سامانه پشتیبانی خدمات اطلاعات

  اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات158
تعداد شماره‌ها6,230
تعداد مقالات67,759
تعداد مشاهده مقاله115,134,079
تعداد دریافت فایل اصل مقاله89,898,501
قاسمی, ستاره, دهقان, محمد مهدی, نیکبخت بروجنی, غلامرضا, مرجانمهر, سیدحسین, وجهی, علیرضا, مخبر دزفولی, محمد رضا, خویی, سپیده, جباری‌فخر, معصومه, کریمی, محمدرضا. (1400). طراحی و تولید نانوذره آهن سوپرپارامغناطیس جهت هدایت مغناطیسی سلول‌های بنیادی مزانشیمی. , 76(2), 224-232. doi: 10.22059/jvr.2019.286113.2952
ستاره قاسمی; محمد مهدی دهقان; غلامرضا نیکبخت بروجنی; سیدحسین مرجانمهر; علیرضا وجهی; محمد رضا مخبر دزفولی; سپیده خویی; معصومه جباری‌فخر; محمدرضا کریمی. "طراحی و تولید نانوذره آهن سوپرپارامغناطیس جهت هدایت مغناطیسی سلول‌های بنیادی مزانشیمی". , 76, 2, 1400, 224-232. doi: 10.22059/jvr.2019.286113.2952
قاسمی, ستاره, دهقان, محمد مهدی, نیکبخت بروجنی, غلامرضا, مرجانمهر, سیدحسین, وجهی, علیرضا, مخبر دزفولی, محمد رضا, خویی, سپیده, جباری‌فخر, معصومه, کریمی, محمدرضا. (1400). 'طراحی و تولید نانوذره آهن سوپرپارامغناطیس جهت هدایت مغناطیسی سلول‌های بنیادی مزانشیمی', , 76(2), pp. 224-232. doi: 10.22059/jvr.2019.286113.2952
قاسمی, ستاره, دهقان, محمد مهدی, نیکبخت بروجنی, غلامرضا, مرجانمهر, سیدحسین, وجهی, علیرضا, مخبر دزفولی, محمد رضا, خویی, سپیده, جباری‌فخر, معصومه, کریمی, محمدرضا. طراحی و تولید نانوذره آهن سوپرپارامغناطیس جهت هدایت مغناطیسی سلول‌های بنیادی مزانشیمی. , 1400; 76(2): 224-232. doi: 10.22059/jvr.2019.286113.2952

طراحی و تولید نانوذره آهن سوپرپارامغناطیس جهت هدایت مغناطیسی سلول‌های بنیادی مزانشیمی

مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)
دوره 76، شماره 2، تیر 1400، صفحه 224-232    اصل مقاله (1.55 M)
نوع مقاله: جراحی، هوشبری و بیماری های اندام حرکتی
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22059/jvr.2019.286113.2952
نویسندگان
ستاره قاسمی1؛ محمد مهدی دهقان* 1؛ غلامرضا نیکبخت بروجنی2؛ سیدحسین مرجانمهر3؛ علیرضا وجهی1؛ محمد رضا مخبر دزفولی4؛ سپیده خویی5؛ معصومه جباری‌فخر4؛ محمدرضا کریمی5
1گروه جراحی و رادیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
2گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
3گروه پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
4پژوهشکده تحقیقات زیست‌پزشکی دانشگاه تهران، دانشگاه تهران، تهران، ایران
5گروه شیمی پلیمر، دانشکده شیمی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران
چکیده
زمینۀ مطالعه: هدایت مغناطیسی سلولی، روشی نوین و غیر تهاجمی جهت توزیع هدفمند سلول در بدن است. این روش به جایگزینی و بقای سلول‌های بنیادی در بافت آسیب دیده کمک می‌کند. یکی از اصلی‌ترین مراحل این روش، اتصال نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس به سلول‌ها است. انتخاب نوع ذرات و روش اتصال آن‌ها به سلول بسیار حائز اهمیت است.
هدف: مطالعه حاضر جهت تولید نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس با قابلیت اتصال به سطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی انجام شد.
روش‎کار: نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس به روش هم رسوبی در اتمسفر نیتروژن، با پلیمر دکستران پوشش داده شدند. سلول‌های بنیادی مزانشیمی، از مغز استخوان بازوی خرگوش سفید نیوزلندی نر اخذ و کشت داده شدند. پادتن تک‌بنیانی CD44 خرگوشی در سطح نانوذرات قرار گرفت و ترکیب نهایی به سطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی متصل شد. پوشش دهی توسط دکستران به روش طیف سنجی مادون قرمز، اندازه نانوذرات توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی، کمیت اتصال پادتن به سطح نانوذرات به روش پروتئین سنجی و اتصال نانوذرات به سطح سلول‌ها با رنگ آمیزی پروسین بلو، ایمونوفلورسنت و میکروسکوپ الکترونی روبشی ارزیابی شدند. برای تمام ارزیابی‌ها حداقل 3 تکرار انجام شد.
نتایج: پیک نمودار طیف سنجی مادون قرمز در cm-1 3200 و 2922 نشان دهنده حضور دکستران در ترکیب نهایی است. قطر متوسط ذرات 67/6±13/56 نانومتر اندازه‌گیری شد. متوسط کمیت اتصال پادتن به سطح نانوذرات 35/6±78/77 درصد محاسبه شد. میانگین درصد سلول‌های بنیادی مزانشیمی که در رنگ آمیزی پروسین بلو و تصویربرداری ایمیونوفلورسنت به ترکیب نهایی متصل بودند به ترتیب 53/2±57/71 و 95/0±04/95 بود. این اتصال در تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی نیز تأیید شد.
نتیجه­گیری نهایی: بر اساس نتایج بدست آمده در مطالعه حاضر، سلول‌های بنیادی مزانشیمی به خوبی به نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس متصل به پادتن CD44 متصل شدند. این ترکیب جهت ارزیابی‌های آزمایشگاهی و بالینی، قابل استفاده است.
کلیدواژه‌ها
هدایت مغناطیسی سلول؛ دکستران؛ پادتن تک‌بنیانی؛ پادتن CD44؛ نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس
عنوان مقاله [English]
Fabrication of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Cell Targeting Purposes
نویسندگان [English]
Setareh Ghasemi1؛ Mohammad Mehdi Dehghan1؛ Gholamraza Nikbakhat Brujeni2؛ Seyed Hosein Mardjanmehr3؛ Alireza Vajhi1؛ Mohammad Reza Mokhber Dezfouli4؛ Sepideh Khoee5؛ Massoumeh Jabbari Fakhr4؛ Mohammad Reza Karimi5
1Department of Veterinary Surgery and Radiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
2Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
4Institute of Biomedical Research, University of Tehran, Tehran, Iran
5Department of Polymer, Faculty of Chemistry, College of Sciences, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]
BACKGROUND: Magnetic cell targeting is a novel non-invasive cellular delivery technique. It improves stem cell delivery to and retention in the injury site. Labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION) is one of the most important steps of this technique. Appropriate SPIONs selection is believed to be of vital importance.
OBJECTIVES: The current study aimed to produce SPIONs which are capable of attaching to Mesenchymal stem cells surface (MSCs).
METHODS: Dextran coated SPIONs were produced following co-precipitation method under N2 atmosphere. Bone marrow derived MSCs were isolated and cultured from rabbit humerus bone. Anti-rabbit CD44 monoclonal antibody was attached to the surface of SPIONs and MSCs and were labeled with this final product. SPIONs coating process, particle size, and antibody conjugation efficacy were evaluated using FT-IR, SEM, and Bradford protein measurement assay, respectively. Attachment of antibody-linked dextran coated SPIONs to MSCs was accessed utilizing Prussian blue staining, immunofluorescence analysis, and SEM analysis.
RESULTS: Peaks of FT-IR at 3200 cm-1 and 2922 cm-1 are representative of dextran. The average particle size was 56.13±6.67. The average antibody-SPION conjugation ratio was 77.78±6.35%. The average percentage of the labeled cells in Prussian blue and IF analysis were 71.57±2.53 and 95.04±0.95, respectively. MSCs-SPIONs conjugation was also confirmed via SEM analysis.
CONCLUSIONS: In conclusion, it could be inferred that mesenchymal stem cells could successfully be labeled with dextran coated-anti CD44 antibody conjugated- superparamagnetic Iron oxide nanoparticles. This product could be used for further in-vitro and in-vivo evaluations.
کلیدواژه‌ها [English]
Magnetic targeting, SPIONs, Dextran, Monoclonal antibody, Anti CD44 antibody
اصل مقاله

مقدمه

 

هدایت مغناطیسی سلولی یک روش جدید و نوید بخش برای رساندن هر چه مؤثرتر سلول‌ها به کانون بافت آسیب دیده می‌باشد (23). این روش طی 20 سال اخیر جهت ارتقای  توزیع و احتباس سلول‌ها در بافت هدف به کار رفته است و مکمل تزریق سیستمیک سلول‌های درمانی است. هدایت مغناطیسی سلول بر دو مرحله اصلی استوار است، شامل: اتصال ذرات آهنربایی به سلول و اعمال میدان مغناطیسی بر بافت هدف تا سلول‌های متصل به ذرات آهنربایی را پس از تزریق گیر انداخته و در بافت هدف نگه دارد. از میان همه اجزای آهنربایی موجود، نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس (SPIONs)، کاربردی‌ترین گزینه برای هدایت مغناطیسی هستند. چند دلیل برای این امر وجود دارد که عبارتند از: قیمت مناسب، در دسترس بودن، زیست سازگاری، جذب سلولی قابل تنظیم و سمیت کم (6).

ذرات اکسید آهن با ابعاد نانو ویژگی‌هایی دارند که کار کردن با آن‌ها را دشوار می‌کند؛ از جمله: ناپایداری ذاتی در مجاورت هوا که باعث اکسید شدن آن‌ها می‌شود. به علاوه، از آنجایی که آهن به شکل فیزیولوژیک در بدن وجود دارد، بدن قادر به متابولیسم و حذف آن از بافت هدف می‌باشد. غلظت بالای یون آهن قادر به عبور از دیواره میتوکندری و هسته بوده و سمی است؛ و آهن آزاد در میتوکندری قادر به تولید رادیکال‌های هیدروکسیل و یون‌های فریک است که به شدت واکنش دهنده و مخرب هستند (8،18،25). در نتیجه به منظور به حداقل رساندن این ویژگی‌ها، هسته‌های آهن را به کمک پلیمر‌های ارگانیک یا غیر ارگانیک پوشش می‌دهند. بدین ترتیب، علاوه بر افزایش زیست سازگاری این ذرات، امکان اتصال لیگاند‌های مختلف از جمله پادتن به سطح آن‌ها فراهم می‌شود (7).

