مقدمه

شنبلیله با نام علمی Trigonella foenum-graecum گیاهی دو لپه، متعلق به راسته­ گل سرخ[1]، تیره­ نخود[2] و جنس Trigonella  است (Srinivasan, 2006). این گیاه دارای خاصیت ضد کلسترول و کاهنده­ قند خون، ضد التهاب، سرطان و نفخ، ملین، تب­بر و انگل­کش می­باشد (Mehrafarin et al., 2011). مهم­ترین خاصیت دارویی این گیاه به­علت وجود ماده موثره دایوسجنین است (Joanna Ciura et al., 2015). دایوسجنین برای اولین بار در سال 1936، از گیاه Dioscorea tokoro ژاپنی جداسازی شد
 (Fujii & Matsukawa,1936) و در درمان بیماری‌های متابولیکی مانند چاقی، دیابت، کلسترول و چربی خون بالا، التهاب و سرطان موثر می­باشد (Upadhyay et al., 2014).

گیاهان پاسخ­های فیزیولوژیکی، مورفولوژیکی و مولکولی متفاوتی نسبت به تنش­های زیستی و غیرزیستی از خود نشان می­دهند (Patel et al., 2013)، به­طوری‌که برای حفاظت از خود در برابر تنش‌ها، از سیستم‌های پاکسازی­کننده رادیکال­های آزاد شامل آنزیم‌های آنتی­اکسیدان (سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز) و همچنین ترکیبات غیرآنزیمی (کاروتنوئیدها و اسید آسکوربیک) استفاده می­کنند (Hussain et al., 2012). تنش­های محیطی منجر به کاهش رشد و عملکرد گیاهان زراعی می­شوند؛ بنابراین شناسایی و بررسی پاسخ و سازوکارهای دفاعی گیاهان نسبت به تنش­های محیطی، در تولید و اصلاح گیاهان زراعی ضروری می­باشد (Des Marais, 2013). تنش دمایی منجر به ایجاد تغییراتی در بیان ژن­های درگیر در محافظت از تنش می‌شود. این ژن­ها، مسئول بیان اسموپروتئین­ها، آنزیم‌های سم­زدا و پروتئین­های تنظیم­کننده هستند. اخیرا، کاربرد خارجی ترکیبات محافظت­کننده از قبیل اسموپروتئین­ها Morgutti et al., 2019)
 Annunziata et al., 2019; Estaji et al., 2019;)، فیتوهورمون­ها (Sharma, 2019; Sytar et al., 2019)، مولکول_­های پیام­رسان (نیتریک اکسید)، پلی آمین­ها (El Amrani et al., 2019; Xu et al., 2019) در مقابله با آسیب ناشی از تنش در گیاهان گزارش شده است.

 براسینواستروئیدها، گروهی از هورمون­های استروئیدی هستند که در بسیاری از فرآیندهای نموی در گیاهان از قبیل تقسیم و رشد طولی و سلولی ساقه و ریشه، اندام­زایی، پیری برگ و پاسخ به تنش­ها نقش دارند. نقش براسینواستروئیدها در رشد و نمو کالوس و جنین در بسیاری از گیاهان به اثبات رسیده است. همچنین وجود آثار متقابل این هورمون با اکسین و جیبرلین در بسیاری از آزمایش­ها مشاهده شده است (Hasanuzzaman et al., 2013).

در یک پژوهش، عکس العمل آرابیدوپسیس در مواجهه با عنصر شیمیایی آنتیموان[3] در تیمار با اپی­براسینواستروئید بررسی شد. نتایج نشان داد که کاربرد اپی­براسینواستروئید (^4-10 تا ^1-10 میکرومول) منجر به افزایش محتوای پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پرولین و افزایش طول ریشه می‌شود. در ضمن محتوای مالون‌دی‌آلدهید در نمونه­های تیمار شده با اپی­براسینواستروئید کاهش یافت. آن­ها نتیجه گرفتند که کاربرد اپی­براسینواستروئید می­تواند بیان ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتی‌اکسیدان­ها را افزایش دهد و به­عنوان یک محرک مناسب جهت بهبود تحمل گیاه به سمیت ناشی از غلظت عناصر شیمیایی موجود در خاک مؤثر باشد (Wu et al., 2019).

نتایج یک تحقیق نشان داد که مقادیر مختلف عنصر روی، دارای اثرات سمی بر گیاه Raphanus sativus هستند و منجر به کاهش محتوای کلروفیل a، b و کاروتنوئید می­شوند. کاربرد سطوح متفاوت براسینواستروئید (نیم، یک و دو  میکرومول)، از تجزیه کلروفیل a، b و کاروتنوئید جلوگیری کرد و به­صورت موثری این صفات را افزایش داد (Ramakrishna et al., 2015). نتایج یک پژوهش نشان داد که تنش شوری به­صورت معنی­داری منجر به کاهش محتوای کلروفیل a، b، کاروتنوئید، نسبت کلروفیل a به b و نسبت کلروفیل کل به کاروتنوئید در گیاه  Eucalyptus urophylla شد. در این تحقیق، کاربرد سطوح متفاوت براسینواستروئید به­صورت اسپری­پاشی از تجزیه این صفات جلوگیری کرد و منجر به افزایش نرخ فتوسنتز و تحمل گیاه نسبت به تنش شوری شد (De oliveira et al., 2018).

شنبلیله با طبیعت گرم و خشک، به علت زمستانه بودن نسبت به دمای پایین مقاوم است. این گیاه در طول فصل رویش به هوای نسبتا گرم و معتدل نیاز دارد؛ اگرچه وقوع دمای بالا (بالاتر از 35 درجه سانتی­گراد) به این گیاه آسیب می­رساند (Pant et al., 2013; Osman et al., 2015; Lamaouie et al., 2018). با توجه به اهمیت گیاه شنبلیه به­عنوان یک گیاه دارویی مهم و حساسیت این گیاه دارویی نسبت به تنش دمای بالا، این تحقیق با هدف بررسی آثار هورمون 24-اپی­براسینواستروئید بر برخی از خصوصیات فیزیولوژیک شنبلیله تحت تنش دمای بالا انجام شد. نتایج حاصل از این تحقیق می­تواند در شناخت سازوکارهای فیزیولوژیکی گیاه شنبلیله و نحوه تاثیرگذاری 24-اپی­براسینواستروئید بر افزایش تحمل گیاه شنبلیله در برنامه­های اصلاحی آینده مفید باشد.

مواد و روش­ها

به­منظور بررسی اثرات 24-اپی­براسینواستروئید بر برخی ویژگی­های فیزیولوژیکی شنبلیله، آزمایشی به­صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. تیمارهای این آزمایش شامل هورمون 24-­اپی­براسینواستروئید در چهار سطح صفر،دو، پنج و 10 ppm (Cao & Hua, 2008; Kurepin et al., 2008; Aghdam & Mohammadkhani, 2014) و دو شرایط دمایی 42 درجه سانتی‌گراد (تنش دمای بالا) و 23 درجه سانتی‌گراد (دمای نرمال) و دو بازه زمانی شش و 24 ساعت پس از اعمال تنش بودند. در این آزمایش، ابتدا بذور گیاه شنبلیله (رقم همدان) ضدعفونی شدند و پس از کاشت در گلدان­های 20 سانتی­متری با ترکیب پیت ماس و پرلیت، در اتاقک رشد با دمای 23 درجه سانتی‌گراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی قرار گرفتند. گیاهان پنج هفته­ای با سه سطح هورمون 24-اپی­براسینواستروئید اسپری­پاشی شدند. نیمی از گلدان­ها در شرایط نرمال و نیمی دیگر به اتاقک رشد به­منظور اعمال تنش گرمایی منتقل شدند. سپس در زمان‌های شش و 24 ساعت پس از تنش دمای بالا، از برگ­های گیاه نمونه­برداری شد و بلافاصله نمونه­ها در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند.

