جنس سالمونلا یکی از پنجاه ‌و سه جنس و یکی ازمهم‌ترین جنس‌های خانواده انتروباکتریاسه محسوب می‌شود. تاکنون بیش از 2658 سرووار در این جنس شناخته ‌شده و هرسال ده الی بیست سرووار جدید شناسایی و به آن‌ها افزوده می‌شود (12)، تمامی سرووار‌های این باکتری بالقوه بیماریزا بوده و طیف وسیعی از میزبان‌ها ازجمله انسان، طیور، پستانداران، ماهی‌ها و حتی برخی از بی‌مهرگان را آلوده می‌نماید (10،11،29،30،31). سرووارهای سالمونلا را می‌توان به عنوان یکی از عوامل مهم ایجاد بیماری در مرغداری‌ها و دامداری‌ها نام برد (4). اگر فرآورده‌های غذایی اضافه شده به جیره دام به صورت اصولی و بهداشتی تهیه نشوند می‌توانند باعث ایجاد بیماری و خسارت‌های اقتصادی به صنعت دامپروری شوند. لذا برای جلوگیری از این موارد می‌توان از جداسازی عوامل بیماریزا بر پایه کشت، آزمون‌های بیوشیمیایی، سرولوژی و ملکولی به ویژه PCR کمک گرفت (24). در مطالعه‌ای تحت عنوان بررسی چهره‌های بالینی سالمونلوز و میزان شیوع گروه‌های سرمی در گوساله که توسط Nadalian و همکاران در سال 2007 انجام گرفت پس انجام آزمون بر پایه کشت از مجموع 132 نمونه مورد بررسی، 18 نمونه سالمونلا شناخته شدند که از این تعداد بعد از آزمایشات تعیین گروه سرمی، 1 نمونه (5/5 درصد) در گروه 1C، 1 نمونه (5/5 درصد) در گروه 2C، 5 نمونه (8/27 درصد) در گروه B و11 نمونه (2/61 درصد) در گروه D قرار داشتند (19). Zahraei و همکاران در سال 2005 در مطالعه‌ای تحت عنوان کاربرد توام روش جداسازی ایمینیومگنتیک و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز چندتایی جهت جستجو و ردیابی سالمونلا انتریکا تحت گونه انتریکا سروار تیفی موریوم در نمونه‌های مدفوع اسهالی گاو پس از آزمایش باکتریولوژی از 400 نمونه مدفوع اسهالی گاو 33 مورد سالمونلا تشخیص داده شد و بعد از آزمایش آگلوتیناسیون از این 33 مورد، تعداد 3 جدایه سالمونلا دابلین (1/9درصد)، 1 جدایه سالمونلا انتریتیدیس (3 درصد) که هر دو در گروه D می‌باشند و 22 نمونه سالمونلا تیفی موریوم (7/66 درصد) که در گروه B هستند نشان داده شد، سپس با استفاده از پرایمر اختصاصی مورد آزمایش PCR قرار گرفتند که از میان آن‌ها در نمونه‌های واجد سروتیپ دابلین و انتریتیدیس تنها یک باند 284 جفت باز مربوط به ژن invA و چهار باند 663، 526، 284 و 183 که به ترتیب مربوط به ژن‌های rfbJ ، fljb ، invA وfliCدر کلیه نمونه‌های واجد تیفی موریوم مشاهده شد (34).         

سالمونلا‌ها به مدت طولانی در محیط خارج از بدن زنده می‌مانند ولی حاملین آن‌ها منبع مهمی در این رابطه می‌باشند و در انتشار آن در محیط دامداری نقش زیادی دارند. بنابراین شناسایی این حاملین در بروز بیماری‌ها نقش بسزایی در کنترل و پیشگیری از وقوع موارد جدید داشته و درنتیجه یکی از عوامل مهم در جلوگیری از ضررهای اقتصادی این بیماری است (13،15،17،31).