اگرچه مطالعات زیادی در خصوص پوشش‌های مختلف SPIONs انجام شده است (اکسیدان‌های ضعیف، سورفاکتانت، فلزات گران بها، سیلیکا، پوشش‌های کربنی، سلولز، چیتوزان)، عمده آن‌ها بر سه پوشش اصلی تمرکز دارند که عبارتند از: نشاسته، پلی اتیلن گلایکول (PEG) و دکستران که هر یک ویژگی‌هایی دارند. لیکن خصوصیت مشترک آن‌ها، افزایش زیست سازگاری و پایداری نانوذرات و کاهش سمیت آن‌هاست (7،8،25).

در این میان، دکستران به دلیل زیست سازگاری بالا، به شکل گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته است و SPIONs پوشش داده شده با دکستران (DSPIONs) در ترکیب دارو‌های تجاری مورد تأیید سازمان غذا و دارو (FDA) و خصوصاً به عنوان مواد حاجب تصویر برداری MRI وجود دارند (7). همچنین، DSPIONs قابلیت تغییر سطح دارند که می‌توان پادتن، پپتید و مشتقات کوچک مولکول را به آن‌ها متصل کرد، نیمه عمر آن‌ها در جریان خون مناسب است و زیست‌ سازگارند (7،27).

هدف اکثر مطالعات پیشین در زمینه هدایت مغناطیسی سلول، وارد کردن نانوذرات اکسید آهن به داخل سیتوپلاسم سلول‎ها از طریق انتقال غیر فعال و اندوسیتوز (فاگوسیتوز و ماکروپینوسیتوز) بوده است (7). در حال حاضر تمرکز محققین به جای  اندوسیتوز نانوذرات،   بر اتصال نانوذرات به سطح سلول‎ها است، زیرا در اندوسیتوز احتمال آزاد شدن آهن در داخل سلول وجود دارد که خود مانع مهمی برای زیست‌سازگار‌پذیری روش است (2،5،26).

 هدف از انجام مطالعه حاضر تولید نانوذره آهن پوشش داده شده با دکستران و متصل به پادتن تک‌بنیانی است که قادر به اتصال به سطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی هستند. پوشش دهی دکستران، اندازه نانوذرات، کمیت اتصال پادتن به سطح نانوذرات و اتصال نانوذرات به سطح سلول‌های هدف مورد ارزیابی قرار گرفتند.

مواد و روش کار

تولید و پوشش‌دهی SPIONs با دکستران: در مطالعه حاضر، نانوذرات مگنتیت (Fe3O4) با روش هم رسوبی (Co-precipitation) در اتمسفر نیتروژن تولید شدند. بدین ترتیب که نمک‌های FeCl2 و FeCl3 (نسبت مولی 1:2) در آب دیونیزه (DIW) حل شدند. سپس محلول دکستران در DIW اضافه و به شدت در اتمسفر نیتروژن هم زده شدند. پس از آن محلول آمونیاک 25 درصد به ترکیب اضافه شد و ترکیب به مدت 30 دقیقه در دمای 60-70 درجه سانتی گراد قرار گرفت. در نهایت برای جداسازی پلیمر اضافه و سایر ناخالصی‎ها، ترکیب نهایی در معرض دیالیز قرار گرفت. محلول مغناطیسی نهایی در g 3500 به مدت 15-10 دقیقه سانتریفیوژ شد تا مایع مغناطیسی خالص به دست آید. pH ترکیب نهایی4/7-2/7 بود (22). موفقیت پوشش دهی با دکستران به کمک طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) مورد بررسی قرار گرفت. همچنین ابعاد ذرات DSPIONs به وسیله میکروسکوپ الکترونی روبشی ((SEM), Hitachi, S4160) اندازه گیری شد.

اتصال پادتن به سطح DSPIONs: به منظور اتصال DSPIONs به سطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی، از پادتن تک‌بنیانی mouse anti rabbit CD44 monoclonal antibody (BioRad, MCA806GA) استفاده شد. در سطح سلول‌های رده‌های مختلف سلولی، مارکر‌های اختصاصی وجود دارد و CD44 به عنوان یک مارکر فنوتیپی مثبت MSCs شناخته شده است. اتصال پادتن‌ها به سطح  DSPIONsبر اساس روش Chen و همکاران در سال 2006 صورت گرفت (3). بر این اساس، 75/0 میلی‌گرم از DSPIONs در 5/0 میلی لیتر محلول نمک فسفات با خاصیت بافری (PBS، 4/7=pH) حل شد. سپس 15 میکروگرم سدیم متا-پریدات اضافه و ترکیب در دمای اتاق در تاریکی به مدت 5 ساعت روی همزن مغناطیسی انکوبه شد. در مرحله بعد، 50 میکروگرم پادتن CD44 به DSPIONs فعال اضافه و محلول به مدت 16 ساعت در تاریکی در دمای 4 درجه سانتی‌گر‌اد انکوبه شد. احیاء ترکیب نهایی با اضافه کردن 15 میکروگرم سدیم سیانوبوروهیدرید در تاریکی و در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت صورت گرفت. در نهایت نانوذرات DSPIONs متصل به پادتن (ADSs) به کمک آهنربا در کف ویال نگه داشته و محلول رویی تخلیه شد و جهت سنجش کیفیت اتصال مورد ارزیابی قرار گرفت. این واکنش 4 مرتبه تکرار شد.