اندازه گیری محتوای کلروفیل و کاروتنوئید

برای این منظور، میزان جذب با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج­های 480، 510، 645 و 663 نانومتر تعیین شد و محتوای کلروفیل a، b، مجموع آن­ها و کاروتنوئید بر اساس روش (Arnon, 1967) محاسبه شدند.

قابلیت هدایت الکتریکی غشای پلاسمایی (نشت الکترولیت)

قابلیت هدایت الکترولیتی نمونه‌ها بر اساس روش Popov et al. (2005) تعیین شد. برای این منظور و با استفاده از دستگاه پانچ، دیسک­هایی از برگ­ها تهیه شد و به لوله‌های آزمایش حاوی 10 میلی‌لیتر آب مقطر منتقل شدند. به­منظور جذب بهتر آب، از پمپ خلا استفاده شد و سپس لوله‌های آزمایش به مدت 30 دقیقه در دستگاه شیکر قرار گرفتند و درصد هدایت الکترولیتی نمونه‌ها (EC1) با استفاده از دستگاه EC متر اندازه‌گیری شد. در مرحله بعد، لوله‌های آزمایش در حمام آب گرم قرار گرفتند و به مدت 30 دقیقه در دستگاه شیکر به خوبی همزده شدند و در نهایت درصد هدایت الکترولیتی نمونه‌ها (EC2) تعیین شد. مقدار شاخص خسارت بر اساس معادله یک   محاسبه شد:

معادله 1             

محتوای مالون­دی­آلدهید ‌

میزان اکسیداسیون گیاهچه­ها براساس تجمع مالون­دی­آلدهید ([4]MDA) برگ و با استفاده از محلول تیوباربیتوریک اسید (TBA)^[5] تعیین شد. برای این منظور، میزان جذب نمونه­ها در طول موج 532 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شدند و محتوای مالون­دی­آلدهید بر اساس معادله 2 محاسبه شد (Health & Packer., 1968):

معادله 2           M= A/B

 در این معادله، A: عدد قرائت شده و B: ضریب تمایز مولار (مول/سانتی‌متر ^5- 10×56/1) است.

پروتئین کل و سنجش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

نمونه‌های برگی با استفاده از ازت مایع به خوبی پودر شدند و 25/0 گرم از پودر حاصل به فالکون­های 15 میلی­لیتری منتقل شدند و 5/2 میلی­لیتر بافر استخراج به آن­ها افزوده شد. پس از ورتکس نمونه همراه با بافر استخراج، نمونه­ها به مدت 15دقیقه با سرعت g×1500 در دمای چهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و از مایع رویی برای قرائت محتوای پروتئین­ کل و سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، گایاکول پراکسیداز (GPX)، آسکوربات پراکسیداز (APX) استفاده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر و با روش Aebi  (1983) اندازه­گیری شد. برای این منظور، 3000 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (7pH =) 50 میلی­مولار، پنج میکرولیتر پراکسید ­هیدروژن 41/3 مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیم با یکدیگر ترکیب شدند و فعالیت آنزیم به مدت پنج دقیقه (در فواصل زمانی 20 ثانیه­ای) ثبت شد. فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر و با روشDionisio-Sese and Tobita   (1988) اندازه گیری شد. برای این منظور، 3000 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (7pH =) 50 میلی­مولار، پنج میکرولیتر پراکسید ­هیدروژن 41/3 مولار، سه میکرولیتر محلول گایاکول[6] 200 میلی مولار  و 100 میکرولیتر عصاره آنزیم با یکدیگر ترکیب شدند. فعالیت آنزیم با فاز تاخیری 60 ثانیه­ای، به مدت پنج دقیقه و در فواصل زمانی 20 ثانیه­ای ثبت شد. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) با استفاده از روش Ranieri et al  (2000) اندازه­گیری شد و در طول موج 290 نانومتر نمونه­ها قرائت شد. مخلوط واکنش حاوی 500 میکرولیتر از EDTA 1/0 میلی مولار، 2100 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 7pH=، 350 میکرولیتر آسکوربیک اسید 5/0 میلی­مولار، پنج میکرولیتر H₂O₂ 30 درصد و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. سجش فعالیت آنزیم در طول پنج دقیقه ثبت شد.

آنالیز داده­ها

آنالیز داده­ها به صورت آزمایش فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی با استفاده از نرم­افزار R، رسم نمودار با استفاده از اکسل 2013 و مقایسه میانگین با روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد انجام شد.

نتایج و بحث

محتوای کلروفیل و کاروتنوئید

نتایج تجزیه واریانس صفات مطالعه شده در این تحقیق در جدول 1 آمده است. داده­های حاصل از این پژوهش با استفاده از آزمایش فاکتوریل و بر پایه طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار آنالیز شد. نتایج مقایسه میانگین اثر سه‌گانه دما (23 و 42 درجه سانتی‌گراد)، زمان (شش و 24 ساعت) و غلظت‌های مختلف 24-اپی­براسینواستروئید بر محتوای کلروفیل a در شکل A1 آمده است. در این آزمایش، تیمار دمای نرمال (23 درجه سانتی­گراد) و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید (سطح صفر) به­عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد و بیشتر مقایسات بر مبنای همین تیمار انجام شد. محتوای کلروفیل a پس از اعمال تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد و بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید) نسبت به شرایط دمای نرمال (23 درجه سانتی­گراد) و بدون کاربرد 24-اپی براسینواستروئید، به­صورت معنی­داری کاهش یافت. محتوای کلروفیل a در تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد) و با کاربرد سطوح مختلف هورمون 24-اپی­براسینواستروئید نسبت به همین شرایط دمایی و عدم کاربرد 24-اپی براسینواستروئید در هر دو زمان برداشت ( شش و 24 ساعت) به­صورت معنی­داری افزایش یافت. بیشترین محتوای کلروفیل a در شرایط دمای بالا و در زمان شش ساعت پس از اعمال تنش (غلظت پنج ppm) و همچنین در زمان 24 ساعت (غلظت دو ppm) مشاهده شد که با تیمار عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید اختلاف معنی داری داشتند.

جدول 1- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در گیاه شنبلیله تحت تنش دمای بالا.

Table 1. Variance analysis of the studied traits of fenugreek under high temperature stress

^ns، ^* و ^**: به ترتیب نشان­دهنده عدم معنی داری و معنی داری در سطح احتمال پنج و یک درصد می باشند.

^ns, ^*, and ^**:  non-significant and significant at the 5% and 1% of probability levels, respectively.

