی 99 درصد از نواحی کدکننده در کروموزومهای همیولوگهای گندم مشابه هستند (Krasileva et al., 2013). اندازه عظیم ژنوم گندم، درجه شباهت زیاد توالیها و محتوای DNA تکراری آن، مانع جدی در تولید نسخه اولیه توالی ژنوم گندم بود. در نتیجه پژوهشگران در ابتدا روی توالیهای کد کننده (CDS) و مجموعههای بزرگ توالیهای نشانمند ترجمه شده (ESTs) فعالیت نمودند و یک نقشه مونتاج شده از این توالیها تولید کردند. از طرفی، ظهور فنآوری NGS رویکرد جدیدی برای غلبه بر مشکلات توالییابی ژنوم گندم فراهم نمود. فنآوری نسل جدید دوم و سوم NGS، باعث دگرگونی اساسی در آنالیز ژنوم و دررنتیجه افزایش فهم ما از رابطه ژنوتیپ - فنوتیپ شده است (Mochida et al., 2009). توالییابی DNA یک فرآیند دقیق است که ترتیب صحیح نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA را تعیین میکند (El-Metwally et al., 2014). ظهور فنآوریهای توالییابی، نقش مهمی در تجزیه و تحلیل توالیهای ژنومی ارگانیسمها بازی کرده است (Shendure & Ji, 2018 ). اولین فنآوری توالییابی در سال 1977 به‌وسیله Sanger و Maxam - Gilbert ایجاد شد. فنآورهای نسل جدید تحت عنوان فنآوری توالییابی NGS یا فنآوری های توالییابیخودکار با مقیاس بالا، در سال 2005 با فن آوری Roche’s 454 معرفی شدند. فنآورهای NGS آنالیز حجیم موازی بصورت خودکار از چندین نمونه با هزینه خیلی کم تولید میکنند و قادر به توالییابی میلیونها تا میلیاردها خوانش به‌صورت موازی و همزمان در یک مرحله اجرا هستند و زمان مورد نیاز برای تولید خوانش‌های با اندازه گیگابایت اطلاعات، تنها چند روز یا ساعت است (Mardis, 2011). در زمینه تحقیقات گیاهی، فنآوریهای NGS یکی از ابزارهای مهم برای تشکیل اسمبلی ژنومهای مرجع گیاهان زراعی، توالییابی ترانسکریپتوم برای تحقیقات بیان ژن، توسعه نشانگرهای مولکولی در سطح ژنوم و شناسائی نشانگرها در ژنهای با عملکرد معین شد (Vlk & Repkova, 2016). پلاتفرم Roche/454 در سال 2005، Illumina/Solexa در سال 2006 و ABI/SOLiD در سال 2007 ایجاد شدهاند (Kchouk et al., 2017). اولین توالی گندم با استفاده از فن آوری 454 و بر اساس توالییابی شاتگان (WGS) یا شکستن کل ژنوم در سال 2012 منتشر شد (Brenchley et al., 2012). تولید توالیهای مرجع CSS (IWGSC, 2014) با ابعاد نقشه 10.2 Gb و W7984 (Chapman et al., 2015) با 9.1 Gb اولین قدم مهم نسبت به کشف تنوع در بین گونههای گندم بود (Borrill et al., 2015). آخرین ژنوم مرجع معرفی شده از سوی کنسورتیوم بین المللی توالییابی گندم به نام IWGSC RefSeq v1.0 reference با اندازه نقشه 14.5 Gb و عمق 94 درصد بود که از داده های POPSEQ و نقشه HiC برای تهیه آن استفاده شده است (IWGSC, 2018). از طرفی، اندازه بزرگ و پیچیدگی ژنوم گندم، امکان توالییابی مجدد کل ژنوم واریته گندم جدید با توجه به فنآوریهای جاری، از نظر اقتصادی میسر نیست. بنابراین، روشهای کاهش اندازه ژنوم برای دسترسی به تنوع درون گونهها که تقریبا بر SNP ها متمرکز شده به‌طور گسترده در گندم استفاده شده است (Borrill et al., 2015). دو رویکردGBS (Poland & Rife, 2012) و ddRAD (Shirasawa et al., 2016) برای کشف و ژنوتیپسنجی همزمان SNP با استفاده از آنزیمهای برشی و کاهش اندازه ژنوم بوجود آمده است (Vlk & Repkova, 2016). ژنوتیپسنجی SNP بوسیله NGS به صورت GBS ، RAD-Seq و ddRAD-Seq به خاطر انعطاف پذیری و هزینه پایین متداول شدهاند (Shirasawa et al., 2016). روشهایGBS و RAD-Seq تولید خوانش از یک انتها (single-end) نموده، در صورتیکه روش ddRAD-Seq تولید خوانش از دو انتها (paired-end) مینماید، و در نقشهیابی خوانش‌ها نسبت به ژنوم مرجع به ویژه درگیاهان که اغلب دارای ژنوم پلیپلوئیدی بزرگ و پیچیده