تعداد نشریات | 194 |
تعداد شمارهها | 4,923 |
تعداد مقالات | 53,847 |
تعداد مشاهده مقاله | 89,941,977 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 72,757,600 |
کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان به روش ddRAD-Seq | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
علوم گیاهان زراعی ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقاله 8، دوره 51، شماره 3، پاییز 1399، صفحه 103-114 اصل مقاله (1.61 MB) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نوع مقاله: مقاله پژوهشی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22059/ijfcs.2019.277138.654586 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نویسندگان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
محمد آرمیون ![]() ![]() | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1مرکز تحقیقات کشاورزی و آموزش و منابع طبیعی استان ایلام ، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، ایلام، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2استاد گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده علوم و مهندس کشاورزی دانشگاه تهران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده علوم و مهندس کشاورزی دانشگاه تهران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4استادیار موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5رئیس آزمایشگاه ژنومیکس و ژنتیک کاربردی گیاهی موسسه تحقیقات DNA کازوسا ژاپن | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
چکیده | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
بهمنظور کشف، تعیین و ژنوتیپسنجی نشانگرهای SNP و گروه بندی لاینهای پیشرفته گندم نان، از روش ddRAD-Seq استفاده شد. DNAاز برگ گیاهچه استخراج شد و پس از تهیه کتابخانه، از پلاتفرم NextSeq TM 500 Illumina ® برای توالییابی استفاده شد. متوسط نمره کیفیت فرد (Phred) برای تمام افراد برابر30 بود. از مجموع 178811846 خوانش توالی قرائت شده، 150108678 خوانش صحیح و بهطور متوسط به ازای هر لاین، 2207480 خوانش تولید شد. بالاترین نرخ همردیفی، مربوط به ژنوم B و کمترین، مربوط به ژنوم D بود. با توجه به شرایط فیلتر، (DP≥5)، (Quality score=≥999)، (MAF>5%) و (Het<10%)، تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گمشده برابر با 3342 عدد، که تعداد 1322 روی ژنوم B، 1253 روی ژنوم A و 767 روی ژنوم D و بیشترین SNP روی کروموزوم دوم و سوم از ژنوم B و کمترین آن روی کروموزوم چهارم از ژنوم D شناسائی شد. بیشترین چگالی نشانگری، روی کروموزومهای دوم و پنجم ژنوم B و کمترین، روی کروموزوم چهارم از ژنوم D مشاهده شد. بین چگالی نشانگری و اندازه کروموزوم در سه ژنوم، رابطه خطی بسیار معنیداری مشاهده شد. تجزیه به مولفههای اصلی و ماتریس تشابه و گروهبندی همزمان با استفاده از اطلاعات نشانگر SNP، قادر به شناسائی و تفکیک زیر جمعیتها از یک جمعیت اصلی شد. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
کلیدواژهها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
والییابی NextSeq TM 500؛ روش ddRAD-Seq؛ گندم نان؛ نشانگر SNP؛ DNA | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
اصل مقاله | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقدمه
گندم یک محصول زراعی مهم، اصلی و عمده است که در بیشتر قسمتهای جهان رشد میکند (Kristensen et al, 2018). دو حالت اصلی از آلوپلیپوئیدی گندم یعنی هگزاپلوئید (Triticum aestivum ssp. aestivum) با اندازه ژنوم حدود Gb 17 و تتراپلوئید (Triticum turgidum ssp. durum) با اندازه ژنوم Gb 12 وجود دارد (Borrill et al., 2015). بیش از 95 الی 99 درصد از نواحی کدکننده در کروموزومهای همیولوگهای گندم مشابه هستند (Krasileva et al., 2013). اندازه عظیم ژنوم گندم، درجه شباهت زیاد توالیها و محتوای DNA تکراری آن، مانع جدی در تولید نسخه اولیه توالی ژنوم گندم بود. در نتیجه پژوهشگران در ابتدا روی توالیهای کد کننده (CDS) و مجموعههای بزرگ توالیهای نشانمند ترجمه شده (ESTs) فعالیت نمودند و یک نقشه مونتاج شده از این توالیها تولید کردند. از طرفی، ظهور فنآوری NGS رویکرد جدیدی برای غلبه بر مشکلات توالییابی ژنوم گندم فراهم نمود. فنآوری نسل جدید دوم و سوم NGS، باعث دگرگونی اساسی در آنالیز ژنوم و دررنتیجه افزایش فهم ما از رابطه ژنوتیپ - فنوتیپ شده است (Mochida et al., 2009). توالییابی DNA یک فرآیند دقیق است که ترتیب صحیح نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA را تعیین میکند (El-Metwally et al., 2014). ظهور فنآوریهای توالییابی، نقش مهمی در تجزیه و تحلیل توالیهای ژنومی ارگانیسمها بازی کرده است (Shendure & Ji, 2018 ). اولین فنآوری توالییابی در سال 1977 بهوسیله Sanger و Maxam - Gilbert ایجاد شد. فنآورهای نسل جدید تحت عنوان فنآوری توالییابی NGS یا فنآوری های توالییابیخودکار با مقیاس بالا، در سال 2005 با فن آوری Roche’s 454 معرفی شدند. فنآورهای NGS آنالیز حجیم موازی بصورت خودکار از چندین نمونه با هزینه خیلی کم تولید میکنند و قادر به توالییابی میلیونها تا میلیاردها خوانش بهصورت موازی و همزمان در یک مرحله اجرا هستند و زمان مورد نیاز برای تولید خوانشهای با اندازه گیگابایت اطلاعات، تنها چند روز یا ساعت است (Mardis, 2011). در زمینه تحقیقات گیاهی، فنآوریهای NGS یکی از ابزارهای مهم برای تشکیل اسمبلی ژنومهای مرجع گیاهان زراعی، توالییابی ترانسکریپتوم برای تحقیقات بیان ژن، توسعه نشانگرهای مولکولی در سطح ژنوم و شناسائی نشانگرها در ژنهای با عملکرد معین شد
مواد و روشها مواد ژنتیکی در این پژوهش، از 50 ژنوتیپ و رقم زراعی حاصل از انتخاب لاینهای برتر از یک آزمایش مشترک مقدماتی تحت عنوان PRBWYT از ایستگاههای گرگان، گنبد، ساری و مغان برای اقلیم گرم و مرطوب شمال موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال، استفاده شده است (جدول 1 ضمیمه). استخراج، تعیین سلامت و رقیق سازی DNA بهمنظور استخراج DNA، از بافت برگ گیاهچههای با سن چهارده روز نمونهبرداری شد و نمونهها سریعا به آزمایشگاه موسسه تحقیقات DNA کازوسا (www.kazusa.or.jp/en/) انتقال یافتند و در فریزر 80- درجه ذخیره شدند. از دستگاه Tissuelyser II (Qiagen Inc., Hilden, Germany) برای آسیاب و از پروتکل شرکت کیاژن (The DNeasy Plant Mini kit) برای استخراج DNA نمونههااستفاده شد. غلظت اولیه DNAبا دستگاه Nano drop ND-1000 تعیین شد. برای تعیین سلامت DNA از ژل آگارز 7/0 درصد، بافر 1X BPB و دو نشانگر لاندا (λ) یک باندی و |HinIII λ چند باندی استفاده شد (Liljeroth & Bryngelsson, 2002). کمیت دقیقتر DNAبهوسیله کیتهای Qubit® dsDNA BR Assay Kits (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA ) و با دستگاهQubit® 30 Fluorometer تعیین شد (شکل 1).
شکل 1- تعیین سلامت DNA استخراج شده نمونهها. Figure1. Health determination of DNA extracted from samples.