نتایج مقایسه میانگین آثار متقابل سه‌گانه بر محتوای کلروفیل b در شکل 1 (B) نمایش داده شده است. نتایج نشان داد که محتوای کلروفیل b در زمان اعمال تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد، شش و 24 ساعت و سطح صفر از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید) نسبت به تیمار شاهد (23 درجه سانتی‌گراد و سطح صفر از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید) به­صورت معنی­داری کاهش یافت؛ در حقیقت محتوای کلروفیل b با تداوم تنش دمایی تجزیه شده است. در زمان شش ساعت پس از تنش دمای بالا و غلظت دو ppm­ از 24-اپی­براسینواستروئید، محتوای کلرفیل b افزایش یافت و دارای اختلاف معنی­داری با همین تیمار دمایی و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید بود. محتوای کلروفیل   bدر تیمار دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد، 24 ساعت پس از تنش) با کاربرد غلظت­های دو و ­ 10 ppm نسبت به غلظت صفر 24-اپی­براسینواستروئید به‌صورت معنی­داری افزایش یافت.

تغییرات محتوای کلروفیل کل در دما، زمان و غلظت‌های مختلف 24-اپی براسینواستروئید در شکل C1  ارایه شده است. محتوای کلروفیل کل در شرایط دمایی نرمال و 24 ساعت پس از کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید، بیشتر از همین تیمار دمای در زمان شش ساعت بود؛ اگرچه این اختلاف از نظر آماری معنی‌دار نبود. اعمال تنش دمایی (42درجه سانتی­گراد)، موجب کاهش محتوای کلروفیل کل در زمان­های شش و 24 ساعت نسبت به تیمار دمای نرمال (23 درجه سانتی­گراد) و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید (سطح صفر) شد. محتوای کلروفیل کل در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار دمای بالا (در غلظت ppm10 از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید) بیشتر از غلظت‌های دو و پنج ppm بود.

نتایج مقایسه میانگین آثار متقابل سه‌گانه بر صفت کاروتنوئید در شکل D1  ارایه آمده است. نتایج نشان داد که محتوای کاروتنوئید در زمان اعمال تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد، 24 ساعت پس از تنش و سطح صفر از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید) نسبت به شرایط نرمال (23 درجه سانتی‌گراد و سطح صفر از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید) کاهش یافت. محتوای کاروتنوئید با کاربرد هورمون 24-اپی­براسینواستروئید در برخی سطوح در زمان اعمال تنش دمایی (42 درجه سانتی­گراد) نسبت به عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در زمان اعمال تنش (42 درجه سانتی­گراد) کاهش معنی­داری نداشت. کاربرد ­ پنج و 10 ppm  از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید، به­صورت معنی­داری از کاهش کاروتنوئید در شرایط تنش جلوگیری کرد. همچنین محتوای کاروتنوئید در تیمار دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد، 24 ساعت پس از اعمال تنش و در غلظت 10 ppm) نسبت به همین تیمار دمایی و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید به‌صورت معنی داری افزایش یافت.

شکل 1-  نتایج مقایسه میانگین سه‌گانه دما، زمان و سطوح مختلف 24-اپی­براسینواستروئید بر محتوای کلروفیل a (A)، b (B)، کل (C) و کاروتنوئید (D). مقایسه میانگین با روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد انجام شد. ستون­هایی با حروف مشابه، دارای اختلاف معنی‌داری با یکدیگر نیستند).

Figure 1. Triple mean comparison of temperature, time and different levels of 24-Epi-brassinosteroid on chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C) and carotenoid content(D). Mean comparison was done based on Duncan test at 1% of probability level. Columns with the similar letters are not significantly different.

در تحقیق حاضر محتوای کلروفیل a در اثر تنش دمای بالا نسبت به شرایط نرمال، به­صورت معنی‌داری کاهش یافت. اگرچه تداوم تنش از شش ساعت به 24 ساعت منجر به کاهش کلرفیل a شد، اما این کاهش چندان معنی‌دار نبود. همچنین در این پژوهش، محتوای کلروفیل b در شرایط تنش دمای بالا نسبت به شرایط نرمال کاهش یافت و تداوم تنش از شش به 24 ساعت منجر به کاهش معنی‌داری در محتوای کلرفیل b شد. در حقیقت گذشت زمان در شرایط تنش دمای  بالا (از شش ساعت به 24 ساعت) منجر به عدم سنتز و یا تجزیه کلروفیل b شده است. نتایج تحقیقات مختلف نشان داده است که با افزایش شدت تنش، محتوای رنگدانه‌ها نیز کاهش می­یابند و احتمال کاهش در کلروفیل b در مقایسه با کلروفیل a محتمل‌تر است (Kaya, et al., 2001).

در این پژوهش، محتوای کلروفیل b با شدت بیشتری نسبت به کلروفیل a و با گذشت مدت زمان تنش، کاهش یافت، زیرا در اثر تنش، کمپلکس پروتئینی جذب کننده نور (chl a/b) در فتوسیستم II تحت تاثیر قرار گرفته است و آسیب می­بیند. از آن‌جا که بخش کلروفیل b این کمپلکس پروتئینی در درون غشای کلروپلاست قرار دارد، با افزایش تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن در کلروپلاست در اثر شرایط تنش، تخریب غشاهای کلروپلاست نیز افزایش می‌یابد و از این ‌رو در اثر تنش، تخریب کمپلکس پروتئینی chl a/b و در نتیجه تخریب کلروفیل b نیز افزایش می­یابد (Kaya, et al., 2001). با توجه به این‌که کلروفیل کل از مجموع دو کلروفیل a و b تشکیل می‌شود، در این پژوهش محتوای کلروفیل کل با شروع شرایط تنش کاهش یافت و این کاهش با گذشت زمان (از شش ساعت به 24 ساعت) محسوس­تر بود. یکی از دلایل کاهش محتوای کلروفیل، احتمالا افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز است (Kaya  et al., 2001). از دلایل دیگر کاهش غلظت کلروفیل، می­توان به مشترک بودن مسیر بیوسنتزی کلروفیل و آلفا توکوفرول اشاره کرد. در حقیقت در شرایط تنش، گیاه با متوقف کردن مسیر بیوسنتزی کلروفیل، مسیر بیوسنتزی آنتی‌اکسیدان آلفاتوکوفرول را فعال می­نماید. همچنین تغییر در مسیر متابولیسم نیتروژن، به علت ساخت ترکیب­هایی مانند پرولین، دلیل مهمی دیگری است   .(Kaya et al., 2001)از آن‌جا که گلوتامین، پیش ماده مشترک ساخت کلروفیل و پرولین است، این پیش ماده در شرایط تنش کمتر در مسیر ساخت کلروفیل شرکت می­کند و بیشتر به سمت تولید پرولین گرایش دارد (Mahajan & Tuteja, 2005).