بوده، صحیحتر است. در روش ddRAD-Seq از دو آنزیم برشی، که آنزیم دوم به منظور کاهش هزینه و زمان آماده سازی کتابخانه و توالییابی دو طرفه از ژنهای همسان برای تمام نمونهها، استفاده میشود. بنابراین از نقطه نظر صحت بالاتر در نقشهیابی خوانش‌ها، حتی در ژنومهای گیاهی پیچیده، فنآوری ddRAD-Seq سودمندی آن نسبت به GBS و RAD-Seq مناسبتر است (Shirasawa et al., 2016). روش ddRAD-Seq به‌وسیله Shirasawa et al. (2016) در گوجه فرنگی بررسی و شیوه تحلیل دادههای تجربی و in silico را معرفی کردند. Arafa et al. (2017) از روش ddRAD-Seq برای شناسائی ژنهای کاندید مقاومت به بیماری بادزدگی در جمعیت نسل دوم گوجه فرنگی استفاده نمودند. DaCosta & Sorenson (2016) نتیجه گرفتند که روش ddRAD-Seq یک روش مقرون به صرفه برای تولید دادههای فیلوژنی قوی، به‌ویژه برای تجزیه و تحلیل گونه و جنس نزدیک، است. تنوع ژنتیکی کلید اصلی برای موفقیت در بهنژادی و مبنای اساسی برای بهنژادگران برای انتخاب مداوم ارقام با عملکرد اصلاح شده است. از طرفی انتخاب شدید در دوره اهلیسازی و بهنژادی، باعث حذف تنوع ژنتیکی قابل ملاحضهای در خزانههای اصلاحی گیاهان اصلی شده است و فرسایش پتانسیل ژنتیکی برای سازگاری در برابر تغییرات مانند آب و هوا را در پی داشته است. فناوریهای با توان بالا ژنومی، از طریق ارائه دانش دقیق نسبت به توصیف و پرکردن تنوع ژنتیکی در برنامههای بهنژادی، قادر به حل این معضل هستند. اطلاع از گروهبندی جمعیت و روابط ژنتیکی مبنائی برای ایجاد گروههای هتروزیس غیر متقارب برای افزایش میزان هتروزیس در رویکردهای بهنژادی گندم هیبرید مهم است (Melchinger, 1999). از طرفی، مبادله شدید واریتههای الیت درون برنامههای بهنژادی گندم که به‌طور سنتی روی راهبردهای اینبریدینگ به جای تشکیل خزانه هیبرید تکیه کرده‌اند، باعث کاهش شدید تمایز بین مواد الیت شده است (Voss-Fels et al., 2015). Wang et al (2017)، در بررسی یک پنل 105 عددی از واریتههای گندم و لاینهای پیشرفته با استفاده از آرایه K90، چهار زیر جمعیت براساس هشت مولفه اصلی PC و آنالیز شباهت ژنتیکی به‌وسیله نشانگر SNP با روش هیتمپ، گروهبندی نمودند. بنابراین هدف این تحقیق، تعیین ژنوتیپ، تعداد، پراکنش و چگالی نشانگر SNP و گروهبندی و تفکیک زیر جمعیتها بر اساس فاصله ژنتیکی نشانگر SNP برای یک جمعیت پیشرفته اصلاحی است.
مواد و روشها
مواد ژنتیکی
در این پژوهش، از 50 ژنوتیپ و رقم زراعی حاصل از انتخاب لاینهای برتر از یک آزمایش مشترک مقدماتی تحت عنوان PRBWYT از ایستگاههای گرگان، گنبد، ساری و مغان برای اقلیم گرم و مرطوب شمال موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال، استفاده شده است (جدول 1 ضمیمه).
استخراج، تعیین سلامت و رقیق سازی DNA
به‌منظور استخراج DNA، از بافت برگ گیاهچههای با سن چهارده روز نمونهبرداری شد و نمونهها سریعا به آزمایشگاه موسسه تحقیقات DNA کازوسا (www.kazusa.or.jp/en/) انتقال یافتند و در فریزر 80- درجه ذخیره شدند. از دستگاه Tissuelyser II (Qiagen Inc., Hilden, Germany) برای آسیاب و از پروتکل شرکت کیاژن (The DNeasy Plant Mini kit) برای استخراج DNA نمونههااستفاده شد. غلظت اولیه DNAبا دستگاه Nano drop ND-1000 تعیین شد. برای تعیین سلامت DNA از ژل آگارز 7/0 درصد، بافر 1X BPB و دو نشانگر لاندا (λ) یک باندی و |HinIII λ چند باندی استفاده شد (Liljeroth & Bryngelsson, 2002). کمیت دقیقتر DNAبه‌وسیله کیتهای Qubit® dsDNA BR Assay Kits (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA ) و با دستگاهQubit® 30 Fluorometer تعیین شد (شکل 1).
شکل 1- تعیین سلامت DNA استخراج شده نمونهها.
Figure1. Health determination of DNA extracted from samples.