ارزیابی روند تولید ADSs: جهت ارزیابی کمی اتصال نانوذرات آهن به پادتن از روش اسپکتروفوتومتری با معرف برادفورد استفاده شد. بدین منظور، نمودار استاندارد طبق دستور العمل کیت پروتئین سنجی برادفورد (کالازیست) ترسیم و پروتئین سنجی در محلول رویی تولید شده که حاوی پادتن‌های آزاد (غیر متصل به نانوذرات) بود، در طول موج 595 نانومتر انجام شد (Eppendorf, Netheler, Hinz GmbH, 613101427).  میزان پادتن متصل به نانوذرات آهن در هر مرحله، از تفاضل مقدار پروتئین موجود در محلول رویی از مقدار کلی آنتی‌بادی مورد استفاده محاسبه شد (5).

استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: جهت استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی، از رهیافت استاندارد مورد استفاده در پژوهشکده تحقیقات زیست پزشکی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران استفاده شد (12). بدین منظور، نمونه مغز استخوان از استخوان بازو خرگوش سفید نیوزلندی نر بالغ با وزن تقریبی 5/2 تا 3 کیلوگرم اخذ شد. به ازای هر 3 میلی‌لیتر مغز استخوان، 1000 واحد هپارین مورد استفاده قرار گرفت. سپس نمونه‌ها به آزمایشگاه سلول‌های بنیادی و مهندسی بافت دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران منتقل و روند استخراج سلولی در شرایط آسپتیک ادامه یافت. نمونه‌ها با حجم مساوی DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) مخلوط شدند. بعد از جداسازی لخته‌های احتمالی موجود، به شکل دو فاز روی فایکول ریخته شدند و به مدت 30 دقیقه در سانتریفیوژ g 400 قرار گرفتند. بدین ترتیب سلول‌های تک هسته‌ای از گلبول‌های قرمز جدا شد و پس از مخلوط شدن با DMEM، 2 بار و هر مرتبه به مدت 5 دقیقه در g 400 سانتریفیوژ شدند. در نهایت محلول رویی حذف شد و پلت سلولی حاصل در محیط حاوی 80 درصد DMEM، 20 درصد FBS (Fetal Bovine Serum) و 1 درصد آنتی بیوتیک پنیسیلین استرپتومایسین در فلاسک 25 سانتی متر مربع، در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد دی اکسید کربن و 97 درصد رطوبت مورد کشت قرار گرفت. سلول‌‌ها تا پاساژ سوم کشت داده شدند و ماهیت مزانشیمی آن‌ها با استفاده از پادتن‌های فایکواریترین- کنژوگه متمایل به CD45، CD90، CD34 و CD29 مورد بررسی قرار گرفت. همچنین توان تمایز این سلول‌ها به رده استخوانی، غضروفی و چربی مورد سنجش قرار گرفت (17).

اتصال ADSs به MSCs: بدین منظور، 1 سی سی تریپسین روی سلول‌های فلاسک 25 سانتی متر مربع ریخته شد و فلاسک به مدت 3 دقیقه در انکوباتور قرار گرفت. پس از اطمینان از جدا شدن سلول‌ها از کف فلاسک، از 20 درصد FBS برای خنثی کردن تریپسین استفاده شد. سلول‌ها به مدت 30 دقیقه در معرض ADSs با غلظت 60 میکروگرم آهن به ازای 106 سلول در انکوباتور قرار داده شدند و در این مدت 4-3 مرتبه روی لرزاننده قرار گرفتند.

ارزیابی ترکیب MSCs-ADSs: جهت بررسی و تأیید اتصال ADSs به MSCs از سه روش ارزیابی رنگ آمیزی اختصاصی آهن پروسین بلو، آنالیز ایمونوفلورسنت و ارزیابی SEM استفاده شد.

رنگ آمیزی اختصاصی آهن: تعداد 50000 سلول در هر گوده از پلیت 6 گوده قرار گرفت و پس از 24 ساعت (ایجاد چسبندگی به کف گوده‌ها)، سه گروه کنترل منفی، DSPION و ADS در نظر گرفته شد. در گروه‌های DSPIONs و ADS، سلول‌ها به مدت 30 دقیقه در معرض ترکیب‌های هم نام با غلظت 60 میکروگرم آهن به ازای 106 سلول (حجم نهایی 500 میکرولیتر در PBS) انکوبه شدند و در گروه کنترل حجم مشابه PBS اضافه شد. برای هر گروه سه تکرار در نظر گرفته شد. در نهایت، شست و شو با PBS صورت گرفت و سلول‌ها در پارافرمالدهید 4 درصد تثبیت شدند. رنگ آمیزی اختصاصی Prussian Blue که در آن سیتوپلاسم سلول‌ها به رنگ صورتی و رسوبات آهن به رنگ آبی دیده می‌شوند انجام شد (13). تعداد هسته‌ها در یک نمای میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40× شمارش و درصد سلول‌های متصل به ذرات آهن تخمین زده شد. این اندازه‌گیری سه مرتبه تکرار شد.