در تحقیق حاضر، قرار گرفتن طولانی مدت (24 ساعت) در معرض تنش دمای بالا، منجر به کاهش محتوای کاروتنوئید شد. در شرایط کوتاه مدت تنش دمایی (شش ساعت)، محتوای کاروتنوئید کاهش معنی‌داری نداشت. در این شرایط، عدم تغییر محتوای معنی‌دار کاروتنوئید، موجب حفاظت گیاه در برابر شرایط تنش می‌شود و احتمالا گیاه با شرایط تنش مقابله کرده است. اما مدت زمان طولانی تنش (24 ساعت)، موجب تخریب کاروتنوئید شده است و احتمالاً گیاه از طریق مسیرهای آنتی اکسیدانی، شرایط تنش را تحمل کرده است. یکی از مهم‌ترین وظایف کاروتنوئیدها، جلوگیری از آسیب اکسیداتیو می‌باشد که این عمل را با تعدیل سریع وضعیت برانگیخته کلروفیل و حفاظت نوری انجام می‌دهند. در شرایط تنش، مقدار کاروتنوئید کاهش می­یابد و بنابراین کارتنوئید قادر به ایفای نقش حفاظتی خود نمی­باشد؛ اگرچه کاهش آن­ها نسبت به کلروفیل‌ها کمتر است (Wang et al., 2010). کاهش در محتوای کاروتنوئید در شنبلیه تحت تنش دمای بالا، احتمالا به علت اکسیداسیون توسط گونه‌های فعال اکسیژن و تخریب ساختار آن­ها روی داده است.

در این پژوهش، اعمال تیمار 24-اپی‌­براسینواستروئید در شرایط تنش دمایی بالا، موجب افزایش محتوای کلروفیل و کاروتنوئید شد. 24-اپی­براسینواستروئیدها، موجب بهبود خصوصیات کمی گیاهان می‌شوند (Vardhini & Anju, 2015) و با بهبود فعالیت سیستم آنتی ‌اکسیدانی، گیاه را در برابر تنش محافظت می‌کنند (Arora et al., 2010). در این پژوهش، کاربرد هورمون براسینواسترئید در شرایط تنش دمای بالا و در زمان 24 ساعت، موجب افزایش محتوای کاروتنوئید شد. اپی­براسینواستروئیدها با افزایش فعالیت آکواپورین‌ها (Morillon et al., 2001) و پمپ پروتونی، نقش مهمی را در برقراری فشار اسمزی و تداوم توسعه اندامک‌ها ایفا می‌نمایند و بدین ترتیب موجب افزایش تحمل گیاهان به تنش می‌شوند. همچنین براسینواستروئیدها، پایداری غشاء را در برابر آسیب‌های ناشی از تنش‌های غیرزیستی افزایش می‌دهند. نتایج این تحقیق ثابت کرد که 24-اپی‌­براسینواستروئید به­صورت قابل توجهی آثار تنش بر روی شنبلیه را کاهش می‌دهد و موجب افزایش محتوای رنگدانه می‌شود. یکی از دلایل اثر تیمار 24-اپی‌­براسینواستروئید در افزایش رنگیزه‌های فتوسنتزی و کاروتنوئیدها، به احتمال زیاد مربوط به افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی است که تحت تاثیر این تیمارها فعال شدند و از تخریب و یا تجزیه رنگدانه‌ها جلوگیری کردند (Hayat et al., 2010). در یک بررسی (Ramakrishna & Rao, 2015)  مشخص شد که اثرات سمیت عنصر روی در گیاه
 Raphanus Sativus  می­تواند منجر به تجزیه کلروفیل a، b، کل و کاروتنوئید شود و کاربرد براسینواستروئید منجر به افزایش محتوای کلروفیل و کاروتنوئید شد. همچنین نتایج تحقیق De Olivera et al.  (2019) ثابت کرد که تنش شوری منجر به کاهش محتوای کلروفیل a، b و کاروتنوئید در گیاه Eucalyptus urophylla  می‌شود. در مجموع نتایج این محققان نشان داد که براسینواستروئید به‌صورت موثری از تخریب کلروفیل و کاروتنوئید جلوگیری می­کند و از این طریق منجر به افزایش مقاومت گیاه تحت شرایط تنش می‌شود.

درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون­دی‌آلدهید

درصد نشت الکترولیت تحت شرایط تنش دمای بالا در شنبلیله افزایش یافت (شکل A2). در تیمار تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد، بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید و24 ساعت پس از اعمال تنش دمایی)، درصد نشت الکترولیت در مقایسه با سایر تیمارها به بالاترین مقدار خود رسید. همچنین مقدار این صفت در همین تیمار دمایی و شش ساعت پس از اعمال تنش نسبت به شرایط نرمال دمایی (23 درجه سانتی‌گراد و بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید) افزایش معنی­داری داشت. در حقیقت کاربرد سطوح مختلف 24-اپی­براسینواستروئید در زمان اعمال تنش دمای بالا و در هر دو زمان شش و 24 ساعت، به­صورت معنی­داری درصد نشت الکترولیت را نسبت به شرایط عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید کاهش داد. سطوح دو و پنج ppm از 24-اپی­براسینواستروئید در زمان شش ساعت پس از اعمال تنش دمای بالا، به­صورت موثری درصد نشت الکترولیت را نسبت به همین تیمار دمایی (بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید) کاهش دادند؛ بدین معنی که کاربرد این هورمون در شرایط تنش دمایی به­صورت موثری از افزایش این صفت جلوگیری کرد. همچنین کاربرد سطوح مختلف این هورمون، به­صورت معنی­داری درصد نشت الکترولیت را در تیمار دمای بالا (24 ساعت پس از تنش) نسبت به عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید کاهش دادند.

محتوای مالون­دی­آلدهید (شکل B2) در تنش دمای بالا در شنبلیله، به­صورت معنی­داری افزایش یافت. در تیمار تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد، بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید و 24 ساعت پس از اعمال تنش)، محتوای مالون­دی­آلدهید در مقایسه با سایر تیمارها به بالاترین میزان خود رسید. همچنین محتوای این صفت در تیمار شش ساعت پس از اعمال تنش دمایی نسبت به شرایط نرمال دمایی (23 درجه سانتی‌گراد و بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید) افزایش معنی­داری داشت. کاربرد سطوح مختلف 24-اپی­براسینواستروئید در زمان اعمال تنش دمای بالا و در هر دو زمان شش و 24 ساعت، به­صورت معنی­داری محتوای مالون­دی­آلدهید را نسبت به همین شرایط دمایی و عدم کاربرد 24-اپی براسینواستروئید کاهش داد. در حقیقت سطح  دو ppm از 24-اپی براسینواستروئید در زمان شش ساعت پس از اعمال تنش دمایی بالا، به­صورت موثری از افزایش این صفت در مقایسه با تیمار دمایی بالا و عدم کاربرد این هورمون جلوگیری کرد. همچنین تمامی سطوح 24-اپی­براسینواستروئید به­صورت موثری محتوای مالون­دی­آلدهید و در نتیجه آسیب­پذیری گیاه نسبت به تنش دمایی را کاهش دادند. در حقیقت کاربرد تمامی سطوح 24-اپی­براسینواستروئید در زمان اعمال تنش دمای بالا و زمان برداشت 24 ساعت، به­صورت معنی­داری مانع از افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی شدند.