مواد و روش‌کار

در مطالعه حاضر 41 جدایه مشکوک به سالمونلا (35 جدایه مربوط به اسهال گوساله‌ها و 6 جدایه متعلق به جنین سقط شده) که از گاوداری‌های شیری استان تهران و البرز جداسازی شده بودند، مورد بررسی قرار گرفتند. این جدایه‌ها ابتدا با استفاده از خواص بیوشیمیایی و تعیین گروه سرمی با آنتی سرم‌های اختصاصی شرکت BD و Diffco شناسایی ‌شده سپس جهت تأیید نهایی آن‌ها، از آزمون PCR استفاده گردید (3،27). برای انجام آزمون PCR ابتدا استخراج DNA باکتری‌ها به روش جوشاندن صورت گرفت. بدین شکل که چند کلنی از باکتری کشت داده ‌شده در محیط LB آگار در 300 میکرو لیتر آب مقطر استریل در دمای 100 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه جوشانده شد و پس از مرحله سانتریفیوژ مقدار 100 میکرولیتر مایع رویی برداشت ‌شده و تا زمان آزمون PCR در20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید (3،27،28،31). در این تحقیق از سوش‌های سالمونلا انتریتیدیس، اینفنتیس و دابلین تأیید شده که در گنجینه میکروبی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران نگهداری می‌شدند به ‌عنوان شاهد مثبت و از آب دو بار تقطیر دیونیزه نیز به‌ عنوان شاهد منفی استفاده شد (1،24،26).

انجام آزمون PCR: مواد مورد استفاده در واکنش PCR از شرکت سینا کلون تهیه شد که شامل مسترمیکس و پرایمرهای اختصاصی برای تشخیص سالمونلاهای دابلین، انتریتیدیس و اینفنتیس بودند (جداول 1،2،3). حجم واکنش برای هر نمونه 25 میکرو لیتر محاسبه شد و برنامه حرارتی در 35 سیکل انجام گرفت (9،30). در این تحقیق از ژل آگارز2/1 درصد استفاده شد و به میزان 5 میکرولیتر از محصول PCR به چاهک‌ها انتقال یافت و در کنار آن‌ها دو چاهک شاهد مثبت و منفی نیز در نظر گرفته شد (1،17،24،25). مارکر مورد استفاده در این مطالعه bp100 و مربوط به شرکت سینا کلون انتخاب گردید. سپس ژل در داخل مخزن الکتروفورز حاوی بافر TBE 1X قرار گرفت و به مدت یک ساعت با ولتاژ 120 و تواتر 74 آمپر، الکتروفورز صورت گرفت. برای رنگ‌آمیزی به مدت 10 تا 20 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت و ژل بعد از شستشو با آب بر روی دستگاه ژل داکیومنتیشن قرائت شد (9،13،27،30).

نتایج

آزمایشات بیوشیمیایی و سروتایپینگ: پرگنه‌های لاکتوز منفی در محیط مک کانکی مربوط به ‌تمامی 41 جدایه، مورد آزمایش‌ها بیوشیمیایی قرار گرفتند که در محیط TSI به‌صورت ALK/A و H2S مثبت مشاهده‌ شده و از نظر هیدرولیز اوره منفی بودند. آزمون اندول و وژس پروسکوئر جدایه‌ها منفی و آزمایش‌های متیل رد و مصرف سیترات آن‌ها مثبت بود. همچنین تمامی جدایه‌ها ازنظر حرکت مثبت بودند. در آزمایش‌های مربوط به تعیین گروه سرمی، 37 جدایه در گروه D و 4 جدایه نیز در گروه C جدول کافمن - وایت قرار گرفتند (23/90 درصد). در تعیین سرووار تاژکی مربوط به گروه D، 32 جدایه (g.m،1،9،12) سالمونلا اینتریتیدیس (04/78 درصد) و 5 جدایه هم (g.p،1،9،12) سالمونلا دابلین تشخیص داده شد (19/12 درصد). چهار جدایه مربوط به گروهC (5و1،r،6،7)  نیز سالمونلا اینفنتیس شناسایی گردید (77/9 درصد) (نمودار 1).

نتایج آزمون PCR: نتایج مربوط به این آزمون که به روش مولتی پلکس PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی مربوط به سالمونلا اینتریتیدیس، سالمونلا اینفنتیس و سالمونلا دابلین انجام ‌شده بود در تصاویر 1، 2 و 3 نشان داده‌ شده است. باندهای مشاهده ‌شده مربوط به‌تمامی ژن‌ها با کنترل مثبت مورداستفاده همخوانی داشته و در کنترل منفی باندی مشاهده نشد.