پروتکل ddRAD-Seq
پس از استخراج DNA ژنومیک با کیفیت مناسب و برای کاهش اندازه و برش ژنوم، از دو آنزیم برشی FastDiges PstI و FastDiges MspI و بافر 10X FastDigest Buffer استفاده شد (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) و پلیت DNA ژنومیک به مدت دو دقیقه با سرعت rpm 100 × 100 سانتریفیوژ و در زمان 16 ساعت با دمای 37 درجه سانتیگراد در دستگاه PCR انکوبات شد. پس از مرحله هضم، آداپتورهای ,RAD-ad1-PstI Adaptor(50μm) RAD-ad2-PstI Adaptor(50μm)، RAD-ad1-MspI Adaptor(50μm) وRAD-ad2-MspI Adaptor(50 μm)، آنزیمهای FastDiges PstI و FastDiges MspI، آنزیم T4 DNA ligase (Promega, Madison, WI, USA) و بافر 2x Rapid ligation buffer به DNA ژنومیک اضافه، و سپس پلیت نمونهها در دستگاه PCR برای شرایط 16 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه و 37 درجه به مدت 10 دقیقه و برای 25 سیکل انکوبات شد. برای حذف قطعات با طول کمتر از bp 350 از محلول گویهای مغناطیسی AMPure beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) استفاده شد. پس از رقیق سازی DNA ژنومیک به نسبت یک به 100 و قبل از تشکیل کتابخانه مشترک، اندیکس Read1_N5**/Read2_N7**(0.5uM) و مخلوط ترکیبات 10x KOD buf -plus-، dNTP، MgSO4،KOD –plus– ver.2 (Toyobo, Osaka, Japan) اضافه شد. برنامه ddRAD-Seq برای دستگاه PCR و تکثیر قطعات به صورت؛ آغاز عمل واسرشت‌سازی در دمای °C 95 به مدت سه دقیقه، 20 سیکل بصورت عمل واسرشت: دمای °C 94 در 30 ثانیه، اتصال: دمای °C 55 در 30 ثانیه، تکثیر: دمای °C 72 در یک دقیقه و سه دقیقه انتهایی بعد از اتمام دوره سیکل عمل تکثیر در دمای °C 72 ، انتخاب شد. برای تعیین غلظت DNA ژنومیک از بافر (Qubit® dsDNA HR Buffer) و محلول واکنشگر (Qubit® dsDNA HS Reagent) با حساسیت بالا و دو استاندارد یک (Qubit™ ds DNA HS) و دو (Qubit™ ds DNA HS) استفاده شد. پس از PCR، از هر نمونه حدود چهار میکرولیتر برداشته و در هشت تا نه میکروسانتریفیوژ 200 میکرولیتر جمعآوری شد و سپس همه مقادیر در یک میکروسانتریفیوژ 5/1 میلیلیتری جمع شدند و کتابخانه (Pooling) تشکیل شد که به‌وسیله دستگاه کیوبیت، غلظت آن سنجیده شد. با استفاده از دستگاه BluePippin قطعاتDNA ژنومیک در رنج 500~800bp انتخاب و خالصسازی شدند و کتابخانه آزمایشگاهی برای انجام توالییابی آماده شد. تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومیک کتابخانه به‌وسیله دستگاههای Qubit (ds DNA HS) و Tape Station Hs D1000 صورت گرفت. برای تعیین غلظت دقیق DNA ژنومیک برحسب پیکومولار، از کیتKapa Library Quantification Kit(KAPA Kit) استفاده و غلظت با دستگاه 7900HT Fast Real-Time PCR system شرکت Life Technologies تعیین شد. پس از تصحیح رقت کتابخانه به یک nM، عمل واسرشت و رقیق سازی بوسیله محلول 0.2N NaOH، بافر HT1 و PhiX control انجام گرفت. عملیات بارگذاری کتابخانه در کاتریج واکنشگر آماده سازی و با دستگاه500 Sequencer NextSeq TMتوالییابی انجام گرفت.
فرآیند محاسبات روش ddRAD-Seq تجربی
پس از خاتمه عمل توالییابی کتابخانه، اطلاعات در قالب فایل qseq file format(qSEQ) آماده و ارائه شد و بر حسب نوع فنآوری هر دستگاه، یک فایل تعیین کیفیت توالی به نام fastQC تهیه شد که معمولا بر مبنای نمره فرد (Phred) تولید میشود. نمره کیفیت فرد شاخصی است که کیفیت شناسائی بازهای نوکلئوتیدی که به‌وسیله سکونسرها به صورت خودکار تولید شده است را بررسی میکند. پس از این مرحله، برای استخراج توالیهای صحیح، از پاپلاینهای بیوانفورماتیک استفاد شد (Shirasawa et al., 2016). ابتدا توالیهای با کیفیت پایین (خوانش یا رید) به‌وسیله نرم افزار PRINSEQ و سپس آداپتورها به‌وسیله fastx_clipper حذف شدند. پس از آن، خوانش‌های فیلتر شده نسبت به توالیهای مرجع از جمله IWGSC RefSeq v1.0 ، CSS، W7984 و IWGSC-WGA v0.4 (IWGSC, 2018) با استفاده از نرم افزار bowtie2 نقشهیابی شدند. فایل فرمت نتیجه همردیف/ نقشه SAM (Sequence Alignment Map) به فایل فرمت همردیف/ نقشه باینری تبدیل شد و سپس برای قرائت SNP استفاده شد و در نهایت، فایل VCF (variant call format) تولید شد. برای مشاهده موقعیت توالیهای SNP برای هر ژنوم و کروموزوم و تعداد آن‌ها، از نرمافزار TASSEL ورژن 5.2.33 (Bradbury et al., 2007)، استفاده شد. روش تجزیه به مولفههای اصلی (PCA) بر اساس روش گروه بندی k – means و مقادیر حساب شده بر اساس فاصله تعدیل شده Roger (MRD) برای 3342 نشانگر پلیمرفیسم SNP و 50 لاین و رقم زراعی اجرا شد. هیتمپ خویشاوندی بین 50 لاین که در آن دندروگرمها با استفاده از روش میانگین جفتی عدم وزنی (UPGMA) بر حسب فاصله اقلیدسی برای 3342 نشانگرها پلیمرفیسم SNP ترسیم شد و درجه ارتباط به‌وسیله رنگ (قرمز = ارتباط قوی) نشان داده شد. برای اجرای PCA از دستورات k-means)) و هیتمپ؛ heatmap)) در محیط نرمافزار R ورژن 3.3.2 R Core Team, 2016) ) استفاده شده است.