در این تحقیق، تنش دمای بالا منجر به افزایش درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون‌دی‌آلدهید شد. در حقیقت تنش دمای بالا، موجب افزایش آسیب به غشاء سلول شد و در نتیجه محتوایات درونی سلول به خارج از سلول هدایت شدند. کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید موجب کاهش درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون­دی‌آلدهید نسبت به شرایط تنش دمای بالا (بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید) شد. گزارشاتی مبنی بر تاثیر اپی­براسینواستروئید در کاهش محتوای مالون­دی‌آلدهید و نشت الکترولیت به دلیل حفظ لیپیدهای غشاء از خسارت حاصل از گونه های فعال اکسیژن وجود دارد .(Wu et al., 2019)

نتایج این تحقیق ثابت کرد که 24-اپی­براسینواستروئیدها، محتوای مالون­دی‌آلدهید حاصل از پراکسیداسیون لیپیدهای غشا را کاهش می‌دهند؛ بنابراین می­توان نتیجه گرفت که این هورمون بر روی ترکیب اسیدهای چرب و نفوذپذیری غشا اثر می­گذارند و دارای آثار مثبتی بر تجمع مواد محلول هستند (Aghdam et al., 2012). بنابراین در این تحقیق، کاهش درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون­دی‌آلدهید در نتیجه کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در شرایط تنش دمایی، نشان دهنده کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و حفظ سلامت غشا تحت تنش دمای بالا است. از اثرات 24-اپی­براسینواستروئیدها می­توان به فعال کردن ژن­های پروتئین­های شوک حرارتی اشاره کرد که با تولید آنزیم‌های محافظتی، مولکول‌های زیستی و سلول‌ها را در مقابل شرایط نامساعد محافظت می‌کنند (Safari et al., 2012).

اعمال تنش دمای بالا موجب افزایش درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون­دی‌آلدهید شد. قرار گرفتن طولانی مدت در معرض تنش دمای بالا (24 ساعت)، درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون­دی‌آلدهید را به مقدار بیشتری در مقایسه با زمان کوتاه مدت (شش ساعت) تنش افزایش داد. این افزایش در درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون­دی‌آلدهید، احتمالا نتیجه تخریب بیشتر ساختار غشا و آسیب بیشتر به گیاه می‌باشد.  نتایج پژوهش Olivera et al.  De (2019) نشان داد که محتوای مالون­دی­آلدهید و درصد نشت الکترولیت درEucalyptus urophylla  تحت شرایط تنش شوری افزایش می­یابد، درحالی­که کاربرد براسینواستروئید به صورت اسپری پاشی مانع از افزایش این صفات شد.

محتوای پروتئین کل و آنزیم­های آنتی اکسیدان

نتایج مقایسه میانگین آثر متقابل دما، زمان و غلظت‌های 24-اپی­براسینواستروئید بر محتوای پروتئین کل در شکل A3  آمده است. اعمال تنش دمایی، موجب افزایش محتوای پروتئین کل در هر دو زمان شش و 24 ساعت شد؛ اگرچه محتوای آن در زمان 24 ساعت پس از اعمال تنش بیشتر بود. در شرایط دمایی نرمال (23 درجه سانتی­گراد و شش ساعت)، غلظت پنج ppm از 24-اپی­براسینواستروئید، موجب افزایش معنی­دار محتوای پروتئین کل نسبت به شاهد (23 درجه سانتی­گراد و غلظت صفر) شد. بالاترین محتوای پروتئین کل در تیمار تنش بالا (غلظت دو ppm از 24-اپی­براسینواستروئید و 24 ساعت پس از تنش) به‌دست آمد که با تیمار شاهد دارای اختلاف معنی­داری بود.

روند تغییرات در تیمار دمایی نرمال و زمان 24 ساعت متفاوت بود؛ به­گونه‌ای که با افزایش غلظت 24-اپی­براسینواستروئید از محتوای پروتئین کل کاسته شد. اعمال تیمار تنش دمایی به مدت 24 ساعت، افزایش معنی‌داری را در محتوای پروتئین کل در مقایسه با شاهد (23 درجه سانتی­گراد و غلظت صفر) در پی داشت. در تیمار دمایی بالا (غلظت دو ppm از 24-اپی­براسینواستروئید در زمان­های شش و 24 ساعت پس از اعمال تنش)، محتوای پروتئین کل نسبت به همین تیمار دمایی (زمان­های شش و 24 ساعت، بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید)  به‌صورت معنی‌داری افزایش یافت، درحالی­که محتوای پروتئین کل در غلظت‌های پنج و 10 ppm در تیمار دمای بالا (زمان­های شش و 24 ساعت) با همین تیمار دمایی (زمان­های شش و 24 ساعت، بدون کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید) اختلاف معنی­داری نداشتند.

مقایسه میانگین آثار متقابل سه‌گانه بر فعالیت آسکوربات پراکسیداز در شکل B3 (قسمت) آمده است. نتایج نشان داد که فعالیت آسکوربات پراکسیداز در زمان اعمال تنش دمای بالا (شش ساعت و 24 ساعت) نسبت به شرایط نرمال (23 درجه سانتی‌گراد)، به­صورت معنی­داری افزایش یافت. همچنین، فعالیت آسکوربات پراکسیداز با کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در برخی سطوح در زمان اعمال تنش دمایی نسبت به عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در همین تیمار دمایی به­صورت معنی­داری افزایش یافت. در زمان­های شش و 24 ساعت پس از تنش دمای بالا و در سطوح دو و پنج ppm، فعالیت آسکوربات پراکسیداز به­صورت معنی­داری نسبت به تنش دمایی بالا و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید افزایش یافت. بیشترین میزان فعالیت آسکوربات پراکسیداز در سطح دو ppm و زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار دمای بالا به­دست آمد که نشان­دهنده نقش این آنزیم در افزایش تحمل گیاه به تنش است.

شکل 2- مقایسه میانگین سه‌گانه دما، زمان و سطوح مختلف 24-اپی­براسینواستروئید بر درصد نشت الکترولیت (A) محتوای مالون­دی­آلدهید (B). مقایسه میانگین با روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد انجام شد. ستون­هایی با حروف مشابه، دارای اختلاف معنی‌داری با یکدیگر نیستند.

Figure 2. Triple mean comparison of temperature, time and different levels of 24-Epi-brassinosteroid on percentage of electrolyte leakage (A), malondialdehyde content (B). Mean comparison was done based on Duncan test at 1% of probability level.  columns with the similar letters are not significantly different.

نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل سه‌گانه بر فعالیت کاتالاز در شکل C 3 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که فعالیت کاتالاز در زمان اعمال تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد و شش ساعت) نسبت به شرایط نرمال (23 درجه سانتی‌گراد) به­صورت معنی­داری افزایش یافت. فعالیت کاتالاز با کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در برخی سطوح در زمان اعمال تنش دمایی نسبت به عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در زمان اعمال تنش به­صورت معنی­داری افزایش یافت. در زمان شش ساعت پس از تنش دمای بالا و در سطح  دو ppm و در زمان 24 ساعت پس از تنش و در سطوح دو و پنج ppm فعالیت کاتالاز به­صورت معنی­داری نسبت به تنش دمایی بالا و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید افزایش یافت. بیشترین میزان فعالیت کاتالاز در سطح دو ppm از هورمون 24-اپی­براسینواستروئید و زمان 24 ساعت به­دست آمد که نشان­دهنده نقش این آنزیم در افزایش تحمل گیاه به تنش است.

بر اساس نتایج مقایسه میانگین اثرات متقابل سه‌گانه بر فعالیت گایاکول پراکسیداز (D3)، فعالیت گایاکول پراکسیداز در زمان اعمال تنش دمای بالا (42 درجه سانتی­گراد و شش و 24ساعت) نسبت به شرایط نرمال (23 درجه سانتی‌گراد) به­صورت معنی­داری افزایش یافت. بین میزان فعالیت گایاکول پراکسیداز در زمان اعمال تنش دمایی بالا در زمان‌های شش و 24 ساعت پس از تنش اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. میزان فعالیت گایاکول پراکسیداز با کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در برخی سطوح در زمان اعمال تنش دمایی نسبت به عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید در همین تیمار دمایی به­صورت معنی­داری افزایش یافت. در زمان شش ساعت پس از تنش و در سطوح پنج و 10 ppm، فعالیت گایاکول پراکسیداز نسبت به تنش دمایی بالا و عدم کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید به­صورت معنی­داری افزایش یافت. بیشترین میزان فعالیت گایاکول پراکسیداز در سطح  10ppm  از 24-اپی­براسینواستروئید و زمان شش ساعت به­دست آمد که این میزان با سایر تیمارها اختلاف معنی­داری داشت.

شکل 3- مقایسه میانگین سه‌گانه دما، زمان و سطوح مختلف 24-اپی­براسینواستروئید بر پروتئین کل (A)، آسکوربات پراکسیداز (B)، کاتالاز (C) و گایاکول پراکسیداز (D). مقایسه میانگین با روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد انجام شد. ستون­هایی با حروف مشابه، دارای اختلاف معنی‌داری با یکدیگر نیستند.

Figure 3. Triple mean comparison of temperature, time and different levels of 24-Epibrassinosteroid on total protein (A), ascorbate peroxidase (B), catalase (C), and gayacol peroxidase (D). Mean comparison was done based on Duncan test at 1% of probability level. Columns with the similar letters are not significantly different.

در تحقیق حاضر، تنش دمای بالا موجب افزایش محتوای پروتئین کل در مقایسه با شرایط دمایی نرمال شد. قرار گرفتن طولانی مدت در معرض دمای بالا، موجب افزایش محتوای پروتئین کل در مقایسه با مدت زمان کوتاه تنش شد. قرار گرفتن طولانی مدت در معرض تیمار 24-اپی­براسینواستروئید (دو و پنج ppm­) در شرایط دمای نرمال (23 درجه سانتی­گراد)، افزایش محتوای پروتئین کل نسبت به تیمار شاهد را در پی داشت. در شرایط تنش دمای بالا، تیمار دو ppm­ در هر دو بازه زمانی شش و 24 ساعت، موجب افزایش محتوای پروتئین کل برگ شد. 24-اپی­براسینواستروئیدها باعث افزایش تحمل گیاهان در برابر تنش‌های گوناگون می‌شوند. این ترکیبات در سطح مولکولی، بیان ژن، متابولیسم و بیوسنتز اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها را تغییر می‌دهند (Arfan et al., 2019). همچنین اپی­براسینواستروئیدها، تحمل گیاهان را در محدوده وسیعی از تنش‌های محیطی از قبیل خشکی، شوری، سرما و گرما افزایش می‌دهند و این افزایش عموماً به تولید و رونوشت ژن‌های ضد تنش از جمله پروتئین شوک گرمایی وابسته است که نشان‌دهنده افزایش رونوشت ژن‌های مسئول پاسخ به تنش برای بالا بردن تحمل به تنش در درون گیاهان تیمار شده با اپی­براسینواستروئید است (Arfan et al., 2019).

در این پژوهش، فعالیت آسکوربات پراکسیداز با گذشت زمان تنش از شش ساعت به 24 ساعت، به­صورت معنی‌داری افزایش یافت. در مجموع، کاربرد 24-اپی­براسیتواستروئید منجر به افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز، هم در شرایط نرمال و هم در شرایط تنش دمای بالا شد.  نتایج این تحقیق نشان داد که 24-اپی­براسینواستروئید از طریق تاثیر بر بیان ژن‌های مسئول کنترل فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، باعث افزایش تحمل شنبلیله در برابر خسارت اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن در شرایط تنش دمای بالا می‌شود (Choe et al., 2006). در یک پژوهش، محتوای پرولین و سطوح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در زمان کاربرد اپی­براسینواستروئید تحت شرایط تنش سرما و شرایط کنترل افزایش یافت که در نهایت منجر به افزایش مقاومت گیاه شد (Khan et al., 2019).

در این مطالعه، فعالیت کاتالاز در اثر تنش دمایی بالا نسبت به شرایط نرمال افزایش یافت. فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش دمای بالا و تیمار با 24-اپی­براسینواستروئید (سطح دو ppm) نسبت به تیمار عدم کاربرد 24- اپی­براسینواستروئید به‌طور معنی‌داری افزایش یافت. این افزایش احتمالا به دلیل افزایش گونه­های فعال اکسیژن در شرایط تنش دمای بالا است؛ بنابراین در این شرایط، گیاه به­منظور مقابله با گونه‌های فعال اکسیژن نیاز به افزایش فعالیت کاتالاز دارد. بنابراین شنبلیله به­منظور حفاظت از غشای سلولی و سایر اندام‌ها از خسارت ناشی از تنش اکسداتیو، سیستم دفاعی آنتی‌‌اکسیدانی را توسعه داده است (Maia et al., 2010). نتایج پژوهش‌های متعدد نشان داد است که اپی­براسینواستروئیدها از طریق تاثیر بر بیان ژن‌های مسئول کنترل فعالیت آنزیم‌های آنتی‌‌اکسیدانی، منجر به افزایش تحمل گیاهان در برابر خسارت ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن در شرایط تنش می‌شوند (Choe et al., 2006). افزایش بیان و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی بعد از کاربرد اپی­براسینواستروئید ممکن است به علت افزایش بیان ژن­های Det[7] رخ دهد، که باعث افزایش تحمل گیاه به تنش‌های اکسیداتیو می‌شود. وجود و کارکرد این ژن در آرابیدوپسیس در بافت­هایی حاوی رادیکال‌های آزاد اثبات شده است (Kaya et al., 2019).

Arfan et al (2019) نشان دادند که کاربرد اپی­براسینواستروئید و براسینولوئید (بازدارنده سنتز اپی­براسینواستروئید) تحت شرایط تنش دمای پایین در آرابیدوپسیس، به‌ترتیب منجر به افزایش و کاهش محتوای کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز، پلی فنول اکسیداز و آسکوربات پراکسیداز شدند. همچنین محتوای مالون‌دی‌آلدهید به‌ترتیب افزایش و کاهش یافت. همچنین نتایج تحقیق Efimova et al. (2018) ثابت کرد که تیمار گوجه فرنگی با 24-اپی­براسینولوئید و 28-هوموبراسینولوئید تحت شرایط تنش شوری، منجر به افزایش محتوای کلروفیل a، b، کاروتنوئید و کاهش محتوای مالون­دی آلدهید می‌شود. در حقیقت کاربرد تیمارهای مذکور، منجر به افزایش ویژگی­های رشدی و کاهش تنش اکسیداتیو شدند.

در پژوهش حاضر، اعمال تنش دمای بالا به­صورت معنی‌داری موجب افزایش فعالیت گایاکول پراکسیداز در هر دو بازه زمانی در مقایسه با شرایط دمایی نرمال (23 درجه سانتی‌گراد) شد. قرار گرفتن طولانی مدت (24 ساعت) در معرض تنش دمای بالا نسبت به تنش کوتاه مدت (شش ساعت)، موجب افزایش فعالیت گایاکول پراکسیداز شد؛ اگر چه این اختلاف معنی‌دار نبود. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که 24-اپی­براسینواستروئید احتمالا از طریق تنظیم فعالیت ژن­های دفاعی، در رشد و نمو طبیعی گیاه و افزایش تحمل به تنش‌های محیطی ایفای نقش می­کند. همچنین ثابت شد که 24-اپی­براسینواستروئید، بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدان را افزایش می‌دهد. نتایج متضادی در مورد اثر تحریک­کننده­های مختلف بر افزایش تحمل گیاهان نسبت به انواع تنش­های زیستی و غیرزیستی وجود دارد. پاسخ گیاهان با توجه به مدت زمان در معرض محرک بودن، سن و مرحله رشدی و غلظت محرک­ها بسیار متفاوت است؛ بنابراین بهینه کردن شرایط تیمار با این محرک­ها از قبیل شناسایی بهترین غلظت محرک، حساس­ترین مرحله رشدی گیاه و مناسبترین زمان در معرض قرارگیری محرک از فاکتورهای موثر در شناسایی محرک­های مناسب است (Angelova et al., 2006: Namdeo, 2007; Parsa et al., 2016;).

نتیجه گیری کلی

در این تحقیق، اثر 24-اپی­براسینواستروئید بر برخی از ویژگی‌های فیزیولوژیک شنبلیله تحت تنش دمای بالا بررسی شد. نتایج نشان داد که کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید به­صورت محلول‌پاشی، تا حدود زیادی از پراکسیداسیون اسیدهای چرب جلوگیری به­عمل می­آورد و در نتیجه منجر به کاهش درصد نشت الکترولیت و محتوای مالون‌دی‌آلدهید می‌شود که منجر به افزایش تحمل شنبلیله به تنش گرما شدند. کاربرد 24-اپی­براسینواستروئید ممکن است از طریق تحریک سیستم­های مقاومتی گیاه، منجر به افزایش بیان ژن‌های درگیر و افزایش محتوای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از قیبل آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز و گایاکول پراکسیداز شود و در نهایت تحمل گیاه افزایش یابد.