بحث

تشخیص آزمایشگاهی سالمونلا به طور معمول با محیط‌های غنی کننده انتخابی یا غیر انتخابی و متعاقب آن کشت روی محیط‌های انتخابی صورت می‌گیرد که حداقل 4 تا 5 روز زمان بر است و امکان بروز پاسخ منفی کاذب هم وجود دارد درحالی که می‌توان از روش PCR برای شناسایی سریع‌تر سالمونلا­­ استفاده نمود (5،7،8)

Rhan و همکاران در سال 1992 تکثیر ژن invA را به‌عنوان روش اختصاصی برای تعیین جنس سالمونلا استفاده نمود. در این مطالعه اشاره شده است که تمامی سالمونلا‌ها حاوی ژن invA هستند و از این ژن در شناسایی جنس سالمونلا می‌توان استفاده کرد (24). در مطالعه حاضر نیز از تکثیر ژن invA برای تعیین جنس سالمونلا استفاده شد که تمامی جدایه‌ها، این ژن را دارا بودند. Cloutheir و همکاران در سال 1992 گزارش نمودند اپرون sef در سالمونلا انتریتیدیس بیش از سایر فیمبریه‌ها مورد مطالعه قرار گرفته است (8). اپرون sef در سالمونلا انتریتیدیس دارای سه ژن sefC،sefB، sefA می‌باشد که عهده‌دار بیوسنتز فیمبریه SEF14 می‌باشند که در بین آن‌ها ژن sefA جز اصلی فیمبریه SEF14 (فیمبرین) را رمز‌دهی می‌نماید. البته ژن‌های sefD وsefE نیز بعدا در اپرون sef شناسایی گردیدند (6). ژن sef فقط در سالمونلاهای گروهD حضور دارد (5،7). Choen و همکاران در سال 1996 موفق شدند بوسیله PCR و با استفاده از ژن fimA جدایه‌های متعلق به جنس سالمونلا را از جدایه‌های متعلق به غیر این جنس سالمونلا تفریق نماید (5). اما ژن fimA برای تفریق سروتیپ‌های گوناگون سالمونلا از همدیگر قابل استفاده نبود (5). در تحقیقی که Woodward و همکاران در سال 1996 برروی شناسایی میکروب‌های مواد غذایی بسته‌بندی شده با استفاده از روش Multiplex-PCR انجام دادند، سالمونلا انتریتیدیس شناسایی شد. در گزارشاتی که از مطالعات قبلی بدست آمده از پرایمر‌های S1-S4 برای شناسایی ژن حدت SPV استفاده شده ولی این ژن در همه نمونه‌های جدا‌ شده یافت نشده است (32). در تحقیقات Woodward در سال 1996 این ژن فقط 30 درصد از سالمونلا انتریتیدیس‌های جدا شده از پرندگان یافت شد (32) و حضور این ژن در مقایسه با سالمونلا انتریتیدیس‌های جدا شده در مطالعات Pan در سال 2002 به میزان بیشتری افزایش پیدا کرده است (22). Chu و Jonathan در سال 1996 با استفاده از روش غنی سازی مدفوع روی ژن‌های invA و spv سالمونلا با روش PCR تحقیقاتی را انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که محیط‌های غنی کننده به طور فزاینده‌ای باعث افزایش باکتری‌های مورد نظر شده و استخراج DNA راحت‌تر و بهتر صورت می‌گیرد (7) .همچنین Khan در سال 1999 نشان داد که ژن invA یک ژن ضروری برای ورود و تهاجم باکتری به قسمت‌های عمیق‌تر بافت است (15). Pan در سال 2002 نشان داد برای شناسایی سالمونلا انتریتیدیس می‌توان از پرایمرهای SEFA که مربوط به تاژک آن‌هاست استفاده کرد (22). در مطالعه حاضر ژن sefA و spv در همه جدایه‌های اینتریتیدیس مشاهده شد.