آنالیز ایمونوفلورسنت: جهت انجام این بررسی، پس از تریپسینه کردن سلول‌ها، پلت سلولی روی لام گسترش داده شد و تثبیت با استون 80 درصد در DIW، به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد صورت گرفت. سپس سلول‌ها 3 مرتبه با PBS شسته شدند و به مدت 30 دقیقه در معرض ADS قرار گرفتند. در نهایت پس از شست و شو با PBS، آنتی‌بادی ثانویه FITC Goat anti mouse antibody (Abcam, Ab6785) با رقت 2000/1 در تاریکی به سطح گسترش اضافه و 20 دقیقه زمان داده شد. در نهایت شست و شو با PBS انجام و سلول‌ها توسط میکروسکوپ فلورسنت (Olympus Optical Co; LTD, BH2-RFL-T3) دیده شدند. درصد سلول‌هایی که رنگ فلورسنت را نشان می‎دادند، در سه نمای میکروسکوپ با بزرگ نمایی 40 محاسبه شد.

آنالیز SEM: سلول‌های تریپسینه شده به مدت 30 دقیقه در معرض ADS قرار گرفتند و پس از طی مراحل آماده سازی طبق دستورالعمل‌های استاندارد مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک (IBB) دانشگاه تهران، از آنالیز SEM جهت به تصویر کشیدن ترکیب MSCs-ADSs استفاده شد.

نتایج

بررسی ابعاد نانوذرات و موفقیت پوشش دهی با دکستران: به منظور بررسی پوشش دهی نانوذرات آهن با دکستران، FT-IR اسپکتروسکوپی انجام شده و ساختار شیمیایی نانوذرات با توجه به حضور گروه‌های شیمیایی مربوطه در ترکیب مورد مطالعه به تأیید رسید. فرکانس ارتعاشی کششی Fe-O در ترکیب Fe3O4، به شکل یک قله در cm-1 588 نشان داده شده است. همچنین، قله‌های cm-13200 و cm-1 2922 به ترتیب نشان دهنده فرکانس ارتعاشی کششی هیدروکسیل و C-H دکستران هستند. نواری که در ناحیه cm-1 1608 دیده می‎شود نشان دهنده پیوند هیدروژنی بین آب و دکستران است. (تصویر .A1) قطر تقریبی نانوذرات پوشش داده شده با دکستران به کمک میکروسکوپ الکترونی SEM  حدود 67/6±13/56 نانومتر اندازه‌گیری شد (تصویر .B1).

ارزیابی میزان اتصال پادتن به DSPIONs: تولید ترکیب ADSs در 4 مرحله و هر مرتبه با 50 میکروگرم آنتی‌بادی اولیه انجام شد. بر اساس نتایج سنجش با استفاده از معرف برادفورد، متوسط درصد پادتن متصل به DSPIONs، معادل 35/6±57/77 اندازه‌گیری شد.

اتصال ADSs به سلول‌های بنیادی مزانشیمی: در رنگ‌آمیزی اختصاصی آهن، حضور آهن در گوده‌های گروه ADS به خوبی قابل مشاهده بود و به طور میانگین، از هر 100 سلول، رنگ آبی نانوذرات آهن در مجاورت 53/2±57/71 سلول دیده ‌شد. همچنین در گوده‌های DSPION نیز مقادیر کمی رسوب آهن به شکل تجمع کانونی در چند قسمت از پلیت وجود داشت. لیکن در گروه کنترل هیچ ذره آهنی دیده نشد (تصویر 2). تصاویر آنالیز ایمونوفلورسنت هم حضور آنتی بادی‌های مربوطه در سطح سلول‌ها را با کیفیت اتصال 95/4±0/95 درصدی نشان داد (تصویر 3). همچنین اتصال ADSs به MSCs توسط میکروسکوپ الکترونی SEM به تصویر کشیده شد (تصویر 4).