REFERENCES

1. Aebi, H.E. (1983). Catalase: In “Methods of enzymatic analysis” (2^nd ). Verlag Chemie Weinheim. Academic Press, Inc. New York and London.
2. Aghdam, M.S. & Mohammadkhani, N. (2014). Enhancement of chilling stress tolerance of tomato fruit by postharvest brassinolide treatment. Food Bioprocess Technology, 7, 909–914.
3. Aghdam, R., Najarian, S., Shakhesi, S., Khanlari, S., Shaabani, K. & Sharifi, S. (2012). Investigating the effect of PGA on physical and mechanical properties of electrospun PCL/PGA blend nanofibers. Journal of Applied Polymer Science, 124(1), 123-131.
4. Angelova, Z., Georgiev, S. & Roos, W. (2001). Elicitation of plants. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 20, 72-83.
5. Annunziata, M. G., Ciarmiello, L. F., Woodrow, P., Dell’Aversana, E. & Carillo, P. (2019). Spatial and temporal profile of glycine betaine accumulation in plants under abiotic stresses. Frontiers in plant science, 10, 1-13.
6. Arfan, M., Zhang, D. W., Zou, L., Luo, S. S., Tan, W. R., Zhu, T. & Lin, H. H. (2019). Hydrogen peroxide and nitric oxide crosstalk mediates brassinosteroids induced cold stress tolerance in Medicago truncatula. International journal of molecular sciences, 20(1), 144- 159.
7. Arnon, A. N. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23(1), 112-121.
8. Arora, P., Bhardwaj, R., & Kanwar, M. K. (2010). 24-Epibrassinolide induced antioxidative defense system of Brassica juncea L. under Zn metal stress. Physiology & Molecular Biology of Plants, 16, 285–293.
9. Cao, Y. Y. & Hua, Z. H. A. O. (2008). Protective roles of brassinolide on rice seedlings under high temperature stress. Rice Science, 15(1), 63-68.
10. Chen, X., Kanokporn, T., Zeng, Q., Wilkins, T. A. & Wood, A. J. (2002).Characterization of the V-H⁺ ATPase in the resurrection plant Tortola ruralis: accumulation and polysomal. Journal of Experimental Botany, 53,367-372.
11. Choe, E. & Min, D. B. (2006). Mechanisms and factors for edible oil oxidation. Comprehensive reviews in food science and food safety, 5(4), 169-186.‏
12. De oliveira, V. P., Lima, M. D. R., da Silva, B. R. S., Batista, B. L. & da Silva Lobato, A. K. (2019). Brassinosteroids confer tolerance to salt stress in Eucalyptus urophylla plants enhancing homeostasis, antioxidant metabolism and leaf anatomy. Journal of Plant Growth Regulation, 38(2), 557-573.
13. DesMarais, D. L., Hernandez, K. M. & Juenger, T. E. (2013). Genotype-by-environment interaction and plasticity: exploring genomic responses of plants to the abiotic environ. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, 44, 5-29.
14. Dionisio-Sese, M. L. & Tobita, S. (1998). Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress. Plant Science, 135(1), 1-9.‏
15. El Amrani, A., Couée, I., Berthomé, R., Ramel, F., Gouesbet, G. & Sulmon, C. (2019). Involvement of polyamines in sucrose-induced tolerance to atrazine-mediated chemical stress in Arabidopsis thaliana. Journal of plant physiology, 238, 1-11.
16. Estaji, A., Kalaji, H. M., Karimi, H. R., Roosta, H. R. & Moosavi-Nezhad, S. M. (2019). How glycine betaine induces tolerance of cucumber plants to salinity stress? Photosynthetica, 57(3), 753-761.
17. Fujii, K. & Matsukawa, T. (1936). Saponins and sterols Saponin of Dioscorea tokoro The Pharmaceutical Society of Japan, 56, 408-414.
18. Hasanuzzaman, M., Nahar, K., Alam, M. M., Roychowdhury, R. & Fujita, M. (2013). Physiological, Biochemical, and Molecular Mechanisms of Heat Stress Tolerance in Plants. International Journal of Molecular Sciences, 14, 9643-9684.
19. Hayat, S., Hasan, S. A., Yusuf, M., Hayat, Q. & Ahmad, A. (2010). Effect of 28-homobrassinolide on photosynthesis, fluorescence and antioxidant system in the presence or absence of salinity and temperature in Vigna radiata. Environmental and Experimental Botany, 69(2), 105-112.
20. Heath, R.L. & Packer, L. (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 125, 189-198.
21. Hussain, M. S., Fareed, S., Ansari, S., Rahman, M. A., Ahmad, I. Z. & Saeed, M. (2012). Current approaches toward production of secondary plant metabolites. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, 4(1), 10-20.
22. Joanna, C., Magdalena, S. & Tyrka, M. (2015). Optimization of in vitro culture conditions for accumulation of diosgenin by fenugreek. Medicinal Plants Studies, 3(3), 22-25.
23. Kaya, C., Ashraf, M., Wijaya, L. & Ahmad, P. (2019). The putative role of endogenous nitric oxide in brassinosteroid-induced antioxidant defence system in pepper (Capsicum annuum L.) plants under water stress. Plant Physiology and Biochemistry, 143, 119-128
24. Kaya, C., Kirnak H. & Higgs D. (2001). Enhancement of growth and normal growth parameters by foliar application of potassium and phosphorus in tomato cultivars grown at high (NaCl) salinity. Journal of Plant Nutrition, 24(2), 357-367.
25. Khan, T. A., Yusuf, M., Ahmad, A., Bashir, Z., Saeed T., Fariduddin, Q. & Wu, T. (2019). Proteomic and physiological assessment of stress sensitive and tolerant variety of tomato treated with brassinosteroids and hydrogen peroxide under low-temperature stress. Food chemistry, 289, 500-511.
26. Kurepin, L. V., Qaderi, M. M., Back, T. G. (2008). A rapid effect of applied brassinolide on abscisic acid concentrations in Brassica napus leaf tissue subjected to short-term heat stress. Plant Growth Regulation, 55, 165–167.
27. Lamaoui, M., Jemo, M., Datla, R., & Bekkaoui, F. (2018). Heat and drought stresses in crops and approaches for their mitigation. Frontiers in chemistry, 6, 26.
28. Mahajan, S. & Tuteja, N. (2005). Cold, salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysics, 444(2), 139-158.‏
29. Maia, J. M, de Macedo, C. C., Voigt, E. L., Freitas, J. B. S. & Silveira, J. A. G. (2010). Antioxidative enzymatic protection in leaves of two contrasting cowpea cultivars under salinity. Biologia Plantarum, 54(1), 159-163.‏
30. Mehrafarin, A., Rezazadeh, S., Naghdi, B. H., Noormohammadi, G & Qaderi, A. (2011). A review on biology, cultivation and biotechnology of fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) as a valuable medicinal plant and multipurpose. Journal of Medicinal Plants, 10(37), 6-24.
31. Morgutti, S., Negrini, N., Pucciariello, C. & Sacchi, G. A. (2019). Role of Trehalose and Regulation of its Levels as a Signal Molecule to Abiotic Stresses in Plants. In Plant Signaling Molecules. (pp. 235-255.) Woodhead Publishing.
32. Namdeo, A. (2007). Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: a review. Pharmacognosy reviews, 1(1). 69-79.
33. Osman, M. E., El-Feky, S. S., Abo-Hamad, S. A., & Seliem, H. S. (2015). Improvement of harmful effects induced by temperature stress on Trgonella foenum-graecum by on putrescine. The Egyptian Journal of Experimental Biology, 11(2), 197-205.
34. Pant, G., Hemalatha, S., Arjunan, S., Malla, S., & Sibi, G. (2013). Effect of heat stress in synthesis of heat shock proteins and antioxidative enzyme response in Trigonella foenum-graceumJournal of Plant Sciences, 1(4), 51-56.
35. Parsa, M. & Zeinali, A. (2016). Effects of salicylic acid elicitor on the production of tropane alkaloids (atropine and scopolamine) in hairy roots and in vitro roots cultures of Hyoscyamus niger Scientific Journal Management System, 32(4), 655-666.
36. Patel, H & Krishnamurthy, R. (2013). Elicitors in plant tissue culture. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(2), 60-65.
37. Popov, V. N, Orlova I. V. & Kipaikina, T. (2005). The effect of tobacco plant transformation with a gene for acyl-lipid Δ9-desaturase from Synechococcus vulcanus on plant chilling tolerance. Russian Journal of Plant Physiol, 52, 664–667.
38. Ramakrishna, B. & Rao, S. S. R. (2015). Foliar application of brassinosteroids alleviates adverse effects of zinc toxicity in radish (Raphanus sativus ) plants. Protoplasma, 252(2), 665-677.
39. Ranieri, A., Castagna, A. & Soldatini, G. F. (2000). Differential stimulation of ascorbate peroxidase isoforms by ozone exposure in sunflower plants. Journal of Plant Physiology, 156(2), 266-271.
40. Safari, M., Ghanati, F., Hajnoruzi, A., Rezaei, A., Abdolmaleki, P. & Mokhtari-Dizaji, M. (2012). Maintenance of membrane integrity and increase of taxanes production in hazel (Corylusavellana L.) cells induced by low-intensity ultrasound. Biotechnology letters, 34(6), 1137-1141.‏
41. Sharma, A., Shahzad, B., Kumar, V., Kohli, S. K., Sidhu, G. P. S., Bali, A. S. & Zheng, B. (2019). Phytohormones regulate accumulation of osmolytes under abiotic stress. Biomolecules, 9(7), 285-321.
42. Srinivasan, K. (2006). Fenugreek (Trigonella foenum-graecum): A review of health beneficial physiological effects. Food-Reviews- International, 22, 203–224.
43. Sytar, O., Kumari, P., Yadav, S., Brestic, M. & Rastogi, A. (2019). Phytohormone priming: regulator for heavy metal stress in plants. Journal of Plant Growth Regulation, 38(2), 739-752.
44. Upadhyay, S., Phukan, U. J., Mishra, S. & Shukla, R. K. (2014). De novo leaf and root transcriptome analysis identified novel genes involved in Steroidal sapogenin biosynthesis in Asparagus racemosus. BMC genomics, 15(1), 746.
45. Vardhini, B. V. & Anjum, N. A. (2015). Brassinosteroids make plant life easier under abiotic stresses mainly by modulating major components of antioxidant defense system. Frontiers in Environmental Science, 2, 1-16.
46. Wang, L. J., Fan, L., Loescher, W., Duan, W., Liu, G. J., Cheng, J. S., Luo, H. B. & Li, S. H. (2010). Salicylic acid alleviates decreases in photosynthesis under heat stress and accelerates recovery in grapevine leaves. BMC plant biology, 10(1), 34-48.
47. Wu, C., Li, F., Xu, H., Zeng, W., Yu, R., Wu, X. & Li, J. (2019). The potential role of brassinosteroids (BRs) in alleviating antimony (Sb) stress in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry, 141, 51-59.
48. Xu, J., Liu, T., Yang, S., Jin, X., Qu, F., Huang, N. & Hu, X. (2019). Polyamines are involved in GABA-regulated salinity-alkalinity stress tolerance in muskmelon. Environmental and Experimental Botany, 164, 181-189.

[1] - Rosase

[2] - Legouminosae

[3]- Antimony

[4]-  Malondialdeide

[5] - Thiobarbituric acid

[6] - Guaiacol

[7]- Deetiolated (Det)