Itoh و همکاران در سال 1997 با پرایمر‌های rfbE و fliC که به ترتیب برای تکثیر ژن‌های rfbE و fliC سالمونلا دابلین هستند استفاده نمودند (13). Mirmoeini و همکاران نیز در سال 2008 با تکثیر ژن SopE و مشاهده باند آن در bp399 حضور سالمونلا دابلین را تأیید کردند (17). در این مطالعه نیز از تکثیر ژن‌های SeD_A1226 ،SeD_A1104 و SeD_A2276برای شناسایی سالمونلا دابلین استفاده گردید که پنج نمونه (19/12 درصد) سالمونلا دابلین شناخته شدند.

با توجه به بیماریزایی سالمونلاها در انسان و دام و خسارات اقتصادی فراوان این باکتری، شناسایی سریع و قطعی آن در مراحل اولیه بسیار حائز اهمیت می‌باشد. برای این مورد مطالعات فراوانی صورت گرفته است (24،28). Amavisit و همکاران در سال 2000 با استفاده از غنی‌سازی مدفوع اسب‌های مشکوک به سالمونلوز با استفاده از روش PCR به نتایج جالبی دست یافتند. پرایمر‌های مورد نظر آن‌ها در این تحقیق S18 و S19 بود. با استفاده از این پرایمر‌ها ژن مورد نظر یعنی ompC را تکثیر نمودند (2). همچنین Oliveira در سال 2003 با آزمون PCR و با استفاده از پرایمر invA که مختص شناسایی جنس سالمونلا هستند توانست از نمونه‌هایی که بصورت منفی کاذب که بصورت متداول رخ می‌دهند بکاهد امروزه از ژن invA که یک استاندارد جهانی برای شناسایی جنس سالمونلا است به‌صورت متداول استفاده می‌شود (21).

Zahraei و همکاران در سال 2007 در رابطه با شناسایی باکتری سالمونلا و سرووارهای آن‌ها از400 نمونه اسهال گاو با استفاده از آزمون Multiplex PCR و استفاده از چهار جفت پرایمر بنام پرایمرهای S₁₃₉ وS₁₄₁ برای ژنinvA که تعیین کننده سالمونلا بودن است و پرایمر‌های RrfbJ ، FliC و FljB که به ترتیب ژن هدف آن‌ها rfbJ،FliC و FljB استفاده نمودند (33). نتیجه آن 33 مورد (25/8 درصد) از 400 نمونه آلوده به سالمونلا بودند، از این 33 مورد 22 مورد سالمونلا انتریکا سروتیپ تیفی موریوم (66 درصد) و 3 مورد مربوط به سروتیپ دابلین بودند (33). در این تحقیق از تکثیر ژن‌های SeD_A1226، SeD_A1104 و SeD_A2276برای شناسایی سالمونلا دابلین استفاده گردید که پنج نمونه (19/12 درصد) سالمونلا دابلین شناخته شدند. ولی در مطالعه حاضر چه در آزمایش‌های سرمی و چه در روش PCR سالمونلا تیفی موریوم شناسایی نشد.

Amini و همکاران در سال 2010 از آزمون Multiplex PCR برای جداسازی سالمونلا انتریتیدیس و شناسایی حضور ژن‌های spv و invA در 1001 نمونه از پرندگان که از کشتارگاه‌های طیور استان کرمان ارسال شده بودند استفاده نمودند و در آن مطالعه از آزمایش‌ها بیوشیمیایی و سرولوژیکی برای شناسایی سالمونلا استفاده شد و میزان 68 نمونه (79/6 درصد) سالمونلا بود نشان مورد تأیید قرار گرفت (3). در این تحقیق از تکثیر ژن‌های invA، spv و sefAبرای شناسایی سالمونلا انتریتیدیس استفاده شد که حدود 32 نمونه (04/78 درصد) سالمونلا انتریتیدیس شناخته شدند.

در مطالعه‌ای تحت عنوان شیوع سالمونلا تیفی موریوم در شیرهای خام گاو، گوسفند و بز عرضه شده در استان چهار محال و بختیاری که توسط Tadjbakhsh و همکاران در سال 2013 انجام گرفت پس انجام آزمون بر پایه کشت از مجموع 550 نمونه مورد بررسی، 20 نمونه سالمونلا شناخته شدند که از این تعداد نمونه‌های آلوده شامل 14 نمونه (54/2درصد) شیر گاو، 2 نمونه (36/0 درصد) شیر گوسفند و 4 نمونه (72/0 درصد) شیر بز بودند. از 20 جدایه سالمونلا به روش کشت 9 جدایه (36/1 درصد) در PCR به‌عنوان سالمونلا تیفی موریوم مورد تأیید قرار گرفتند (28).