بحث

در موضوع هدایت مغناطیسی سلولی، ابعاد ذره و شیمی لایه پوشاننده آن عوامل مهمی در توانایی اتصال ذرات به سلول هستند (6). در این مطالعه، نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیس تولید و توسط پلیمر دکستران پوشش داده شدند. موج‌هایی که در نمودار FT-IR مشاهده می‌شود هر یک نشان دهنده حضور پیوند شیمیایی مشخصی است. بنابر نتایج، در نمودار ترکیب تولید شده در این مطالعه، علاوه بر موج ناحیه cm-1 588 که نشان دهنده فرکانس ارتعاشی Fe-O و در واقع تأیید حضور آهن است، موج‌های نواحی cm-1 3200، cm-1 2922 و cm-1 1608 به ترتیب به حضور پیوند‌های هیدروکسیل، C-H و پیوند هیدروژنی آب-دکستران دلالت دارند و همگی پوشش دهی نانوذرات با دکستران را تأیید می‌کنند. همچنین، در این مطالعه، میانگین اندازه ذرات ADSs حدود 67/6±13/56 نانومتر اندازه‌گیری شد. در بسیاری از مطالعات اندازه بهینه ذرات برای ورود به سلول‌های غیر فاگوسیت کننده، 20 تا 100 نانومتر بیان شده است (6). در مطالعه‌ای که Cheng و همکاران در سال 2014 با هدف اتصال نانوذرات به سطح سلول انجام دادند، فروموکسیتول (یک مکمل آهن تجاری جهت درمان کم خونی ناشی از فقر آهن در بیماران مزمن کلیوی با نام تجاری Feraheme®) به عنوان منشأ نانوذرات آهن پوشش داده شده با دکستران مورد استفاده قرار گرفت که اندازه تقریبی آن حدود 50 نانومتر بود (5). اندازه ذرات ADSs تولید شده در این مطالعه با موارد فوق هم خوانی دارد و در مقایسه با اندازه ذرات در مطالعه Chen و همکاران در سال 2013 که برای اتصال نانوذرات آهن به سطح سلول‌ها از پوشش پلی اتیلن گلایکول در سطح نانوذرات استفاده کردند، کوچک‌تر است. اندازه ذرات مورد استفاده در مطالعه آن‌ها در دامنه 90 تا 100 نانومتر قرار داشت (2).

سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) بهترین منشأ سلول پیشگام برای درمان‌های مبتنی بر سلول هستند و بنیاد طب بازساختی (regenerative medicine) را تشکیل می‌دهند (7،23). در این مطالعه نانوذرات آهن با تمایل اتصال به MSCs تولید شدند و بدین منظور پادتن تک‌بنیانی CD44 با کارآمدی 35/6±57/77 درصدی در سطح ADSs قرار گرفت. این مقدار در مطالعه  Cheng و همکاران در سال 2014 که پادتن CD34 را به کمک کیت اختصاصی Poly-link protein coupling kit به سطح نانوذرات فروموکسیتول متصل کردند، 80 درصد گزارش شد (5).

در نهایت اتصال ADSs به MSCs به کمک رنگ آمیزی پروسین بلو، ارزیابی ایمونوفلورسنت و تصاویر SEM به تأیید رسید. به طور مشابه، Sugioka و همکاران در سال 2007، از پادتن CD44 رت استفاده کرده و آن‌ها را به سطح یک بستر متشکل از ذرات مغناطیسی کوچک اندازه (ferri sphere 100®) متصل کردند. بدین ترتیب سلول‌های MSC رت را به سطح بستر مغناطیسی وصل کردند (26). Cheng و همکاران در سال 2014، از سلول‌های رده هماتوپویتیک (HSC) استفاده کردند و جهت نشانه‌گذاری آن‌ها از اتصال پادتن CD34 که اختصاصی این رده سلولی است در سطح SPIONs پوشش داده شده با دکستران استفاده کردند. بر اساس نتایج رنگ آمیزی پروسین بلو و ایمونوفلورسنت، HSCs به خوبی به نانوذرات متصل شدند (5). Chen و همکاران در سال 2013، از پوشش پلی اتیلن گلایکول در سطح نانوذرات استفاده کردند و همانند Cheng، پادتن CD34 را در سطح آن‌ها متصل کردند. با این وجود، نتایج آن‌ها هم حاکی از نشانه‌گذاری موفقیت آمیز HSC توسط این ذرات بود (2).

به دلیل ویژگی‌های بیولوژیک SPIONs، ایده هدایت مغناطیسی شکل گرفت و در ابتدا راهکاری برای رساندن مواد مختلف از جمله دارو، پادتن و توکسین به ساختارهای هدف خود بود (1،10،15،16،28). از این روش برای مقاصد درمانی مثل هایپرترمی القایی با آهن‌ربا جهت درمان تومورهای بدخیم (11)، یا تشخیصی مثل تشخیص زود هنگام سرطان پروستات (1) استفاده ‌شد. با پیشرفت دانش و فنون زیست پزشکی، هدایت مغناطیسی سلولی مورد توجه محققین قرار گرفت و در دهه اخیر مطالعات بسیاری در این راستا صورت گرفته است (3،4،9،12،13،14،19،24،26،29). اکثر مطالعات انجام شده بر وارد کردن نانوذرات به داخل سلول‌ها تمرکز دارند، در حالی‌که با اتصال نانوذرات به سطح سلول می‌توان از آزاد شدن آهن به داخل آن‌ها پیش‌گیری و زیست سازگاری نانوذرات را افزایش داد (2،5،26). همچنین از این طریق، امکان اتصال هم زمان لیگاندهای متفاوت به سطح نانوذرات فراهم می‌شود (2،27).

با توجه به نتایج ذکر شده، ترکیب نهایی حاصل از پوشش دهی نانوذرات سوپرپارامغناطیس آهن توسط دکستران و اتصال پادتن CD44 به سطح آن، به خوبی قادر به اتصال به سلول‌های بنیادی مزانشیمی است. در ادامه می‌توان از این محصول جهت مطالعات بعدی در خصوص زیست سازگاری و سایر ارزیابی‌های in-vitro و in-vivo مربوط به هدایت مغناطیسی به شکل ابزار هدایت مغناطیسی سلول بهره برد.