پروتکل ddRAD-Seq پس از استخراج DNA ژنومیک با کیفیت مناسب و برای کاهش اندازه و برش ژنوم، از دو آنزیم برشی FastDiges PstI و FastDiges MspI و بافر 10X FastDigest Buffer استفاده شد (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) و پلیت DNA ژنومیک به مدت دو دقیقه با سرعت rpm 100 × 100 سانتریفیوژ و در زمان 16 ساعت با دمای 37 درجه سانتیگراد در دستگاه PCR انکوبات شد. پس از مرحله هضم، آداپتورهای ,RAD-ad1-PstI Adaptor(50μm) RAD-ad2-PstI Adaptor(50μm)، RAD-ad1-MspI Adaptor(50μm) وRAD-ad2-MspI Adaptor(50 μm)، آنزیمهای FastDiges PstI و FastDiges MspI، آنزیم T4 DNA ligase (Promega, Madison, WI, USA) و بافر 2x Rapid ligation buffer به DNA ژنومیک اضافه، و سپس پلیت نمونهها در دستگاه PCR برای شرایط 16 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه و 37 درجه به مدت 10 دقیقه و برای 25 سیکل انکوبات شد. برای حذف قطعات با طول کمتر از bp 350 از محلول گویهای مغناطیسی AMPure beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) استفاده شد. پس از رقیق سازی DNA ژنومیک به نسبت یک به 100 و قبل از تشکیل کتابخانه مشترک، اندیکس Read1_N5**/Read2_N7**(0.5uM) و مخلوط ترکیبات 10x KOD buf -plus-، dNTP، MgSO4،KOD –plus– ver.2 (Toyobo, Osaka, Japan) اضافه شد. برنامه ddRAD-Seq برای دستگاه PCR و تکثیر قطعات به صورت؛ آغاز عمل واسرشتسازی در دمای °C 95 به مدت سه دقیقه، 20 سیکل بصورت عمل واسرشت: دمای °C 94 در 30 ثانیه، اتصال: دمای °C 55 در 30 ثانیه، تکثیر: دمای °C 72 در یک دقیقه و سه دقیقه انتهایی بعد از اتمام دوره سیکل عمل تکثیر در دمای °C 72 ، انتخاب شد. برای تعیین غلظت DNA ژنومیک از بافر (Qubit® dsDNA HR Buffer) و محلول واکنشگر (Qubit® dsDNA HS Reagent) با حساسیت بالا و دو استاندارد یک (Qubit™ ds DNA HS) و دو (Qubit™ ds DNA HS) استفاده شد. پس از PCR، از هر نمونه حدود چهار میکرولیتر برداشته و در هشت تا نه میکروسانتریفیوژ 200 میکرولیتر جمعآوری شد و سپس همه مقادیر در یک میکروسانتریفیوژ 5/1 میلیلیتری جمع شدند و کتابخانه (Pooling) تشکیل شد که بهوسیله دستگاه کیوبیت، غلظت آن سنجیده شد. با استفاده از دستگاه BluePippin قطعاتDNA ژنومیک در رنج 500~800bp انتخاب و خالصسازی شدند و کتابخانه آزمایشگاهی برای انجام توالییابی آماده شد. تعیین کمیت و کیفیت DNA ژنومیک کتابخانه بهوسیله دستگاههای Qubit (ds DNA HS) و Tape Station Hs D1000 صورت گرفت. برای تعیین غلظت دقیق DNA ژنومیک برحسب پیکومولار، از کیتKapa Library Quantification Kit(KAPA Kit) استفاده و غلظت با دستگاه 7900HT Fast Real-Time PCR system شرکت Life Technologies تعیین شد. پس از تصحیح رقت کتابخانه به یک nM، عمل واسرشت و رقیق سازی بوسیله محلول 0.2N NaOH، بافر HT1 و PhiX control انجام گرفت. عملیات بارگذاری کتابخانه در کاتریج واکنشگر آماده سازی و با دستگاه500 Sequencer NextSeq TM توالییابی انجام گرفت. فرآیند محاسبات روش ddRAD-Seq تجربی پس از خاتمه عمل توالییابی کتابخانه، اطلاعات در قالب فایل qseq file format(qSEQ) آماده و ارائه شد و بر حسب نوع فنآوری هر دستگاه، یک فایل تعیین کیفیت توالی به نام fastQC تهیه شد که معمولا بر مبنای نمره فرد (Phred) تولید میشود. نمره کیفیت فرد شاخصی است که کیفیت شناسائی بازهای نوکلئوتیدی که بهوسیله سکونسرها به صورت خودکار تولید شده است را بررسی میکند. پس از این مرحله، برای استخراج توالیهای صحیح، از پاپلاینهای بیوانفورماتیک استفاد شد (Shirasawa et al., 2016). ابتدا توالیهای با کیفیت پایین (خوانش یا رید) بهوسیله نرم افزار PRINSEQ و سپس آداپتورها بهوسیله fastx_clipper حذف شدند. پس از آن، خوانشهای فیلتر شده نسبت به توالیهای مرجع از جمله IWGSC RefSeq v1.0 ، CSS، W7984 و IWGSC-WGA v0.4 (IWGSC, 2018) با استفاده از نرم افزار bowtie2 نقشهیابی شدند. فایل فرمت نتیجه همردیف/ نقشه SAM (Sequence Alignment Map) به فایل فرمت همردیف/ نقشه باینری تبدیل شد و سپس برای قرائت SNP استفاده شد و در نهایت، فایل VCF
نتایج و بحث کیفیت باندی حاصل از ازوش استخراج شرکت کیاژن مناسب بود (شکل1). این قدم اولیه در تهیه کتابخانه مناسب و تامین شرایط برای توالییابی پلاتفرم Illumina® است (Karaaslan et al., 2014). طول خوانشهای تولید شده از پروتکل ddRAD-Seq معادل bp 93 که پس از پیراش به bp 76 رسید. متوسط نمره کیفیت توالییابی برای هر دو طرف (Paired-end) برای کتابخانه 30 فرد بود (شکل 2). از مجموع 178811846 خوانش توالی قرائت شده، 150108678 خوانش صحیح یعنی معادل 84 درصد و بهطور متوسط به ازای هر لاین 2207480 خوانش تولید شد. لاین C13 با 1109856 خوانش، کمترین و C40 با 2673418 خوانش، بیشترین توالی صحیح تولید نمودند (جدول 1). با توجه به نرخ همردیفی و کیفیت نقشه، تعداد خوانشهای صحیح نقشهیابی شده به ازای هر ژنوم در توالیهای مرجع IWGSC Ref Seq v1.0، CSS، W7984 و IWGSC-WGAV0.4 متفاوت، که توالی مرجع IWGSC Ref Seq v1.0 نسبت به بقیه مطلوبتر بود (دادهها منتشر نشده است). در نقشهیابی خوانشهای صحیح نسبت به ژنوم رفرنس IWGSC RefSeq v1.0 گندم، بالاترین نرخ همردیفی مربوط به ژنوم B و کمترین مربوط به ژنوم D بود. این یافتهها نشان میدهد که تعداد خوانشهای صحیح در روش ddRAD-Seq به علت قرائت از دو انتها
شکل 2- میانگین نمره کیفیت فرد کتابخانه. Figure2. The average of Pherd's score of the pooling.
جدول 1- تعداد خوانشهای قرائت شده Table 1. The number of reads calling
بر اساس تاریخچه تکاملی گندم، ژنوم D پس از سالهای طولانی به ژنوم گندم نان اضافه شده است و بنابراین میزان موتاسیون، مضاعفشدن ژن و چند شکلی در ژنومهای قدیمی یعنی A و B که در اولین رویداد هیبریداسیون حدود نیم الی 3 میلیون سال پیش بین گونههای اجدادی دیپلوئید حاصل شده بود، بیشتر است (Alipour et al., 2017). پراکنش توزیع ژنجای SNPها در روی کرموزوم ژنومها یکنواخت نبود. بیشترین SNP روی کروموزوم دوم از ژنوم B (2B) و سوم از ژنوم B (3B) و کمترین آن روی کروموزوم چهارم از ژنوم D (4D) شناسائی شد (شکل 4). این دستاورد با یافتههای Alipour et al. (2017) و Edae et al. (2015) مشابه بود. بنابراین منطقی است که با افزایش اندازه کروموزوم و توالی بازهای نوکلئوتیدی روی آن، احتمال موتاسیون و تولید SNP جدید، روی دو ژنوم A و B زیاد شود.
جدول 2- مقایسه و پراکنش نشانگر SNP تولید شده بر اساس دادههای گم شده 20، 30، 40 و 50 درصد در سطح ژنوم و کروموزوم Table 2. The SNP markers Comparison and distribution based on 20, 30, 40, and 50% missing data on genome and chromosome
شکل 3- میزان پراکنش SNP در ژنوم های A، B و D در 50 درصد داده گم شده. Figure3. The SNP markers distribution on A, B and D genomes in 50% missing data.
شکل 4. میزان پراکنش SNP بر روی هر یک از کروموزومهای همیولوگ Figure 4. The SNP markers distribution on homoeologue chromosomes.
بیشترین چگالی نشانگری روی کروموزومهای دوم و پنجم ژنوم B (2B و 5B) و کمترین روی کروموزوم چهارم از ژنوم D (4D) مشاهده شد. همچنین این چگالی در ژنوم B بسیار بیشتر از ژنوم D بود (جدول 3). برونداد این تحقیق با نتایج Alipour et al. (2017) همسان بود. با حذف تاثیر اندازه کروموزوم بر تعداد SNP، در حقیقت علاوه بر اندازه کروموزوم، عوامل دیگری مانند طول دوره تکامل نیز در تعدادSNP روی کروموزومها دخالت دارند. رابطه خطی بسیار معنیدار بین چگالی (تراکم) نشانگری و اندازه کروموزوم در سه ژنوم مشاهد شد (شکل 5). این به این معناست که با افزایش اندازه و تراکم نشانگری، تعداد نشانگر SNP افزایش مییابد که این مشاهدات با اطلاعات
جدول 3- میزان چگالی نشانگری (SNP/Mbp) روی هر ژنوم و کروموزوم با دادههای 50 درصد گم شده Table 3. Marker density (SNP / Mbp) on each genome and chromosome with 50% missing data
شکل 5- رابطه خطی بین میزان چگالی (SNP/Mbp) و اندازه کروموزوم هر یک از ژنومهای A، B و D Graph 5. The linear regression between marker density (SNP/Mbp) and chromosome size in each of A, B, and D wheat genomes.
تجزیه به مولفههای اصلی نشان داد که بر حسب تعداد و رنگهای متفاوت، پنج گروه مختلف بر اساس شش مولفه اول (PC1-PC6) قابل شناسائی است که سهم هر مولفه از تغییرات واریانس کل در اسکری پلات به صورت هیستوگرام نمایان است. بر اساس این یافته، پنج زیر جمعیت بهصورت SP1 (n=2)، SP2 (n=9)، SP3 (n=8)، SP4 (n=16) و SP5 (n=15) قابل شناسائی بود (شکل6). این برونداد مطابق با یافتههای Voss-Fels و همکاران (2015) که از 460 ژنوتیپ و آرایه K90 نشانگر SNP برای گروهبندی جمعیت استفاده کردند، بود. علاوه بر آن، نمودار هیتمپ همزمان بر اساس ماتریس فاصله ژنتیکی نشانگر SNP و گروه بندی لاین/رقم صورت گرفت که ارتباطی قوی بین ژنوتیپها برای هر کلاستر جداگانه آشکار کرد، اما تمایز شدید برای گروهبندی منفرد و متمایز نشان نداد (شکل7). این دستاورد با یافته Wang et al. (2017) مطابقت داشت. گروه بندی بر اساس تجزیه مولفههای اصلی و ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ژنومیک یعنی SNP، صحت تفکیک زیر جمعیت را تایید میکنند، اما همانطور که ملاحضه میشود، با مقایسه گروه بندی بر اساس تجزیه به مولفهها و ماتریس شباهت ژنومی، جمعیت به سه گروه اصلی قابل تفکیک است.
شکل 6- گروهبندی جامعه پیشرفته اصلاحی بر اساس نشانگر SNP. Figure 6. The advanced breeding population classification based on SNP markers.
شکل 7- توپولوژی حاصل از ماتریس شباهت بر اساس نشانگر SNP و گروهبندی لاینها. Figure 7. Topology derived from a similarity matrix based on the SNP markers and lines grouping.
نتیجه گیری کلی متوسط نمره کیفیت فرد برابر با 30 بود که نشان دهنده مناسب بودن استفاده از فن آوری NGS با پلاتفرم Illumina®برای توالییابی گندم است. تعداد خوانشهای تولید شده در روش ddRAD-Seq به ازای هر لاین برابر با 2207480 بود که 8/1 برابر روش GBS که توسط Alipour et al. (2017) در جمعیت بسیار بزرگ گندم و هشت بار توالییابی بود. بیشترین SNP قرائت شده برای دادههای 50 درصد گمشده بهدست آمد. تعداد کل SNP های صحیح فراخونی شده برای 50 درصد داده گمشده برابر با 3342 عدد SNP بود که بیشترین آن در ژنوم B شناسائی شد. هم میزان پراکنش و هم تراکم SNP به ازای هر کروموزوم در ژنوم متفاوت بود. بین چگالی و اندازه کروموزوم رابطه خطی معنیدار مشاهده شد. تجزیه به مولفههای اصلی و ماتریس تشابه و گروهبندی همزمان با استفاده از اطلاعات نشانگر SNP، قادر به شناسائی زیر جمعیتها از یک جمعیت اصلی شد، اما ساختار جمعیت بسیار ضعیف بود و بنابراین تاثیری در برآورد ارزشهای اصلاحی ژنومی (GS) از طریق برازش مدلها و انتخاب بهترین لاین و مطالعات ارتباط نشانگر به صفت (MTA) و استفاده در MAS در برنامههای بهنژادی برای این جمعیت ندارد.
REFERENCES
جدول ضمیمه 1- لاین و ارقام جمعیت اصلاحی. Appendix 1. Lines and cultivars of the breeding population.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مراجع | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 47 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 22 |