Peyghambari و همکاران در سال 2014 در مطالعه‌ای تحت عنوان جستجوی سالمونلا انتریکا سرووار اینفنتیس با PCR در بین جدایه‌های گروه C سالمونلای طیور، پس از آزمایش آگلوتیناسیون روی لام برای تعیین گروه سرمی، کلیه 100 جدایه سالمونلا در گروه C طبقه‌بندی شدند. سپس با استفاده از پرایمر اختصاصی، 100 جدایه سالمونلای گروه C مورد آزمایش PCR قرار گرفتند که از مجموع آن‌ها 79 جدایه باند اختصاصی bp413 را برای سالمونلا اینفنتیس نشان دادند (23). در این تحقیق پس از تکثیر ژن‌های hut و fljB چهار نمونه (77/9 درصد) سالمونلا اینفنتیس شناخته شدند (22). Ghodusi و همکاران نیز در سال 2014 با بررسی 46 نمونه اخذ‌‌ شده از ماکیان شمال ایران و پس از سروگروپینگ و انجام آزمون PCR و با استفاده از پرایمر‌های r1275 و f558، نشان دادند که 44 نمونه مربوط به سالمونلا اینفنتیس می‌باشند. در این مطالعه نیز 4 جدایه سالمونلا اینفنتیس تشخیص داده شدند (9).

نتیجه‌گیری نهایی: با بررسی اپیدمیولوژیکی که انجام گرفت برای مشخص نمودن علت اینکه چرا سروار‌های سالمونلا انتریتیدیس و سالمونلا اینفنتیس که در تحقیقات مختلف بیشتر از طیور جدا شده است، ازگاوداری‌های استان تهران و البرز جدا شده است مشخص شد که این گاوداری‌ها مدتی است که از پودر گوشت طیور استفاده می‌کنند و به نظر می‌رسد برای تهیه پودر گوشت، از درجه حرارت پایین‌تر از حد استاندارد در کارخانه‌های تولید کننده استفاده می‌گردد و همین دلیل موجب شده است که این سالمونلا‌ها در پودر تهیه شده زنده بمانند و به گاوها منتقل شود.

سپاسگزاری

نویسندگان برخودلازم می‌دانند تا مراتب قدردانی خود را از زحمات دکتر علیرضا شقایق، دکتر ایرج اشرافی‌تمای و سرکار خانم دکتر رامک یحیی رعیت به عمل آورند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

1. Agron, G.P., Walker, R.L., Kind, H., Sawyer, S.J, Hayes, D.C., Wollard, J., Anderson, G.L. (2001). Identification by subtractive hybridization of sequence specific for Salmonella serovar enteritidis. Appl Environ Microbiol, 67(11), 4984–4991, https://doi/10.1128/AEM.67.11.4984-4991
2. Amavisit, P., Browning, G.F., Lightfoot, D., Church, S., Anderson, G.A., Whithear, K.G., Markham, P.F. (2001). Rapid PCR detection of Salmonella in horse fecal samples. Vet Microbiol, 79, 63-74. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(00)00340-0 PMID: 11230929
3. Amini, K., Zahraei Salehi, T., Nikbakht, G., Ranjbar, R., Amini, J., Ashrafganjooei, S.H. (2010). Molecular detection of invA and spv virulence genes in Salmonella enteritidis isolated from human and animals in iran. African J Microbiol Res, 4(21), 2202-2210.
4. Chloe, K.B., Mortimer., Tansy, M.P., Saheer, E.G, Julie, M.J.L., Catherine, A. (2004). Towards the development of a DNA-sequence based approach to serotyping of Salmonella enterica. J BMC Microbiology, 4(31),1-10.
5. Choen, H.J., Mechanda S.M., Lin, W. (1996). PCR amplification of the fimA gene sequence of Salmonella typhymurium, a specific method for detection of salmonella Spp. Appl Environ Microbiol, 62, 4303-4308. PMID: 8953701
6. Chollighan, R.J., Woodward, M.J. (2001). The SEF14 fimberial antigen of Salmonella enteritidis is encoded within a pathogenicity islet. Vet Microbiol, 80, 235-245. https://doi.org/ 10.1016/s0378-1135(01)00309-1 PMID: 11337139
7. Chu, C.H., Jonathan, T.O. (1996). Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gene, invA and spv enrichment broth culture –multiplex PCR combination assay, J Clin Microbial, 34, 2619-2622. PMID: 8880536
8. Cloutheir, S.C., Muller, K.H., Doran, J.L., Collinson, S.K., Kay, W.W. (1993). Characterization of three fimbrial genes, sefABC, of Salmonella enteritidis. J Bacteriol, 175(9), 2523-33. https://doi.org/10.1128/jb.175.9.2523-2533.1993
9. Ghoddusi, A., Nayeri Fasaei, B., Karimi, V., Ashrafi, T.I. (2014). Molecular identification of Salmonella infantis isolated from backyard chickens and detection of their resistance genes by PCR. Iran J Vet Res, 16 (3), 293-7. PMID: 27175192
10. Gyles, C.L., Prescott, J.f., Songer, F.J., Thoen, C.O. (2010). Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals, (4^st ed.) Wiley- Blackwell. Hoboken, Newjersey, USA.
11. Holmes, D.S., Quiglev, M.A. (1993). A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem, 114(1), 193-7. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90473-5 PMID: 6269464
12. Issenhuth-Jeanjean, S.1., Roggentin, P., Mikoleit, M., Guibourdenche, M., De Pinna, E., Nair, S., Fields, P.I., Weill, F.X. (2014). Supplement to the White-Kauffmann-Le Minor scheme, Res Microbiol, 165(7), 526-30. https://doi.org/10. 1016/j.resmic.2014.07.004
13. Itoh, Y., Hirose, K., Miyake, M., Khan, A.Q., Hashimoto, Y., Ezaki, T. (1997).Amplification of rfbE and fliC genes by polymerase chain reaction for identification and detection of Salmonella serovar enteritidis, dublin and gallinarum-pullorum. Microbiol Immunol, 41(10), 791-4. https://doi. org/10.1111/j.1348-0421.1997.tb01928.x PMID: 9403503
14. Karimi, D.H., Esmaeili Pour, F., Ebrahimi Mohamadi, K. (2013). Study of prevalence of fresh meat beaf supply in the city of Sanandaj’s Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium. Lett in Applied Microbiol, 37(6), 463-469.
15. Khan, A.A., Nawaz, M.S, Khan, S., Serigelia, C.E. (1999). Detection of multidrug resistance Salmonella typhimurium DT104 by multiplex chain reaction. FEEMS Microbiol Lett, 182,355-360. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2000. tb08921.x PMID: 10620692
16. McVey, D.S, Kennedy, M., Chengappa, M.M. (2013). Vet Microbiol, (3^st ed.) Wiley- Blackwell. Hoboken, Newjersey, USA.
17. Mirmomeini, M.H., Kiani, S., Sisakhtezhad, S. (2008). Rapid detection of Salmonella dublin by PCR Amplification of the SopE Gene and its Cloning. Pak J Microbiol Sci, 11(11),1497-501. https://doi.org/10.3923/pjbs.2008.1497.1501 PMID: 18817254
18. Mirzaie, S., Hassanzadeh, M., Ashrafi, I. (2010). Identification and characterization of Salmonella isolates from captured house sparrows. Turkish J Vet and Animal Sci, 34(2), 181- 186.
19. Nadalian, M.GH., Motahedin, A., Zahraei Salehi, M.T., Khajeh Nasiri, SH.A.M., Lotfalizadeh, S. (2008). A study on the clinical features of salmonellosis and prevalence of Salmonella serogroups in calves. J Vet Res, 63(4), 241-246.
20. Nayebi, N., Ghoreyshi, S.A., Harzandi, N., Shams Ara, M., Tabardei Bakhtiari, A. (2011). PCR methods for detection of Salmonella infection in poultry products in the city of Karaj. Med Sci, 21(1), 32-37
21. Oliveira, S.D., Rodenbusch, C.R., Cé, M.C., Rocha, S.L., Canal, C.W. (2003). Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedure for Salmonelladetection. Lett Microbiol, 36, 217-221. https://doi.org/10. 1046/j.1472-765x.2003.01294.x PMID: 12641714
22. Pan, T.M., liu, Y.J. (2002). Identification of Salmonella enteritidis isolate by polymerase chain reaction and multiplex polymerase chain reaction. J Microbiol Immunol Infect, 35(3), 147-51. PMID: 12380786
23. Peighambari, S.M., Sorahi Nobar, M., Morshed, R. (2014). Detection of Salmonella enterica serovar infantis among serogroup C Salmonella isolates from poultry using PCR and determination of drug resistance patterns. Scientific-Research Iranian Veterinary Journal, 11(2), 54-61
24. Radostits, O.M., Gay, C., Hinchcliff, K.W., Constable, P.D. (2007). Veterinary Medicine A Textbook of the Diseases of Cattle, Horses, Sheep, Pigs and Goats. (10^st ed.) Saunders Ltd. london, UK.
25. Rhan, K.D., Grandis, S.A, Clarke, R.C., Curtiss, R. Gyles, C.L. (1992). Amplification of invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol Cell Probes, 6(4), 271-9. http://doi.org/10.1016/0890-8508(92)90002-f
26. Scholz, H.C., Arnold, T., Marg, H., Rösler, U., Hensel, A. (2001). Improvement of an invA-based PCR for specific detection of Salmonella typhimurium in organs of pigs. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 114(9-10), 401-3. PMID: 11570189
27. Tadjbakhsh, F., Rahimi, E., Tadjbakhsh, E. (2013). Prevalence of Salmonella typhimurium in raw milk of cows, sheep and goats supplied in Chaharmahal and bakhtiari province. J Food Protection, 60, 1341–1346
28. Tadjbakhsh, H., Atashparvar, N., Zahraei Salehi, T., Nadalain, M. )2005). Application of combination, immunomagnetic sepration plus multiplex PCR for the drtrction and identification of Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium bovine diarrhoeic fecal samples. J Vet Res, 63(1), 41-46
29. Throns, C.J., Sojka, M.G., Chasey, D. (1990). Detection of novel fimberial structure on surface of Salmonella enteritidis by using a monoclonal antibody. J Clin Microbiol, 28(11), 2409-14. PMID: 1701443
30. Turcotte, C., Woodward, M.J. (1993). Cloning, DNA uneleotic Sequenceand disturbution of the gene encoding the SEF14 fimbrial antigene of Salmonella enteritidis. J Gen Microbiol, 139(7), 1477-85. https://doi/10.1099/00221287-139-7-1477 PMID: 8371111
31. Waltman, W.D., Gast, R.K., Mallinson, E.T. (1998). Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. Swayane, D.E., Glisson, J.R., Jackwood, M.M., Person, J.E., Reed, W.M. (eds.). American Association of Avian Pathogenesis. Pennsylvania, USA. p. 4-13.
32. Woodward, M.J, Kirwan, S.E. (1996). Detection of Salmonella enteritidis in eggs by polymerase chain reaction. Vet Rec, 138(17), 411-3. http://doi.org/10.1136/vr.138.17.411 PMID: 8733179
33. Yang, L., Lou, Y.k., S.U, C.H., Zhang, H., Guan, M., XU., Jan, WEI. R., Chen, J.M., Peng, D.X. (2014). Development of Multiplex PCR for Rapid Identification of Salmonella entreitidis, Salmonella typhimurium, Salmonella gullinarum. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 45(2), 268-273. http://doi.org/10.11843/j.issn.0366-6964.2014.02.015
34. Zahraeisalehi, T., Tadjbakhsh, H., Atashparvar. N., Nadalian, M.G., Mahzounieh, M.R. (2007). Detection and identification of Salomonella typhimurium in bovine diarrhoeic fecal samples by immunomagnetic seraration and multiplex PCR assay. Zoonoses and Public Health, 54(6-7), 231-6. http://doi.org/10.1111/j.1863-2378.2007.01061