سپاسگزاری

بدین وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه تهران جهت تأمین بخشی از هزینه‌های این طرح در قالب رساله دکتری تخصصی، از پژوهشکده تحقیقات زیست پزشکی واقع در دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، جهت تأمین بخش عمده هزینه‌ها و در اختیار قرار دادن تمام مواد و لوازم و تسهیلات مورد نیاز جهت انجام بخش سلولی مطالعه حاضر و نیز از آزمایشگاه شیمی پلیمر واقع در دانشکده شیمی پردیس علوم پایه دانشگاه تهران جهت همکاری در تولید ترکیب نانوذرات آهن سوپرپارامغناطیس تشکر به عمل می‌آید. همچنین از حمایت مالی پارک علم و فناوری دانشگاه تهران از این مطالعه در قالب اعتبار شماره 5441574 قدردانی می‌گردد.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

مراجع

References

 

  1. Abdolahi, M., Shahbazi‐Gahrouei, D., Laurent, S., Sermeus, C., Firozian, F., Allen, B.J., Boutry, S., Muller, R.N. (2013). Synthesis and in vitro evaluation of MR molecular imaging probes using J591 mAb‐conjugated SPIONs for specific detection of prostate cancer. Contrast Media Mol Imaging, 8(2), 175-184. https://doi.org/10.1002/cmmi.1514 PMID: 23281290
  2. Chen, J., Huang, N., Ma, B., Maitz, M.F., Wang, J., Li, J., Li, Q., Zhao, Y., Xiong, K., Liu, X. (2013). Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Appl Mater Interfaces, 5(13), 5976-5985. https://doi.org/10.1021/am400249n PMID: 23749081
  3. Chen, J., Wu, H., Han, D., Xie, C. (2006). Using anti-VEGF McAb and magnetic nanoparticles as double-targeting vector for the radioimmunotherapy of liver cancer. Cancer Lett, 231(2), 169-175. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2005.01.024 PMID: 16399221
  4. Cheng, K., Malliaras, K., Li, T.S., Sun, B., Houde, C., Galang, G., Smith, J., Matsushita, N., Marbán, E. (2012). Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant, 21(6), 1121-1135. https://doi.org/10.3727/096368911X627381 PMID: 22405128
  5. Cheng, K., Shen, D., Hensley, M.T., Middleton, R., Sun, B., Liu, W., De Couto, G., Marbán, E. (2014). Magnetic antibody-linked nanomatchmakers for therapeutic cell targeting. Nat Commun, 5, 4880. https://doi.org/10.1038/ncomms5880 PMID: 25205020
  6. Connell, J.J., Patrick, P.S., Yu, Y., Lythgoe, M.F., Kalber, T.L. (2015). Advanced cell therapies: targeting, tracking and actuation of cells with magnetic particles. Regen Med, 10(06), 757-772. https://doi.org/10.2217/rme.15.36 PMID: 26390317
  7. Cores, J., Caranasos, T., Cheng, K. (2015). Magnetically targeted stem cell delivery for regenerative medicine. J Funct Biomater, 6(3), 526-546. https://doi.org/10.3390/jfb6030526 PMID: 26133387
  8. Cortajarena, A.L., Ortega, D., Ocampo, S.M., Gonzales-Garcia, A., Couleaud, P., Miranda, R., Belda-Iniesta, C., Ayuso-Sacido, A. (2014). Engineering iron oxide nanoparticles for clinical settings. Nanobiomedicine (Rij), 1. https://doi.org/10.5772/58841 PMID: 30023013
  9. El Haj, A.J., Glossop, J.R., Sura, H.S., Lees, M.R., Hu, B., Wolbank, S., van Griensven, M., Redl, H., Dobson, J. (2015). An in vitro model of mesenchymal stem cell targeting using magnetic particle labelling. J Tissue Eng Regen Med, 9(6), 724-733. https://doi.org/10.1002/term.1636 PMID: 23281176
  10. Friedman, D.A., Claypool, S.E., Liu, R. (2013). The smart targeting of nanoparticles. Curr Pharm Des, 19(35), 6315-6329. PMID: 23470005
  11. Gupta, A.K., Gupta, M. (2005). Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials, 26(18), 3995-4021. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2004.10.012 PMID: 15626447
  12. Harrison, R., Markides, H., Morris, R.H., Richards, P., El Haj, A.J., Sottile, V. (2017). Autonomous magnetic labeling of functional mesenchymal stem cells for improved traceability and spatial control in cell therapy applications. J Tissue Eng Regen Med, 11(8), 2333-2348. https://doi.org/10.1002/term.2133 PMID: 27151571
  13. Heymer, A., Haddad, D., Weber, M., Gbureck, U., Jakob, P.M., Eulert Nöth, U. (2008). Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials, 29(10), 1473-1483. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2007.12.003 PMID: 18155133
  14. Kamei, N., Ochi, M., Adachi, N., Ishikawa, M., Yanada, S., Levin, L.S., Kamei, G., Kobayashi, T. (2018). The safety and efficacy of magnetic targeting using autologous mesenchymal stem cells for cartilage repair. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 26(12), 3626-3635. https://doi.org/10.1007/s00167-018-4898-2 PMID: 29549388