نتایج و بحث
کیفیت باندی حاصل از ازوش استخراج شرکت کیاژن مناسب بود (شکل1). این قدم اولیه در تهیه کتابخانه مناسب و تامین شرایط برای توالییابی پلاتفرم Illumina® است (Karaaslan et al., 2014). طول خوانش‌های تولید شده از پروتکل ddRAD-Seq معادل bp 93 که پس از پیراش به bp 76 رسید. متوسط نمره کیفیت توالییابی برای هر دو طرف (Paired-end) برای کتابخانه 30 فرد بود (شکل 2).
از مجموع 178811846 خوانش توالی قرائت شده، 150108678 خوانش صحیح یعنی معادل 84 درصد و به‌طور متوسط به ازای هر لاین 2207480 خوانش تولید شد. لاین C13 با 1109856 خوانش، کمترین و C40 با 2673418 خوانش، بیشترین توالی صحیح تولید نمودند (جدول 1). با توجه به نرخ همردیفی و کیفیت نقشه، تعداد خوانش‌های صحیح نقشهیابی شده به ازای هر ژنوم در توالیهای مرجع IWGSC Ref Seq v1.0، CSS، W7984 و IWGSC-WGAV0.4 متفاوت، که توالی مرجع IWGSC Ref Seq v1.0 نسبت به بقیه مطلوبتر بود (دادهها منتشر نشده است). در نقشهیابی خوانش‌های صحیح نسبت به ژنوم رفرنس IWGSC RefSeq v1.0 گندم، بالاترین نرخ همردیفی مربوط به ژنوم B و کمترین مربوط به ژنوم D بود. این یافتهها نشان میدهد که تعداد خوانش‌های صحیح در روش ddRAD-Seq به علت قرائت از دو انتها (paired-end) بیش از دو برابر نسبت به روش GBS گزارش شده توسط Alipour et al. (2017) بود. در فیلتر اولیه با عمق توالی مساوی و بیشتر از پنج (DP≥5) و نمره کیفیت مساوی و بیشتر از 999 (Quality score=≥999) برای حذف چند آللی و نواحی حذف و اضافه (Indels)، تعداد 1032760 نشانگر SNP قرائت شد. با انجام فیلتر دوم برای فراوانی آللهای نادر کمتر از پنج درصد (MAF>5%) و میزان هتروزیگوت بالاتر از 10 درصد (Het<10%) برای دادههای گمشده 20 %، 30 %، 40 % و 50 % انجام شد. که بیشترین SNP قرائت شده برای دادههای 50 درصد گمشده بدست آمد (جدول 2). تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گمشده برابر با 3342 عدد، که تعداد 1322 معادل 56/39 درصد روی ژنوم B، 1253 معادل 49/37 درصد روی ژنوم A و 767 معادل 95/22 درصد روی ژنوم D شناسائی شد (شکل 3). این یافته ها با نتایج قبلی مشابه بود (; ؛ Berkman et al., 2013; Lai et al., 2015; Alipour et al., 2017). همچنین تعداد نشانگر SNP در ژنوم A و B حدود 4/3 برابر ژنوم D بود که با یافته Alipour et al. (2017) مطابقت داشت، اما با نتایج تحقیق Cavanagh et al. (2013) وAllen et al. (2013) که بیش از پنج برابر گزارش نمودهاند، تفاوت داشت.
شکل 2- میانگین نمره کیفیت فرد کتابخانه.
Figure2. The average of Pherd's score of the pooling.
جدول 1- تعداد خوانش‌های قرائت شده
Table 1. The number of reads calling
Read1
Read2
Total
Total correct sequences
75054339
75054339
150108678
Total wrong sequences
14351584
14351584
28703168
Total
89405923
89405923
178811846
بر اساس تاریخچه تکاملی گندم، ژنوم D پس از سالهای طولانی به ژنوم گندم نان اضافه شده است و بنابراین میزان موتاسیون، مضاعفشدن ژن و چند شکلی در ژنومهای قدیمی یعنی A و B که در اولین رویداد هیبریداسیون حدود نیم الی 3 میلیون سال پیش بین گونههای اجدادی دیپلوئید حاصل شده بود، بیشتر است (Alipour et al., 2017). پراکنش توزیع ژنجای SNPها در روی کرموزوم ژنومها یکنواخت نبود. بیشترین SNP روی کروموزوم دوم از ژنوم B (2B) و سوم از ژنوم B (3B) و کمترین آن روی کروموزوم چهارم از ژنوم D (4D) شناسائی شد (شکل 4). این دستاورد با یافتههای Alipour et al. (2017) و Edae et al. (2015) مشابه بود. بنابراین منطقی است که با افزایش اندازه کروموزوم و توالی بازهای نوکلئوتیدی روی آن، احتمال موتاسیون و تولید SNP جدید، روی دو ژنوم A و B زیاد شود.
جدول 2- مقایسه و پراکنش نشانگر SNP تولید شده بر اساس دادههای گم شده 20، 30، 40 و 50 درصد در سطح ژنوم و کروموزوم
Table 2. The SNP markers Comparison and distribution based on 20, 30, 40, and 50% missing data on genome and chromosome
Allele
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A
Genome
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B
Genome
Missing
data
20%
14
25
18
23
17
11
14
122
19
33
26
11
39
26
21
175
30%
38
47
33
49
37
31
41
276
43
55
49
22
67
46
35
317
40%
75
97
73
90
82
70
81
568
100
109
111
46
125
110
69
670
50%
157
203
163
209
175
146
200
1253
167
255
237
110
227
179
147
1322
Allele
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D
Genome
Missing
data
20%
16
49
19
6
18
8
31
147
30%
21
64
28
14
30
17
41
215
40%
51
103
43
22
46
45
82
392
50%
103
191
100
49
102
90
132
767
شکل 3- میزان پراکنش SNP در ژنوم های A، B و D در 50 درصد داده گم شده.
Figure3. The SNP markers distribution on A, B and D genomes in 50% missing data.
شکل 4. میزان پراکنش SNP بر روی هر یک از کروموزومهای همیولوگ
Figure 4. The SNP markers distribution on homoeologue chromosomes.
بیشترین چگالی نشانگری روی کروموزومهای دوم و پنجم ژنوم B (2B و 5B) و کمترین روی کروموزوم چهارم از ژنوم D (4D) مشاهده شد. همچنین این چگالی در ژنوم B بسیار بیشتر از ژنوم D بود (جدول 3). برونداد این تحقیق با نتایج Alipour et al. (2017) همسان بود. با حذف تاثیر اندازه کروموزوم بر تعداد SNP، در حقیقت علاوه بر اندازه کروموزوم، عوامل دیگری مانند طول دوره تکامل نیز در تعدادSNP روی کروموزوم‌ها دخالت دارند. رابطه خطی بسیار معنیدار بین چگالی (تراکم) نشانگری و اندازه کروموزوم در سه ژنوم مشاهد شد (شکل 5). این به این معناست که با افزایش اندازه و تراکم نشانگری، تعداد نشانگر SNP افزایش مییابد که این مشاهدات با اطلاعات Alipour et al. (2017) یکسان بود.
جدول 3- میزان چگالی نشانگری (SNP/Mbp) روی هر ژنوم و کروموزوم با دادههای 50 درصد گم شده
Table 3. Marker density (SNP / Mbp) on each genome and chromosome with 50% missing data
Allele
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A
Genome
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B
Genome
Chromosome
length (Mbp)
594
781
751
745
710
618
737
4935
690
801
831
674
713
721
751
5180
No. SNP
157
203
163
209
175
146
200
1253
167
255
237
110
227
179
147
1322
Density
(SNP/Mbp)
0.26
0.26
0.22
0.28
0.25
0.24
0.27
0.25
0.24
0.32
0.29
0.16
0.32
0.25
0.20
0.26
Allele
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D
Genome
Chromosome length
(Mbp)
495
652
616
510
566
474
639
3951
No. SNP
103
191
100
49
102
90
132
767
Density
(SNP/Mbp)
0.21
0.29
0.16
0.10
0.18
0.19
0.21
0.19
شکل 5- رابطه خطی بین میزان چگالی (SNP/Mbp) و اندازه کروموزوم هر یک از ژنومهای A، B و D
Graph 5. The linear regression between marker density (SNP/Mbp) and chromosome size in each of A, B, and D wheat genomes.
تجزیه به مولفههای اصلی نشان داد که بر حسب تعداد و رنگهای متفاوت، پنج گروه مختلف بر اساس شش مولفه اول (PC1-PC6) قابل شناسائی است که سهم هر مولفه از تغییرات واریانس کل در اسکری پلات به صورت هیستوگرام نمایان است. بر اساس این یافته، پنج زیر جمعیت به‌صورت SP1 (n=2)، SP2 (n=9)، SP3 (n=8)، SP4 (n=16) و SP5 (n=15) قابل شناسائی بود (شکل6). این برونداد مطابق با یافتههای Voss-Fels و همکاران (2015) که از 460 ژنوتیپ و آرایه K90 نشانگر SNP برای گروهبندی جمعیت استفاده کردند، بود.
علاوه بر آن، نمودار هیتمپ همزمان بر اساس ماتریس فاصله ژنتیکی نشانگر SNP و گروه بندی لاین/رقم صورت گرفت که ارتباطی قوی بین ژنوتیپها برای هر کلاستر جداگانه آشکار کرد، اما تمایز شدید برای گروهبندی منفرد و متمایز نشان نداد (شکل7). این دستاورد با یافته Wang et al. (2017) مطابقت داشت. گروه بندی بر اساس تجزیه مولفههای اصلی و ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ژنومیک یعنی SNP، صحت تفکیک زیر جمعیت را تایید میکنند، اما همان‌طور که ملاحضه میشود، با مقایسه گروه بندی بر اساس تجزیه به مولفهها و ماتریس شباهت ژنومی، جمعیت به سه گروه اصلی قابل تفکیک است.
شکل 6- گروهبندی جامعه پیشرفته اصلاحی بر اساس نشانگر SNP.
Figure 6. The advanced breeding population classification based on SNP markers.
شکل 7- توپولوژی حاصل از ماتریس شباهت بر اساس نشانگر SNP و گروهبندی لاینها.
Figure 7. Topology derived from a similarity matrix based on the SNP markers and lines grouping.
نتیجه گیری کلی
متوسط نمره کیفیت فرد برابر با 30 بود که نشان دهنده مناسب بودن استفاده از فن آوری NGS با پلاتفرم Illumina®برای توالییابی گندم است. تعداد خوانش‌های تولید شده در روش ddRAD-Seq به ازای هر لاین برابر با 2207480 بود که 8/1 برابر روش GBS که توسط Alipour et al. (2017) در جمعیت بسیار بزرگ گندم و هشت بار توالییابی بود. بیشترین SNP قرائت شده برای دادههای 50 درصد گمشده به‌دست آمد. تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گمشده برابر با 3342 عدد SNP بود که بیشترین آن در ژنوم B شناسائی شد. هم میزان پراکنش و هم تراکم SNP به ازای هر کروموزوم در ژنوم متفاوت بود. بین چگالی و اندازه کروموزوم رابطه خطی معنیدار مشاهده شد. تجزیه به مولفههای اصلی و ماتریس تشابه و گروهبندی همزمان با استفاده از اطلاعات نشانگر SNP، قادر به شناسائی زیر جمعیتها از یک جمعیت اصلی شد، اما ساختار جمعیت بسیار ضعیف بود و بنابراین تاثیری در برآورد ارزشهای اصلاحی ژنومی (GS) از طریق برازش مدلها و انتخاب بهترین لاین و مطالعات ارتباط نشانگر به صفت (MTA) و استفاده در MAS در برنامههای بهنژادی برای این جمعیت ندارد.
REFERENCES
Alipour, H., Bihamta, M. R., Mohammadi, V., Peyghambari, S. A., Bai, G. & Zhang G. (2017). Genotyping-by-Sequencing (GBS) Revealed molecular genetic diversity of Iranian wheat landraces and cultivars. Frontiers in Plant Science, 8, 1-14.
Allen, A. M., Barker, G. L., Wilkinson, P., Burridge, A., Winfield, M., Coghill, J., Uauy, C., Griffiths, S., Jack, P., Berry, S. & Werner, P. (2013). Discovery and development of exome‐based, co‐dominant single nucleotide polymorphism markers in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.). Plant Biotechnology Journal, 11(3), 279-295.
Arafa, R. A., Rakha, M. T. Soliman, N. E. K. Moussa, O. M. Kamel, S. M. & Shirasawa, K. (2017). Rapid identification of candidate genes for resistance to tomato late blight disease using next-generation sequencing technologies. PLoS ONE, 12(12), 1-15.
Berkman, P. J., Visendi, P., Lee, H. C., Stiller, J., Manoli, S., Lorenc, M. T., Lai, K., Batley, J., Fleury, D., Šimková, H. & Kubalakova, M. (2013). Dispersion and domestication shaped the genome of bread wheat. Plant biotechnology journal, 11(5), 564-571.
Borrill, P., Adamski, N. & Uauy, C. (2015). Genomics as the key to unlocking the polyploidy potential of wheat. New Phytologist, 2008, 1008-1022.
Bradbury, P. J., Zhang, Z., Kroon, D. E., Casstevens, T. M., Ramdoss, Y. & Buckler, E. S. (2007). TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples. Bioinformatics, 23(19), 2633-2635.
Brenchley, R., Spannagl, M., Pfeifer, M., Barker, G., D’Amore, R., Allen, A. M., McKenzie, N., Kramer, M., Kerhornou, A. & Bolser, D. (2012). Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing. Nature, 491, 705– 710.
Cavanagh, C. R., Chao, S., Wang, S., Huang, B. E., Stephen, S., Kiani, S., Forrest, K., Saintenac, C., Brown-Guedira, G. L., Akhunova, A. & See, D. (2013). Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars. Proceedings of the national academy of sciences, 110(20), 8057-8062.
Chapman, J. A., Mascher, M., Buluc, A., Barry, K., Georganas, E. and Session, A. (2015). A whole-genome shotgun approach for assembling and anchoring the hexaploid bread wheat genome. Genome Biology, 16, 26.
DaCosta, J. M. & Sorenson, M. D. (2014) Amplification Biases and Consistent Recovery of Loci in a Double-Digest RAD-seq Protocol. PLoS ONE, 9(9), 1-14.
Edae, E. A., Bowden, R. L. & Poland, J. (2015). Application of Population Sequencing (POPSEQ) for Ordering and Imputing Genotyping-by-Sequencing Markers in Hexaploid Wheat. G3: Genes, Genomes, Genetics, 5(12), 2547-2553.
El-Metwally, S., Ouda, M. O., & Helmy, M. (2014). Next Generation Sequencing Technologies and Challenges in Sequence Assembly. Springer Science.
International Wheat Genome Sequencing C. (2014). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L.) genome. Science, 345, 6194.
Kchouk, M., Gibrat, J. F. & Elloumi, M. (2017). Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation. Biology and Medicine ,(Aligarh), 9(3), 1-8.
Krasileva, K., Buffalo, V., Bailey, P., Pearce, S., Ayling, S., Tabbita, F., Soria, M., Wang, S., Consortium, I. & Akhunov, E. (2013). Separating homeologs by phasing in the tetraploid wheat transcriptome. Genome Biology, 14(6), R66.
Kristensen, P. S., Jahoor, A., Andersen, J. R., Cericola, F., Orabi, J., Janss, L. L. & Jensen, J. (2018). Genome-Wide association studies and comparison of models and cross-validation strategies for genomic prediction of quality traits in advanced winter wheat breeding lines. Frontiers in Plant Science, 9, 69.
Lai, K., Lorenc, M. T., Lee, H. C., Berkman, P. J., Bayer, P. E., Visendi, P., Ruperao, P., Fitzgerald, T. L., Zander, M., Chan, C. K. K. & Manoli, S. (2015). Identification and characterization of more than 4 million intervarietal SNPs across the group 7 chromosomes of bread wheat. Plant biotechnology journal, 13(1), 97-104.
Liljeroth, E. & Bryngelsson, T. (2002). Earlier onset of DNA fragmentation in leaves of wheat compared to barley and rye. Hereditas 136, 108–115.
Mardis, E. R. (2011). A decade’s perspective on DNA sequencing technology. Nature, 470, 198-203.
Maxam, A. M. & Gilbert, W. A. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74, 560-564.
Melchinger, A.E. (1999). Genetic diversity and heterosis. In: J.T. Gerdes, editor, Genetics and exploitation of heterosis in crops. ASA, CSSA, SSSA, Madison, WI. p. 99–118. doi:10.2134/1999.geneticsandexploitation.c10.
Mochida, K., Yoshida, T., Sakurai, T., Ogihara, Y. & Shinozaki, K. (2009). TriFLDB: a database of clustered full-length coding sequences from Triticeae with applications to comparative grass genomics. Plant Physiology, 150, 1135–1146.
Poland, J. A. & Rife, T. W. (2012): Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. Plant Genome, 5, 92–102.
R Core Team. 2016. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Retrieved from, https://www.R-project.org/.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proceedingsof the National Academy of Sciences,74, 5463–5467.
Shendure, J. & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26, 135–1145.
Shirasawa, K., Hirakawa, H. & Isobe, S. (2016). Analytical workflow of double-digest restriction site-associated DNA sequencing based on empirical and in silico optimization in tomato. DNA Research, 23(2), 145-153.
VLK, D. & ŘEPKOVÁ, J. (2017). Application of Next-Generation Sequencing in Plant Breeding. Czech J. Genet. Plant Breeding, 53(3), 89−96.
Voss-Fels, K., Frisch, M., Qian, L., Kontowski, S., Friedt, W., Gottwald, S. & Snowdon, R. J. (2015) Subgenomic diversity patterns caused by directional selection in bread wheat gene pools. Plant Genome, 8(2), 1-13. doi: 10.3835/plant genome2015.03.0013.
Wang, S. X., Zhu, Y. L., Zhang, D. X., Shao, H., Liu, P. & Hu, J. B. (2017). Genome-wide association study for grain yield and related traits in elite wheat varieties and advanced lines using SNP markers. PLoS ONE, 12(11), 1-14.
جدول ضمیمه 1- لاین و ارقام جمعیت اصلاحی.
Appendix 1. Lines and cultivars of the breeding population.
Alipour, H., Bihamta, M. R., Mohammadi, V., Peyghambari, S. A., Bai, G. & Zhang G. (2017). Genotyping-by-Sequencing (GBS) Revealed molecular genetic diversity of Iranian wheat landraces and cultivars. Frontiers in Plant Science, 8, 1-14.
Allen, A. M., Barker, G. L., Wilkinson, P., Burridge, A., Winfield, M., Coghill, J., Uauy, C., Griffiths, S., Jack, P., Berry, S. & Werner, P. (2013). Discovery and development of exome‐based, co‐dominant single nucleotide polymorphism markers in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.). Plant Biotechnology Journal, 11(3), 279-295.
Arafa, R. A., Rakha, M. T. Soliman, N. E. K. Moussa, O. M. Kamel, S. M. & Shirasawa, K. (2017). Rapid identification of candidate genes for resistance to tomato late blight disease using next-generation sequencing technologies. PLoS ONE, 12(12), 1-15.
Berkman, P. J., Visendi, P., Lee, H. C., Stiller, J., Manoli, S., Lorenc, M. T., Lai, K., Batley, J., Fleury, D., Šimková, H. & Kubalakova, M. (2013). Dispersion and domestication shaped the genome of bread wheat. Plant biotechnology journal, 11(5), 564-571.
Borrill, P., Adamski, N. & Uauy, C. (2015). Genomics as the key to unlocking the polyploidy potential of wheat. New Phytologist, 2008, 1008-1022.
Bradbury, P. J., Zhang, Z., Kroon, D. E., Casstevens, T. M., Ramdoss, Y. & Buckler, E. S. (2007). TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples. Bioinformatics, 23(19), 2633-2635.
Brenchley, R., Spannagl, M., Pfeifer, M., Barker, G., D’Amore, R., Allen, A. M., McKenzie, N., Kramer, M., Kerhornou, A. & Bolser, D. (2012). Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing. Nature, 491, 705– 710.
Cavanagh, C. R., Chao, S., Wang, S., Huang, B. E., Stephen, S., Kiani, S., Forrest, K., Saintenac, C., Brown-Guedira, G. L., Akhunova, A. & See, D. (2013). Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars. Proceedings of the national academy of sciences, 110(20), 8057-8062.
Chapman, J. A., Mascher, M., Buluc, A., Barry, K., Georganas, E. and Session, A. (2015). A whole-genome shotgun approach for assembling and anchoring the hexaploid bread wheat genome. Genome Biology, 16, 26.
DaCosta, J. M. & Sorenson, M. D. (2014) Amplification Biases and Consistent Recovery of Loci in a Double-Digest RAD-seq Protocol. PLoS ONE, 9(9), 1-14.
Edae, E. A., Bowden, R. L. & Poland, J. (2015). Application of Population Sequencing (POPSEQ) for Ordering and Imputing Genotyping-by-Sequencing Markers in Hexaploid Wheat. G3: Genes, Genomes, Genetics, 5(12), 2547-2553.
El-Metwally, S., Ouda, M. O., & Helmy, M. (2014). Next Generation Sequencing Technologies and Challenges in Sequence Assembly. Springer Science.
International Wheat Genome Sequencing C. (2014). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L.) genome. Science, 345, 6194.
Kchouk, M., Gibrat, J. F. & Elloumi, M. (2017). Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation. Biology and Medicine ,(Aligarh), 9(3), 1-8.
Krasileva, K., Buffalo, V., Bailey, P., Pearce, S., Ayling, S., Tabbita, F., Soria, M., Wang, S., Consortium, I. & Akhunov, E. (2013). Separating homeologs by phasing in the tetraploid wheat transcriptome. Genome Biology, 14(6), R66.
Kristensen, P. S., Jahoor, A., Andersen, J. R., Cericola, F., Orabi, J., Janss, L. L. & Jensen, J. (2018). Genome-Wide association studies and comparison of models and cross-validation strategies for genomic prediction of quality traits in advanced winter wheat breeding lines. Frontiers in Plant Science, 9, 69.
Lai, K., Lorenc, M. T., Lee, H. C., Berkman, P. J., Bayer, P. E., Visendi, P., Ruperao, P., Fitzgerald, T. L., Zander, M., Chan, C. K. K. & Manoli, S. (2015). Identification and characterization of more than 4 million intervarietal SNPs across the group 7 chromosomes of bread wheat. Plant biotechnology journal, 13(1), 97-104.
Liljeroth, E. & Bryngelsson, T. (2002). Earlier onset of DNA fragmentation in leaves of wheat compared to barley and rye. Hereditas 136, 108–115.
Mardis, E. R. (2011). A decade’s perspective on DNA sequencing technology. Nature, 470, 198-203.
Maxam, A. M. & Gilbert, W. A. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74, 560-564.
Melchinger, A.E. (1999). Genetic diversity and heterosis. In: J.T. Gerdes, editor, Genetics and exploitation of heterosis in crops. ASA, CSSA, SSSA, Madison, WI. p. 99–118. doi:10.2134/1999.geneticsandexploitation.c10.
Mochida, K., Yoshida, T., Sakurai, T., Ogihara, Y. & Shinozaki, K. (2009). TriFLDB: a database of clustered full-length coding sequences from Triticeae with applications to comparative grass genomics. Plant Physiology, 150, 1135–1146.
Poland, J. A. & Rife, T. W. (2012): Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. Plant Genome, 5, 92–102.
R Core Team. 2016. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Retrieved from, https://www.R-project.org/.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proceedingsof the National Academy of Sciences,74, 5463–5467.
Shendure, J. & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26, 135–1145.
Shirasawa, K., Hirakawa, H. & Isobe, S. (2016). Analytical workflow of double-digest restriction site-associated DNA sequencing based on empirical and in silico optimization in tomato. DNA Research, 23(2), 145-153.
VLK, D. & ŘEPKOVÁ, J. (2017). Application of Next-Generation Sequencing in Plant Breeding. Czech J. Genet. Plant Breeding, 53(3), 89−96.
Voss-Fels, K., Frisch, M., Qian, L., Kontowski, S., Friedt, W., Gottwald, S. & Snowdon, R. J. (2015) Subgenomic diversity patterns caused by directional selection in bread wheat gene pools. Plant Genome, 8(2), 1-13. doi: 10.3835/plant genome2015.03.0013.
Wang, S. X., Zhu, Y. L., Zhang, D. X., Shao, H., Liu, P. & Hu, J. B. (2017). Genome-wide association study for grain yield and related traits in elite wheat varieties and advanced lines using SNP markers. PLoS ONE, 12(11), 1-14.