  15. Misri, R., Meier, D., Yung, A.C., Kozlowski, P., Häfeli, U.O. (2012). Development and evaluation of a dual-modality (MRI/SPECT) molecular imaging bioprobe. Nanomedicine, 8(6), 1007-1016. https://doi.org/10.1016/j.nano.2011.10.013 PMID: 22100757
  16. Mok, H., Zhang, M. (2013). Superparamagnetic iron oxide nanoparticle-based delivery systems for biotherapeutics. Expert Opin Drug Deliv, 10(1), 73-87. https://doi.org/10.1517/17425247.2013.747507 PMID: 23199200
  17. Mokhber Dezfouli, M.R., Jabbari Fakhr, M., Sadeghian Chaleshtori, S., Dehghan, M.M., Vajhi, A., Mokhtari, R. (2018). Intrapulmonary autologous transplant of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells improves lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rabbit. Crit Care, 22(1), 353. https://doi.org/10.1186/s13054-018-2272-x PMID: 30572913
  18. Ordidge, K. L., Gregori, M., Kalber, T.L., Lythgoe, M.F., Janes, S.M., Giangreco, A. (2014). Coupled cellular therapy and magnetic targeting for airway regeneration. Biochem Soc Trans, 42(3), 657-661. https://doi.org/10.1042/BST20140089 PMID: 24849234
  19. Oshima, S., Ishikawa, M., Mochizuki, Y., Kobayashi, T., Yasunaga, Y., Ochi, M. (2010). Enhancement of bone formation in an experimental bony defect using ferumoxide-labelled mesenchymal stromal cells and a magnetic targeting system. J Bone Joint Surg Br, 92(11), 1606-1613. https://doi.org/10.1302/0301-620X.92B11.23491 PMID: 21037362
  20. Oshima, S., Kamei, N., Nakasa, T., Yasunaga, Y., Ochi, M. (2014). Enhancement of muscle repair using human mesenchymal stem cells with a magnetic targeting system in a subchronic muscle injury model. J Orthop Sci, 19(3), 478-488. https://doi.org/10.1007/s00776-014-0548-9 PMID: 24562652
  21. Panseri, S., Montesi, M., Sandri, M., Iafisco, M., Adamiano, A., Ghetti, M., Cenacchi, G., Tampieri, A. (2016). Magnetic labelling of mesenchymal stem cells with iron-doped hydroxyapatite nanoparticles as tool for cell therapy. J Biomed Nanotechnol, 12(5), 909-921. PMID: 27305814
  22. Pradhan, P., Giri, J., Banerjee, R., Bellare, J., Bahadur, D. (2007). Cellular interactions of lauric acid and dextran-coated magnetite nanoparticles. J Magn Magn Mater, 311(1), 282-287.
  23. Qi, Y., Yang, Z., Ding, Q., Zhao, T., Huang, Z., Feng, G. (2016). Targeted transplantation of iron oxide‑labeled, adipose‑derived mesenchymal stem cells in promoting meniscus regeneration following a rabbit massive meniscal defect. Exp Ther Med, 11(2), 458-466. https://doi.org/10.3892/etm.2015.2944 PMID: 26893631
  24. Riegler, J., Liew, A., Hynes, S.O., Ortega, D., O’Brien, T., Day, R.M., Richards, T., Sharif, F., Pankhurst, Q.A. Lythgoe, M.F. (2013). Superparamagnetic iron oxide nanoparticle targeting of MSCs in vascular injury. Biomaterials, 34(8), 1987-1994. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.11.040 PMID: 23237516
  25. Sheng-Nan, S., Chao, W., Zan-Zan, Z., Yang-Long, H., Venkatraman, S.S., Zhi-Chuan, X. (2014). Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis and surface coating techniques for biomedical applications. Chin. Phys. B, 23(3), 037503. https://doi.org/10.1088/1674-1056/23/3/037503
  26. Sugioka, T., Ochi, M., Yasunaga, Y., Adachi, N., Yanada, S. (2008). Accumulation of magnetically labeled rat mesenchymal stem cells using an external magnetic force, and their potential for bone regeneration. J Biomed Mater Res A, 85(3), 597-604. https://doi.org/10.1002/jbm.a.31493 PMID: 17806114
  27. Tang, J., Shen, D., Zhang, J., Ligler, F.S., Cheng, K. (2015). Bispecific antibodies, nanoparticles and cells: bringing the right cells to get the job done. Expert Opin Biol Ther, 15(9), 1251-1255. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.1049944 PMID: 26004388
  28. Veiseh, O., Gunn, J.W., Zhang, M. (2010). Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv Drug Deliv Rev, 62(3), 284-304. https://doi.org/10.1016/j.addr.2009.11.002 PMID: 19909778
  29. Wang, H.H., Wang, Y.X.J., Leung, K.C.F., Au, D.W., Xuan, S., Chak, C.P., Lee, S.K., Sheng, H., Zhang, G., Qin, L. (2009). Durable mesenchymal stem cell labelling by using polyhedral superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Chemistry, 15(45), 12417-12425. https://doi.org/10.1002/chem.200901548 PMID: 19834937



آمار
تعداد مشاهده مقاله: 909
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 279


سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب