به‌گزینی تحمل یخ‌زدگی ژنوتیپ‌های عدس با استفاده از کلروفیل فلورسانس

مقدمه

عدس (Lens culinaris Medik.) یکی از مهم‌ترین حبوبات یک‌ساله با دانه‌هایی غنی از پروتئین، آهن و روی می‌باشد (Gorim & Vandenberg, 2017). این گیاه دارای فیبر بالا و چربی پایینی است (Jarpa-Parra, 2018) و از لحاظ میزان فیبرهای محلول، غنی‌تر از نخود (Cicer arietinum L.) است (Brummer et al., 2015). علاوه بر این، به دلیل توانایی تثبیت نیتروژن و بهبود حاصلخیزی خاک می‌تواند در تناوب با غلات نیز قرار گیرد (Choudhary et al., 2017). طبق آمار سازمان خواربار و کشاورزی ملل متحد (فائو) در سال 2019، سطح زیر کشت این محصول در ایران 135 هزار هکتار و میزان عملکرد عدس حدود 523 کیلوگرم در هکتار بود. متوسط عملکرد عدس در این سال در ایران 3/2 برابر کمتر از متوسط جهانی و سهم ایران از کل تولیدات جهانی این گیاه تنها حدود 71 هزار تن بود (FAOSTAT, 2020).

از عوامل اصلی این کاهش، پتانسیل پایین عملکرد ارقام و توده‌های محلی، عدم برداشت مکانیزه (Jawad et al., 2019)، متغیر بودن الگوی بارندگی سالانه و احتمال برخورد گیاه با خشکی انتهای فصل و کاهش عملکرد در کشت‌های معمول بهاره می‌باشد (Dai, 2011)؛ بنابراین یکی از استراتژی‌های موثر به‌منظور بهبود محصول، انجام کشت پاییزه گیاه (Casado et al., 2016) و برخوداری از مزایای آن نظیر افزایش طول دوره رشد، استفاده مناسب از نزولات جوی و جلوگیری از برخورد دوران رسیدگی گیاه با تنش‌های خشکی و گرما در اواخر رشد است (Strydhorst et al., 2015). با وجودی‌که میزان عملکرد در حبوبات سردسیر در کشت‌های پاییزه در مناطقی که دارای زمستان‌های معتدل می‌باشند، اغلب دو برابر کشت‌های بهاره است، اما مرگ زمستانه، عامل عمده محدودکننده تولید در این نواحی محسوب می‌شود؛ بنابراین با شناسایی ژنوتیپ‌های مقاوم به سرما و توسعه کشت آن‌ها در این مناطق می‌توان، میزان تولید را بهبود بخشید (Mugabe et al., 2019).

امروزه انواع مطالعات بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و مولکولی به‌منظور شناسایی و انتخاب ژنوتیپ‌های متحمل و حساس گیاهان زراعی تحت تنش‌های محیطی مورد استفاده قرار می‌گیرد. اما این روش‌ها مستلزم زمان و هزینه زیاد است و همچنین مطالعه تعداد زیادی از ژنوتیپ‌ها، تنها بر پایه بررسی‌های ژنتیک مولکولی دشوار می‌باشد؛ در این میان، استفاده از روش فلورسانس کلروفیل به‌عنوان یک راه حل مناسب مطرح است(Badeck & Rizza, 2015) . این روش، به‌عنوان روشی سریع و غیرتخریبی به‌منظور بررسی میزان تحمل ارقام به تنش مورد استفاده قرار می‌گیرد Rapacz et al., 2015)). در اثر سرما، فعالیت چرخه کالوین کاهش می‌یابد ولی واکنش‌های نوری فتوسنتز تحت تاثیر دما قرار نمی‌گیرند. سرما سبب اختلال در زنجیره انتقال الکترون و آسیب به مراکز واکنش فتوسیستم I و II می‌شود؛ در نتیجه مقدار زیادی از انرژی نورانی جذب شده به صورت گرما و فلورسانس به‌هدر می‌رود.(Thalhammer et al., 2014) خسارت اولیه تنش سرما، شامل تغییر در انسجام و فعالیت غشای سلولی و در نتیجه افزایش نشت محلول‌های سلولی به خارج از سلول می‌باشد. پایداری غشای تیلاکوئید، میزان تحمل ژنوتیپ‌ها و همچنین میزان آسیب وارده به گیاه در مواجه با تنش، از طریق اندازه‌گیری فلورسانس کلروفیل قابل ارزیابی است (Mishra et al., 2014). مولفه‌های فلورسانس کلروفیل نظیر بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در شرایط سازگار شده به نور (F′v/F′m)، کارایی عملیاتی فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور (F′q/F′m)، فرود انرژی فتوشیمیایی و ضریب باز بودن مراکز واکنش فتوسیستم II (qL) به‌طور گسترده‌ای به‌منظور بررسی میزان تحمل گیاهان به انواع تنش‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد (Menezes-Sliva et al., 2017). تغییر در مولفه‌های فلورسانس کلروفیل در طی تنش سرما مشاهده شده است (Zhou et al., 2017)، اما میزان این تغییرات بسته به واریته، شدت و مدت زمان تنش متفاوت است (Zhou et al., 2018a). مناسب بودن بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II برای تشخیص شدت خسارت وارده به گیاه باقلا (Vicia faba L.) تحت تنش سرما گزارش شده است (Zhou et al., 2018a). سرما سبب تغییر در مولفه‌های فلورسانس کلروفیل می‌شود و میزان این کاهش در ارقام متحمل به‌صورت معنی‌داری کمتر از ارقام حساس بود، اما باید توجه داشت که این کاهش تا حدی در طی دوره بازیابی قابل جبران است (Humplik et al., 2015). مناسب‌تر بودن اندازه‌گیری بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در شرایط سازگار شده به نور (F′v/F′m) در 24 ساعت بعد از اعمال تنش یخ‌زدگی در مقایسه با اندازه گیری آن بلافاصله بعد از اعمال تنش، در ارزیابی میزان خسارت وارده به گیاه و تعیین ژنوتیپ‌های متحمل به یخ‌زدگی مشاهده شده است (Badeck & Rizza, 2015). بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در واریته‌های وحشی گوجه‌فرنگی (Solanum lycopersicum L., formerly Lycopersicone sculentum Mill.)، تحت تاثیر تنش دمایی قرار نگرفت و این واریته‌ها از بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور، کارایی عملیاتی فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور و ضریب باز بودن مراکز واکنش فتوسیستم II بالاتری در مقایسه با واریته‌های زراعی برخوردار بودند. به‌طورکلی، نتایج نشان‌دهنده مقاومت بالاتر واریته‌های وحشی در مقایسه با واریته‌های زراعی به تنش‌های دمایی بود (Zhou et al., 2018b).

با توجه به مزایای کشت پاییزه شامل افزایش ارتفاع بوته، افزایش عملکرد و استفاده از بارندگی‌ها و وجود تنوع ژنتیکی قابل توجه بین ژنوتیپ‌های عدس از نظر خصوصیات زراعی، مورفولوژیکی و فنولوژیکی (Gautam et al., 2014)، آزمایش حاضر به‌منظور ارزیابی تحمل به یخ‌زدگی در ژنوتیپ‌های منتخب عدس در شرایط کنترل شده انجام شد.

مواد و روش‌ها

این پژوهش در پاییزه و زمستان 1397 در گلخانه تحقیقاتی پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد به‌صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. عوامل مورد بررسی شامل 20 ژنوتیپ‌ منتخب عدس (جدول 1) از مطالعات پیشین (Gholami Rezvani, et al., 2019; Hojjat & Galstyan, 2014) و سه دمای یخ‌زدگی شامل صفر، 18- و 20- درجه سانتی‏گراد بودند. بذرها پس از ضدعفونی در دهه دوم مهرماه به تعداد 15 عدد در عمق یک سانتی‏متری گلدان‌های پلاستیکی با قطر 10سانتی‌‌متر و ارتفاع 11 سانتی‌متر حاوی 25 درصد شن و 75 درصد خاک مزرعه کشت شدند و پس از استقرار به 10 بوته تنک شدند. آبیاری گلدان‌ها هر دو روز یک‌بار انجام شد و به‌منظور اعمال خوسرمایی، گیاهان در شرایط طبیعی (شکل 1) تا مرحله گیاهچه‌ای رشد کردند.

شکل 1- بارندگی و متوسط دمای حداقل و حداکثر ماهانه در پاییز و زمستان 1397 در مشهد.

Figure 1. Rainfall, minimum and maximum temperatures during fall and winter in 2018-2019, Mashhad.

گلدان‏ها 24 ساعت قبل از اعمال تنش یخ‌زدگی آبیاری شدند و سپس برای اعمال دماهای یخ‌زدگی در اواسط بهمن‌ماه مطابق با زمان معمول یخ‌بندان در منطقه به فریزر ترموگرادیان منتقل شدند. دمای فریزر در ابتدای آزمایش پنج درجه سانتی‌گراد بود و پس از قرار دادن نمونه‌ها با سرعت دو درجه سانتی‏گراد در ساعت کاهش یافت (Murray et al., 1988). به‌منظور ایجاد هستک یخ در گیاه و اجتناب از بروز پدیده فرا سرما، پاشش باکتری‌های ایجادکننده هستک یخ (Ice Nucleation Active Bacteria) در دمای 2- درجه سانتی‌گراد روی گیاه انجام شد (Wisniewski et al., 2002). به‌منظور ایجاد تعادل در دمای محیط، گیاهچه‌ها در هر تیمار دمایی به مدت یک ساعت نگهداری و سپس به مدت یک شب در اتاقک سرد با دمای 1±5 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند.

جدول 1- ژنوتیپ‌های عدس مورد استفاده در آزمایش¹

Table 1. Lentil genotypes used in experiment¹

1- کلکسیون عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد                                       1-MLC: Mashhad Lentil Collection

قبل از قرارگیری نمونه‌ها در معرض دماهای یخ‌زدگی، عوامل فلورسانس کلروفیل برگ اندازه‌گیری شد. روند تغییرات عوامل فلورسانس کلروفیل در هر تیمار دمایی بر اساس زمان خارج شدن آن‌ها از فریزر ترموگرادیان با فواصل 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از اعمال تنش یخ‌زدگی در هر تیمار دمایی با استفاده از دستگاه فلورومتر (مدل OS1-FL شرکت OptiScience) و روی برگچه جوان‌ترین برگ کاملاً توسعه‌یافته در سه بوته بررسی شد. صفات اندازه‌گیری شده شامل کلروفیل فلورسانس لحظه‌ای سازگار شده به نور (F^')، کمینه بازتاب فلورسانس از برگ سازگار شده به نور (F^'_o)، بیشینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور (F^'_m) و فلورسانس متغیر (F^'_v) بودند. همچنین با استفاده از این عوامل، شاخص‌های F′v/F′m، F′q/F′m، F′q/F′v و qL محاسبه شدند (جدول 2).

جدول 2- صفات، معادلات و تعاریف عوامل فلورسانس کلروفیل اندازه‌گیری شده در آزمایش (Baker, 2008).

Table 2. Commonly used abbreviations, equations and identify (Baker, 2008)

برای ارزیابی بقا و بازیافت گیاهان، نمونه‌ها به گلخانه‌ای با میانگین دمای 5±23 درجه سانتی‌گراد و فتوپریود 14 ساعت منتقل شدند. چهار هفته پس ‌از آن، درصد بقا و بازیافت نمونه‌ها (SU[1]%) ارزیابی شد. درصد بقای گیاهان از طریق شمارش تعداد بوته زنده قبل (B) و پس از تنش یخ‌زدگی (A) در هر گلدان محاسبه شد (معادله 1) و وزن خشک گیاهان (48 ساعت پس از قرار گرفتن در آون 70 درجه سانتی‏گراد) نیز اندازه‌گیری شد.

معادله (1)     

تجزیه‌و‌تحلیل آماری داده‌ها با نرم‌افزار Minitab 17 انجام شد و برای نرمال بودن داده‌ها و مقایسه میانگین‌ آن‌ها، به‌ترتیب از آزمون آماری شاپیرو-ویلک و آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال پنج درصد استفاده شد. برای برآورد همبستگی و تجزیه خوشه‌ای (بر اساس روش ward) از نرم‌افزار JMP4 و برای تجزیه به مؤلفه‌های اصلی از نرم‌افزار STATISTICA8 استفاده شد.

نتایج و بحث

برهمکنش دمای یخ‌زدگی و دوره بازیابی بر کمینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور (F^'₀) معنی‌دار بود (جدول 3). بررسی روند تغییرات F'_o نشان داد که در ساعات اولیه پس از تنش یخ‌زدگی، این متغیر در دماهای صفر و 18- درجه سانتی‏گراد با کاهش، اما در دمای 20- درجه با افزایش مواجه شد، اما در تمامی تیمارهای دمایی کمینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور روندی کاهشی را نشان داد و مقدار این شاخص 96 ساعت پس از تنش یخ‌زدگی کمتر از 12 ساعت پس از تنش یخ‌زدگی بود، به‌طوری که این شاخص در 96 ساعت پس از تنش یخ زدگی در مقایسه با 12 ساعت پس از اعمال تنش در دماهای صفر، 18- و 20- درجه سانتی‌گراد به‌ترتیب از کاهش 27، 33 و 31 درصدی برخوردار بود (جدول 4).

جدول 3- منابع تغییر، درجه آزادی و میانگین مربعات عوامل فلورسانس کلروفیل ژنوتیپ‌های عدس در سطوح مختلف تنش یخ‌زدگی و زمان اندازه‌گیری در دوره بازیابی

Table 3. Source of variation, degree of freedom and mean square of chlorophyll fluorescence parameters in lentil genotypes under freezing stress and time measurement in the time points.

**و ns: به‌ترتیب معنی‌دار در سطح احتمال یک درصد و غیر معنی‌دار در سطح احتمال پنج درصد. CV: ضریب تغییرات.

** and ns: significant at 1% of probability level and nonsignificant, CV: Coefficient of Variation.

جدول 4- اثر دماهای یخ‌زدگی و دوره‌های بازیابی بر عوامل فلورسانس کلروفیل در عدس

Table 4. Effect of freezing temperature and time point on chlorophyll fluorescence parameters in the lentil genotypes.

MLC: کلکسیون عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد. در هر ستون، میانگین‌های دارای حروف مشابه در هر صفت در سطح احتمال پنج درصد تفاوت معنی‌داری ندارند.

MLC: Mashhad Lentil Collection. In each column means with the same letter(s) are not significantly different (P≤0.05).

F'_o

، بیانگر سطحی از فلورسانس در زمانی است که پذیرنده کوئینون آ (QA) در بالاترین سطح اکسیداسیونی قرار داشته باشد و مراکز واکنش باز هستند (Murchie & Lawson, 2013). هرچه مقدار این شاخص کمتر باشد، نشان‌دهنده انجام مطلوب فعالیت‌های فتوسنتزی و انتقال سریع‌تر الکترون می‌باشد، درحالی‌که بالا بودن این شاخص، نشان‌دهنده آسیب به زنجیره انتقال الکترون فتوسیستم II در اثر کاهش ظرفیت QA و عدم اکسیداسیون کامل آن به دلیل کند شدن جریان الکترون در فتوسیستم II است. به‌عبارتی، ژنوتیپ‌هایی که از سرعت انتقال الکترون بالاتری در طول زنجیره پلاستوکوئینون برخوردارند، مقاومت بیشتری نسبت به تنش یخ‌زدگی از خود نشان می‌دهند (Swoczyna et al., 2020). در واریته‌های حساس به سرمای گوجه‌فرنگی، نسبت انتقال الکترون به جریان انرژی ویژه بیان شده کاهش یافته است (Zushi et al., 2012)، در‌حالی‌که ارقام مقاوم به سرمای گندم(Triticum aestivum L.) ، از نسبت انتقال الکترون به جریان انرژی ویژه بیان شده بالاتری برخوردار بودند. بین این نسبت با میزان بقای زمستانه گیاهان همبستگی مثبت و معنی‌داری مشاهده شده است (Rapacz et al., 2015; Swoczyna et al., 2020).

مؤلفه بیشینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور (F^'_m)، تحت تاثیر برهمکنش دمای یخ‌زدگی و دوره بازیابی قرار گرفت (جدول 3). این متغیر ابتدا در دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد با کاهش مواجه شد و سپس در دوره بازیافت، به‌تدریج مقدار آن افزایش یافت، به‌طوری‌که مقدار این مؤلفه در 96 ساعت بعد از اعمال تنش در دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد به‌ترتیب چهار و 15 درصد بیشتر از مقدار آن در شرایط بدون اعمال تنش بود. با اعمال تنش یخ‌زدگی در دمای 20- درجه سانتی‌گراد، روند کاهشی در مؤلفه F^'_m مشاهده شد؛ به‌عبارتی، افزایش شدت تنش یخ‌زدگی، سبب اختلال و کاهش در بیشینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور شد، به حدی که گیاهان قادر به بازیابی و ترمیم این مؤلفه نبودند (جدول 4).

F^'_m تحت تاثیر برهمکنش ژنوتیپ و دوره بازیابی قرار گرفت (جدول 3). این متغیر در بیشتر ژنوتیپ‌های مورد بررسی نیز پس از اعمال تنش یخ‌زدگی با کاهش مواجه شد و سپس به تدریج در دوره بازیافت افزایش یافت. همچنین تنش یخ‌زدگی در تمام ژنوتیپ‌ها، سبب افزایش F'_m تا 24 پس از تنش یخ‌زدگی در مقایسه با F'_m قبل از اعمال تنش یخ‌زدگی شد. ژنوتیپ MLC334 با 25 درصد، بیشترین کاهش F'_m را پس از گذشت 96 ساعت در مقایسه با 12 ساعت پس از تنش یخ‌زدگی داشت، درحالی‌که در این زمان، ژنوتیپ‌های MLC13، MLC33، MLC38، MLC74، MLC103، MLC286، MLC303 و MLC469 از F'_m بالاتری در 96 ساعت بعد از اعمال تنش در مقایسه با 12 ساعت برخوردار بودند که این امر نشان‌دهنده توانایی بالایی این ژنوتیپ‌ها در حفظ بیشینه فلورسانس برگ و بازیافت مناسب آن‌ها پس از تنش یخ‌زدگی می‌باشد (جدول 5).

برهمکنش ژنوتیپ و دمای یخ‌زدگی، تاثیر معنی‌داری بر بیشینه فلورسانس سازگار شده به نور داشت (جدول 3). بجز در ژنوتیپ MLC13، تفاوتی از لحاظ مقدار F'm در سایر ژنوتیپ‌ها بین دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد مشاهده نشد. کاهش دماهای یخ‌زدگی به‌ویژه از 18- به 20- درجه سانتی‏گراد، سبب کاهش F'm در تمام ژنوتیپ‌های مورد مطالعه شد. کمترین میزان تغییر در این مؤلفه، در نتیجه کاهش دو درجه‌ای دما در ژنوتیپ MLC409 مشاهده شد (کاهش هفت درصدی)، به این دلیل که این ژنوتیپ قادر به بقا در دمای 18- درجه سانتی‌گراد نبود؛ بنابراین تفاوت زیادی در این مؤلفه در دماهای 18- و 20- در آن مشاهده نشد (جدول 6).

کلروفیل P680 در مرکز واکنش فتوسیتم II با شکسته شدن مولکول آب (در فضای داخلی تیلاکوئید) دو الکترون دریافت می‌کند. این الکترون‌ها از طریق فئوفیتین به QA که اولین پذیرنده الکترون در فتوسیستم است، منتقل می‌شود. QA تا زمانی که الکترون را به گیرنده الکترون بعدی یعنی QB منتقل نکرده باشد، قادر نیست الکترون دیگری را از P680 دریافت کند. با انتقال الکترون بهQB و سپس پلاستوکوئینون، الکترون به فتوسیستم I منتقل می‌شود و در نتیجه آن، ATP و NADPH تولید می‌شود. در این حالت، سیستم دارای کمترین فلورسانس است(F'o)  و مراکز واکنش باز هستند. با افزایش درجه احیا شدن، فلورسانس افزایش می‌یابد و در مرحله احیای کامل، دیگر الکترون به فتوسیستم I منتقل نمی‌شود و مراکز واکنش فتوسیستم II در حالت بسته قرار دارند؛ در این حالت، فلورسانس در حداکثر مقدار خود است(F'm) . تنش‌های محیطی با تاثیر منفی بر ظرفیت پذیرش و انتقال الکترون باعث می‌شوند که سیستم سریع‌تر به F'm برسد که نتیجه آن، کاهش فلورسانس متغیر خواهد بودF'v=F'm-F'o)).

جدول 5- بیشینه فلورسانس سازگار شده به نور در ژنوتیپ‌های عدس در دوره بازیابی

Table 5. F^'_m in lentil genotypes during time points

MLC: کلکسیون عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد. میانگین‌های دارای حروف مشابه در هر صفت، درصد تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال پنج ندارند.

MLC: Mashhad Lentil Collection. Means with the same letter in the same trait are not significantly different (P≤0.05).

جدول 6- بیشینه فلورسانس سازگار شده به نور در ژنوتیپ‌های عدس در دماهای یخ‌زدگی

Table 6. F^'_m parameters in lentil genotypes at freezing temperature

MLC: کلکسیون عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد. میانگین‌های دارای حروف مشابه در هر صفت، تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

MLC: Mashhad Lentil Collection. Means with the same letters in the same trait are not significantly different (P≤0.05).

همچنین بسته شدن مراکز واکنش، تاثیر منفی بر بیشینه کارایی پتانسیل فتوسیستم II خواهد داشت (Murchie & Lawson, 2013). بررسی F'm در شش ژنوتیپ وحشی و یک ژنوتیپ زراعی گوجه‌فرنگی نشان داد که کاهش دما، موجب کاهش این مؤلفه در تمام ژنوتیپ‌ها در مقایسه با شاهد شد. ژنوتیپ‌های وحشی در مقایسه با ژنوتیپ‌ زراعی، از کاهش F'm کمتری برخوردار بودند.(Zhou et al., 2018b) کاهش دما، تاثیری بر کمینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور نداشت، اما بیشینه فلورسانس برگ سازگار شده به نور و بیشینه کارایی پتانسیل فتوسیستم II را به‌طورمعنی‌داری در گیاهچه‌های برنج (Oryza sativa L.) کاهش داد (Zhao et al., 2020).

برهمکنش ژنوتیپ، دمای یخ‌زدگی و دوره بازیابی بر فلورسانس متغیر (F'v) معنی‌دار بود (جدول 3). کاهش دما به 20- درجه سانتی‏گراد در تمامی دوره‌های بازیابی در تمام ژنوتیپ‌های مورد مطالعه، سبب کاهش F^'_v شد. در بیشتر ژنوتیپ‌ها، قرارگیری در معرض دمای 18- درجه سانتی‌گراد تا 12 ساعت بعد از اعمال تنش یخ‌زدگی، سبب کاهش و سپس افزایش در مقدار این مؤلفه شد. در تمامی ژنوتیپ‌ها در دمای 20- درجه سانتی‏گراد، روندی کاهشی در مقدار F^'_v مشاهده شد و با وجود افزایش جزئی در برخی ژنوتیپ‌های مورد بررسی، این مؤلفه 96 ساعت پس از اعمال تنش به مقدار خود در ساعات اولیه تنش یخ‌زدگی نرسید (جدول 7). تمامی ژنوتیپ‌های مورد مطالعه، در دمای 20- درجه سانتی‌گراد از بین رفتند (شکل 2). به دلیل وجود همبستگی مثبت و معنی‌دار بین درصد بقا و F^'_v (^**66/0r²=) می‌توان نتیجه گرفت که این ژنوتیپ‌ها قادر به بازیابی این مؤلفه در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نبودند (جدول‌ 7، 9). مقادیر پایین فلورسانس متغیر، نشان‌دهنده کاهش فعالیت فتوسیستم II و اتلاف انرژی به صورت گرما است. همچنین تنش‌های محیطی مانند تنش‌ سرما، به دلیل خسارت به غشای تیلاکوئید، سبب کاهش این شاخص می‌شوند (Goltsev et al., 2016).

روند تغییرات بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II(F′v/F′m) در دوره بازیافت، تحت تأثیر دماهای یخ‌زدگی معنی‌دار بود (جدول 3)، به‌طوری‌که بررسی تغییرات این شاخص نشان داد که کمترین میزان تغییرات آن در دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد و بیشترین تغییرات در دمای 20- درجه سانتی‌گراد مشاهده شد. همچنین 24 ساعت پس از اعمال تنش یخ‌زدگی در دماهای صفر و 20- درجه سانتی‌گراد، این مؤلفه به حداقل مقدار خود رسید، درصورتی‌که کمترین میزان این شاخص در دمای 18- درجه سانتی‏گراد 12 ساعت بعد از اعمال تنش مشاهده شد. با گذشت 48 ساعت از اعمال تنش یخ‌زدگی، روند مطلوب بازیافت در هر سه دمای یخ‌زدگی رخ داد. به این ترتیب که به‌تدریج و با گذشت زمان، میزان F′v/F′m افزایش یافت و جز در دمای 20- درجه سانتی‌گراد، در دو دمای دیگر به بیش از میزان اولیه خود رسید. به‌عبارتی، ژنوتیپ‌هایی که در معرض دمای 18- درجه سانتی‌گراد قرار گرفته بودند، پس از گذشت 48 ساعت، از توانایی بازیابی مناسبی برخوردار بودند که این مسئله نشان‌دهنده تحمل بالای آن‌ها در مواجهه با تنش یخ‌زدگی بود (شکل 2).

مولفه‌های فلورسانس کلروفیل می‌توانند برای درک تاثیر خوسرمایی بر فرآیندهای فتوسنتزی گیاه مورد استفاده قرار گیرند. به‌طوری که خوسرمایی در نمونه‌های مقاوم و حساس به سرمای آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana L.)، سبب کاهش کمتر در شاخص F′_v/F′_m در مقایسه با زمانی شد که این نمونه‌های قبل از اعمال تنش در معرض خوسرمایی قرار نداشتند. همچنین کاهش این مؤلفه در نمونه‌های مقاوم، کمتر از نمونه‌های حساس بود (Mishra et al., 2014). بنابراین شاید بتوان یکی از دلایل افزایش این مؤلفه در طول دوره بازیابی را خوسرمایی مناسب ژنوتیپ های مورد مطالعه دانست. با توجه به این‌که بیشتر ژنوتیپ‌های مورد مطالعه (بجز سه ژنوتیپ MLC83، MLC103 و MLC409) از بقای بالای 50 درصد در دمای 18- درجه سانتی‌گراد برخوردار بودند، توانستند بازیابی مناسبی را بعد از اعمال تنش در دمای 18- درجه سانتی‌گراد از خود نشان دهند، به‌طوری‌که تفاوت زیادی در شاخص F′_v/F′_m  بین دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد در طی دوره بازیابی مشاهده نشد (شکل‌ 2، 3).

جدول 7- فلورسانس متغیر ژنوتیپ‌های عدس در دماهای یخ‌زدگی و دوره بازیابی

Table 7. F^'_v parameter in the lentil genotypes at freezing temperature and during time point

MLC: کلکسیون عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد. میانگین‌های دارای حروف مشابه در هر صفت، تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

MLC: Mashhad Lentil Collection. Means with the same letters in the same trait are not significantly different (P≤0.05).

شکل 2- روند تغییرات بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور (F′_v/F′_m) در دوره بازیابی تحت تاثیر دماهای یخ‌زدگی. بارها نشان‌دهنده خطای استاندارد هستند.

Figure 2. Trends of maximum efficiency of PSII photochemistry (Fv′/F´m) in the light under freezing stress during recovery period. Vertical bars indicate standard error

در ژنوتیپ‌های عدس، شاخص F′v/F′m تحت تأثیر دما و دوره بازیابی معنی‌دار بود (جدول 3). در بیشتر ژنوتیپ‌های مورد مطالعه، تفاوت زیادی بین این مؤلفه در دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد در طی دوره بازیابی مشاهده نشد. در دمای 18- درجه سانتی‌گراد در تمام ژنوتیپ‌ها، ابتدا روند کاهشی و سپس افزایشی در این شاخص در طول دوره بازیابی مشاهده شد، به‌طوری‌که میزان این شاخص در 96 ساعت بعد از اعمال تنش در بیشتر ژنوتیپ‌ها به مقدار اولیه خود در زمان قبل از تنش اعمال یخ‌زدگی رسید. تنها ژنوتیپ MLC103 کمترین توانایی در بازیابی آسیب حاصل از تنش یخ‌زدگی به فتوسیستم II را در دمای 18- درجه سانتی‌گراد داشت، به‌طوری‌که با وجود بهبود این شاخص در دمای مذکور در طول دوران بازیابی، مقدار شاخص F′v/F′m در آن در اتمام دوران بازیابی در حدود پنج درصد کمتر از زمان قبل از اعمال تنش بود. در تمامی ژنوتیپ‌ها، قرارگیری در معرض دمای 20- درجه سانتی‌گراد سبب کاهش این مؤلفه شد. هرچند برخی ژنوتیپ‌ها توانستند در طول دوره بازیابی، مقدار این شاخص را بهبود بخشند، اما مقدار آن در بیشتر ژنوتیپ‌ها به مقدار اولیه قبل از تنش و ساعات اولیه پس از اعمال تنش نرسید. همچنین با بررسی روند تغییرات بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II مشخص شد که ژنوتیپ MLC286 از کمترین میزان نوسان پس از تنش یخ‌زدگی در دماهای 18- و 20- درجه سانتی‌گراد نسبت به سایر ژنوتیپ‌ها برخوردار بود. علاوه‌براین، ژنوتیپ مذکور در جبران کاهش بیشینه‌ کارایی فتوسیستم II در دوره بازیافت، قابلیت بالایی داشت، به‌طوری‌که شاخصF′_v/F′_m  در این ژنوتیپ در دمای 20- درجه سانتی‌گراد و 96 ساعت پس از تنش یخ‌زدگی در مقایسه با قبل از تنش یخ‌زدگی، فقط دو درصد کاهش داشت. همچنین ژنوتیپ MLC303 با وجود کاهش در این شاخص تا 48 ساعت بعد از اعمال تنش دمایی 20- درجه سانتی‌گراد، توانست مقدار این مؤلفه را بهبود ببخشد، به‌طوری‌که میزان آن در 96 ساعت بعد از اعمال تنش، 9/78 درصد بیشتر از 12 ساعت پس از اعمال تنش بود. به‌عبارتی، ژنوتیپ‌های MLC286 و MLC303 از توانایی بالاتری در حفظ ساختارهای فتوسنتزی در مواجهه با تنش یخ‌زدگی برخوردار بود.

کاهش دما سبب کاهش F′v/F′m در مقایسه با شاهد شد. هر چند دوره بازیابی سبب افزایش این مؤلفه در مقایسه با شاهد شد، اما به مقدار اولیه خود به قبل از اعمال تنش نرسید (Ortiz et al., 2017). میزان F′v/F′m در ژنوتیپ‌های باقلا تحت تنش سرما بین 448/0 تا 633/0 متغیر بود. بیشترین کاهش در این مؤلفه نسبت به شاهد (کاهش 9/45 درصدی) مشاهده شد. هرچند کاهش دما سبب کاهش این مؤلفه در تمامی ژنوتیپ‌های مورد مطالعه شد، اما اندازه‌گیری این مؤلفه 24 ساعت پس از اعمال تنش، نشان‌دهنده افزایش F′v/F′m در مقایسه با زمان تنش بود؛ هرچند مقدار آن به زمان قبل از اعمال تنش نرسید (Zhou et al., 2018a).

شکل 3- روند تغییرات بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور (Fv′/F´m) در ژنوتیپ‌های عدس در دماهای یخ‌زدگی و دوره بازیابی. بارها نشان‌دهنده خطای استاندارد هستند.

Figure 3. Trends of maximum efficiency of PSII photochemistry in the light (Fv′/F´m) in lentil genotypes in freezing temperature and during recovery period. Vertical bars indicate standard error

تنش دمایی سبب کاهش فعالیت آنزیم رویسکو، کاهش آسیمسیلاسیون دی اکسیدکربن به دلیل بسته شدن روزنه‌ها، اختلال در سیستم انتقال الکترون فتوسنتزی، تخریب پروتئین‌های D1 و D2 در مرکز واکنش فتوسیستم II و اختلال در کارکرد کمپلکس‌های آزادکننده اکسیژن در فتوسیستم II می‌شود. حذف پروتئین‌های D1 و D2، تاثیر منفی بر فعالیت فتوسیستم II دارد (Sasi et al., 2018). ارتباط مثبتی بین حفظ زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی و فعالیت فتوسیستم II با فعالیت پروتئین D1 در مرکز واکنش این فتوسیستم (مسئول بیان ژن psbA که ژن مقاومت به سرما است) مشاهده شده است (Shi et al., 2019)؛ بنابراین ژنوتیپ‌های متحمل به سرما از توانایی بیشتری در حفظ فعالیت‌های فتوسنتزی و حفظ زنجیره انتقال الکترون فتوسنتزی برخوردارند.

برهمکنش ژنوتیپ، دمای یخ‌زدگی و دوره بازیابی، تاثیر معنی‌داری بر کارایی عملیاتی فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور (ΦPSII =F′q/F′m) داشتند (جدول 3). کاهش دما در تمامی ژنوتیپ‌ها در تمامی دوره‌های بازیابی، سبب کاهش F′_q/F′_m شد. دمای صفر درجه سانتی‏گراد در تمامی ژنوتیپ‌ها، سبب افزایش این مؤلفه در طول دوره بازیابی شد، به‌طوری‌که میزان F′_q/F′_m در تمامی ژنوتیپ‌ها در 96 ساعت بعد از اعمال تنش، بیشتر از قبل و 12 ساعت بعد از اعمال تنش بود. در بیشتر ژنوتیپ‌ها، قرارگیری در معرض دمای 18- درجه سانتی‌گراد در طی دوره بازیابی، سبب کاهش و سپس افزایش این مؤلفه شد. بجز سه ژنوتیپ MLC11، MLC83 و MLC103 در سایر ژنوتیپ‌ها، مقدار این مؤلفه در پایان زمان بازیابی، بیشتر از قبل و 12 ساعت بعد از اعمال تنش بود. به‌عبارتی، اکثر ژنوتیپ‌های مورد مطالعه از توانایی مناسبی به‌منظور بازیافت این مؤلفه در دمای 18- درجه سانتی‌گراد برخوردار بودند. در اکثر ژنوتیپ‌ها، تنش دمایی 20- درجه سانتی‌گراد 24 ساعت پس از تنش، سبب کاهش شاخص F′_q/F′_m به حداقل میزان خود شد. هرچند برخی از ژنوتیپ‌ها توانستند میزان این شاخص را در طی دوره بازیابی افزایش دهند، اما بجز ژنوتیپ MLC303 در سایر ژنوتیپ‌ها، مقدار این شاخص به مقدار قبل از اعمال تنش نرسید. در بین ژنوتیپ‌های مورد بررسی، کارایی عملیاتی فتوسیستم II ژنوتیپ MLC84 در مقایسه با سایر ژنوتیپ‌ها در پایان دوره بازیابی در دمای 20- درجه سانتی‌گراد پایین‌تر بود، به‌طوری‌که مقدار این شاخص در 96 ساعت بعد از اعمال تنش در این ژنوتیپ، 8/7 برابر کمتر از زمان قبل از اعمال تنش بود؛ این نتایج نشان‌دهنده وجود تنوع ژنتیکی بالا در ژنوتیپ‌های عدس می‌باشد. تفاوت معنی‌داری بین دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد در طی دوره‌های بازیابی در ژنوتیپ‌های مورد مطالعه مشاهده نشد که این مسئله بیانگر توانایی بالای آن‌ها در بازیافت پس از اعمال تنش یخ‌زدگی در این دماها می‌باشد. همبستگی مثبت و معنی‌دار بین این شاخص با درصد بقا (^**73/0r²=) مشاهده شده (جدول 9) که موید این مطلب است که با وجود بقای بالای 50 درصد در اکثر ژنوتیپ‌ها در دمای 18- درجه سانتی‌گراد و عدم تحمل دمای 20- درجه توسط آن‌ها (شکل 3)، ژنوتیپ‌های مورد بررسی، قادر به بازیابی مناسب این شاخص در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نیستند (جدول 8). به‌عبارتی، نتایج نشان‌دهنده وجود پتانسیل بازیابی مناسبی در ژنوتیپ‌های عدس مورد بررسی می‌باشد.

کاهش دما سبب کاهش کارایی عملیاتی فتوسیستم II در گیاهچه‌های وحشی و زراعی گوجه فرنگی شد. تنها در دو واریته وحشی (Solanum pennellii) Pe و(Solanum peruvianum)  Pr1، تفاوتی بین این شاخص در شرایط کاهش دما و شاهد مشاهده نشد (Zhou et al., 2018b). کاهش کارایی عملیاتی فتوسیستم II در دوره بازیافت پس از تنش یخ‌زدگی روند کاهشی داشت، به‌طوری‌که پس از دو روز به حداقل میزان خود رسید. هرچند بررسی‌ها نشان‌دهنده افزایش این مؤلفه در طی دوره بازیابی در طی روزهای دوم تا پنجم بود، اما مقدار این شاخص به مقدار اولیه قبل از اعمال تنش نرسید (Hou et al., 2016).

جدول 8- کارایی عملیاتی فتوسیستم II در شرایط سازگار شده با نور در ژنوتیپ‌های عدس در دماهای یخ‌زدگی و دوره بازیابی

Table 8. F′_q/F′_m in the lentil genotypes at the freezing temperature and during time point

MLC: کلکسیون عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد. میانگین‌های دارای حروف مشابه در هر صفت، تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

MLC: Mashhad Lentil Collection. Means with the same letters in the same trait are not significantly different (P≤0.05).

فرود فتوشیمیایی (F′q/F´v) تنها تحت تاثیر دماهای یخ‌زدگی و دوره بازیابی قرار گرفت (جدول 3). در دماهای صفر و 18- درجه سانتی‌گراد و 12 ساعت بعد از اعمال تنش، میزان این شاخص نسبت به قبل از اعمال تنش افزایش یافت، اما سپس روندی کاهشی در این شاخص مشاهده شد. تنش دمایی 20- درجه سانتی‌گراد، سبب کاهش این شاخص در تمام دوره‌های بازیابی شد و مقدار آن در 72 ساعت بعد از اعمال تنش به حداقل مقدار خود رسید (جدول 4).

برهمکنش دماهای یخ‌زدگی و دوره بازیابی بر ضریب باز بودن مراکز واکنش فتوسیستمII (qL) معنی‌دار بود (جدول 3). کاهش دما سبب کاهش این شاخص در تمامی دوره‌های بازیابی شد. مقدار این ضریب در 72 ساعت پس از تنش یخ‌زدگی در دمای 20- درجه سانتی‌گراد، 5/6 درصد کمتر از قبل از اعمال تنش بود (جدول 4). کاهش دما سبب کاهش qL در گیاهچه‌های گوجه فرنگی شد. در واریته های وحشی Pe، Pi1، Pi2 و Pr1، بین شاهد و کاهش دما تفاوتی از لحاظ ضریب باز بودن مراکز واکنش فتوسیستم II مشاهده نشد (Zhou et al., 2018b). همچنین کاهش این مؤلفه در طی دوره بازیافت بعد از اعمال تنش مشاهده شد، به‌طوری‌که در روز سوم بازیابی، مقدار این مؤلفه بیشتر از دو برابر کمتر از مقدار آن در روز اعمال تنش بود (Dong et al., 2020).

جدول 9- ضرایب همبستگی بین صفات مورد بررسی ژنوتیپ‌های عدس در دمای 18- (قطر بالا) و 20- درجه سانتی‌گراد (قطر پایین)

Table 9. Correlation matrix of lentil genotypes properties at -18 ^oC (above diagonal) and total temperature (lower diamond).

^{ns، *} و ^**: به‌ترتیب غیر معنی‌دار و معنی‌دار در سطوح احتمال پنج و یک درصد.

^{ns, *}and ^**: non-significant and significant at  5%, and 1% of probability levels , respectively.

نتایج تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپ‌های مورد مطالعه عدس در دماهای مختلف نشان داد که در دمای صفر درجه سانتی‌گراد، ژنوتیپ‌ها در سه گروه (شکل 4 الف)، در دمای 18- درجه سانتی‌گراد در دو گروه (شکل 4 ب) و دمای 20- درجه سانتی‌گراد در سه گروه مجزا قرار گرفتند (شکل 4 ج). در دمای 18- درجه سانتی‌گراد، گروه دوم که شامل 15 ژنوتیپ بود، درصد بقا 7/11 درصد نسبت به میانگین کل بقای بیشتر بود (جدول 10). به‌طورکلی در دمای 18- درجه سانتی‌گراد، نتایج نشان‌دهنده برتری نسبی ژنوتیپ‌های گروه دوم در صفات مورد مطالعه به جز فرود فتوشیمیایی (F'q/F'v) و ضریب باز بودن مراکز واکنش فتوسیستم II (qL) بود (جدول 10).

نتایج حاصل از آزمون تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (PCA) و ترسیم بای‌پلات نشان داد که در دمای صفر درجه سانتی‌گراد، مؤلفه اول 26/49 درصد از تغییرات صفات شامل  F′_q/F′_m و F′_v/F′_m و مؤلفه دوم نیز صفات F^'₀، F′_q/F′_v، F^'_m، F^'_v و qL را با 46/30 درصد توضیح دادند (شکل 5 الف). در دمای 18- درجه سانتی‌گراد، مؤلفه اول 39/55 درصد از تغییرات صفات شامل qL و F′_q/F′_v و مؤلفه دوم نیز صفات F^'₀ را با 49/24 درصد توضیح دادند (شکل 5 ب). در دمای 20- درجه سانتی‌گراد، مؤلفه اول 20/54 درصد از تغییرات صفات شامل F′_v/F′_m، F^'_v و F′_q/F′_v و مؤلفه دوم نیز صفات F^'₀، F^'_m و F′_q/F′_v را با 34/30 درصد توضیح دادند (شکل 5 ج). در دمای صفر و دمای 20- درجه سانتی‌گراد، تمام ژنوتیپ‌ها به ترتیب 100 درصد بقا و بدون بقا بودند؛ به همین دلیل در PCA، جزو متغیرها قرار نگرفتند. بررسی آزمون تجزیه به مؤلفه‌های اصلی همراه با نتایج تجزیه خوشه‌ای نشان داد که دمای دماهای مورد بررسی، بیشتر ژنوتیپ‌های موجود در گروه‌ دوم در دمای 18- درجه سانتی‌گراد، در دو بُعد تجزیه به مؤلفه‌های اصلی قرار دارند که با توجه به این نتایج، احتمالاً بتوان عنوان کرد که این ژنوتیپ‌ها قادر به حفظ بقای خود در شرایط تنش یخ‌‌زدگی بودند و از توانایی بالاتری در حفظ بیشینه‌ کارایی پتانسیل فتوسیستم II در مواجه با تنش یخ‌زدگی برخوردار بودند که از این ویژگی‌ها می‌توان در به‌گزینی ژنوتیپ‌های متحمل به یخ‌زدگی عدس استفاده نمود.

شکل 4- گروه‌بندی خوشه‌ای ژنوتیپ‌های عدس بر اساس صفات مورد مطالعه در دماهای صفر (الف)، 18- (ب) و 20- درجه سانتی‌گراد (ج) تحت شرایط کنترل‌شده. MLC: کلکسیون بذر عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد.

Figure 4. Cluster grouping of lentil genotypes based on studied characteristics at 0°C (A), -18°C (b) and -20°C (C) under controlled conditions. MLC: Mashhad Lentil Collection

جدول 10- میانگین و انحراف از میانگین گروه‌های حاصل از تجزیه خوشه‌ای برای صفات مورد مطالعه در ژنوتیپ‌های عدس در دمای 18- درجه سانتی‌گراد تحت شرایط کنترل‌شده

Table 10. Mean and deviation from mean of groups in cluster analysis for traits in lentil genotypes at -18°C under controlled conditions

MLC: کلکسیون بذر عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد.           .MLC: Mashhad Lentil Collection

شکل 5- نمودار بای‌پلات بر مبنای دو مؤلفة اول و دوم با بیشترین توجیه واریانس داده‌ها در دماهای صفر درجه سانتی‌گراد (الف)، 18- درجه سانتی‌گراد (ب) و 20- درجه سانتی‌گراد (ج). MLC: کلکسیون بذر عدس پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد.

Figure 5. Biplot based on two major principal component factors at 0°C (A), -18°C (b) and -20°C (C). MLC: Mashhad Lentil Collection

نتیجه‌گیری کلی

تعیین بقای زمستانه، از جمله مهم‌ترین روش‌های انداز‌ه‌گیری تحمل به تنش یخ‌زدگی به شمار می‌آید، اما عواملی نظیر تفاوت در شدت سرمای زمستان در سال‌های مختلف، یکنواختی آن را کاهش می‌دهد و ایجاد خطا می‌کند. بنابراین به‌منظور رفع این مشکلات، استفاده از انواع مختلف آزمون‌های یخ‌زدگی در شرایط کنترل شده و مصنوعی در تکمیل آزمایش‌های مزرعه‌ای پیشنهاد شدند؛ استفاده از روش فلورسانس کلروفیل، یکی از روش‌های مناسب و غیرتخریبی در این زمینه می‌باشد. نتایج این آزمایش نشان داد که 17 ژنوتیپ (به جز سه ژنوتیپ MLC83، MLC103 و MLC409) از 20 ژنوتیپ عدس مورد بررسی، در دارای بقای بیش از 50 درصد دمای 18- درجه سانتی‌گراد بودند که احتمالاً در مناطقی که حداقل دمای آن‌ها به 18- درجه سانتی‌گراد می‌رسد، از پتانسیل‌ مناسبی به‌منظور کاشت پاییزه برخوردار هستند. بیشتر ژنوتیپ‌ها توانایی بازیابی مناسبی در جبران کاهش عوامل فلورسانس کلروفیل در نتیجه خسارت تنش یخ‌زدگی در دمای 18- درجه سانتی‌گراد داشتند، اما کمترین نوسان در تغییرات شاخص F′_v/F′_m پس از تنش یخ‌زدگی در دماهای 18- و 20- درجه سانتی‌گراد، در طول دوره بازیابی متعلق به ژنوتیپ MLC286 بود. نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی نیز نشان‌دهنده مناسب‌تر بودن ژنوتیپ‌های MLC286، MLC407 و MLC469 در مواجه با تنش یخ‌زدگی و بازیافت مناسب و توانایی آن‌ها در حفظ فعالیت‌های فتوسنتزی می‌باشد.

REFERENCES

1. Badeck, F. W. & Rizza, F. (2015). A combined field/laboratory method for assessment of frost tolerance with freezing tests and chlorophyll fluorescence. Agronomy, 5, 71-88.
2. Baker, N. R. (2008). Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology, 59, 89-113.
3. Brummer, Y., Kaviani, M. & Tosh, S. M. (2015). Structural and functional characteristics of dietary fiber in beans, lentils, peas and chickpeas. Food Research International, 67, 117–125.
4. Casado, A. B., Aparicio, T., Rodríguez, M. J., de la Vega, M. P. & Saldaña, C. C. (2016).Winter sowing of adapted lines as a potential yield increase strategy in lentil (Lens culinaris). Spanish Journal of Agricultural Research, 14(2), 1-8.
5. Choudhary, R., Verma, S. K., Panwar, R. K., Chourasiya, V. K. & Pandey, D. (2017). Morphological characterization of lentil (Lens culinaris ) Varieties based on six qualitative traits. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 6(5), 1611-1615.
6. Dai, A. (2011). Drought under global warming: a review. WIREs Climate Change, 2(1), 45–65.
7. Dong, Z., Men, Y., Liu, Z., Li, J. & Ji, J. (2020). Application of chlorophyll fluorescence imaging technique in analysis and detection of chilling injury of tomato seedlings. Computers and Electronics in Agriculture, 168, 105-109.
8. FAOSTAT, (2020). Food and Agriculture Organization of the United Nations. http://www.fao.org/faostat/en/#compare (Accessed: 23 December 2020).
9. Gautam, N. K, Singh, N., Iqueball, M. A., Singh, M., Akhtar, J. & Khan, Z. (2014). Genetic diversity analysis for quantitative traits in lentil (Lens culinaris ) germplasm. Legume Research, 37(2), 139-144.
10. Gholami Rezvani, N., Nezami, A., Kafi, M. & Nabati, J. (2019). Evaluation of lentil (Lens culinaris) genotypes for autumn sowing in cold temperate regions under field condition. Journal of Crop Production, 11(4), 142-147. (In Persian)
11. Goltsev, V. N., Kalaji, H. M., Paunov, M., Baba, W., Horaczek, T., Mojski, J., Kociel, H. & Allakhverdiev, S. I. (2016). Variable chlorophyll fluorescence and its use for assessing physiological condition of plant photosynthetic apparatus. Russian Journal of Plant Physiology, 63(6), 869–893.
12. Gorim, L. Y. & Vandenberg, A. (2017). Evaluation of wild lentil species as genetic resources to improve drought tolerance in cultivated lentil. Frontiers in Plant Science, 8, 1129.
13. Hojjat , S. S. & Galstyan, M. H. (2014). Study of economic-ecological results of cold resistance sort of the lentil world collection under Highlands of Islamic Republic of Iran. International Journal of Agriculture and Crop Sciences, 7(14), 1364-1370.
14. Hou, W., Sun, A. H., Chen, H. L., Yang, F. S., Pan, J. L. & Guan, M. Y. (2016). Effects of chilling and high temperatures on photosynthesis and chlorophyll fluorescence in leaves of watermelon seedlings. Biologia Plantarum, 60(1), 148-154.
15. Humplik, J. F., Lazar, D., Furst, T., Husickova, A., Hybl, M. & Spichal, L. (2015). Automated integrative high-throughput phenotyping of plant shoots: a case study of the cold-tolerance of pea (Pisum sativum). Plant Methods, 11(1), 1-11.
16. Jarpa-Parra, M. (2018). Lentil protein: a review of functional properties and food An overview of lentil protein functionality. International Journal of Food Science and Technology, 53, 892–903.
17. Jawad, M., Malik, R. M., Sawar, M. A., Asadullah, M., Hussain, I. & Khalid, R. (2019). Genetic analysis of lentil (Lens Culinaris) exotic germplasm to identify genotypes suitable for mechanical harvesting. Pakistan Journal of Agricultural Research, 32(10), 152-158.
18. Menezes-Silva, P. E., Sanglard, L. M. V. P., Avila, R. T., Morais, L. E., Martins, S. C. V., Nobres, P., Patreze, C. M., Ferreira, M. A., Araujo, W. L., Fernie, A. R. & DaMatta, F. M. (2017). Photosynthetic and metabolic acclimation to repeated drought events play key roles in drought tolerance in coffee. Journal of Experimental Botany, 68, 4309–4322.
19. Mishra, A., Heyer, A. G. & Mishra, K. B. (2014). Chlorophyll fluorescence emission can screen cold tolerance of cold acclimated Arabidopsis thaliana Plant Methods, 10(1), 1-10.
20. Mugabe, D., Coyne, C.J., Piaskowski, J., Zheng, P., Ma, Y., Landry, E., McGee, R., Main, D., Vandermark, G., Zhang, H. & Abbo, S. (2019). Quantitative trait loci for cold tolerance in chickpea. Crop Science, 59, 1–10.
21. Murchie, E. H. & Lawson, T. (2013). Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany, 64(13), 3983–3998.
22. Murray, G. A., Eser, D. L., Gusta, V. & Eteve, G. (1988). Winter hardiness in pea, lentil, faba bean and chickpea. in summer fieldJ., (ed.) World crops: cool season food legumes. Kluwer Academic Publishers, the Netherlands. 831-843.
23. Ortiz, D., Hu, J. & Salas Fernandez, M. G. (2017). Genetic architecture of photosynthesis in Sorghum bicolor under non-stress and cold stress conditions. Journal of Experimental Botany, 68(16), 4545–4557.
24. Rapacz, M., Sasal, M., Kalaji, H. M. & Koscielniak, J. (2015). Is the OJIP test a reliable indicator of winter hardiness and freezing tolerance of common wheat and triticale under variable winter environments? Plos One, 10(7), p.e0134820
25. Sasi, S., Venkatesh, J., Daneshi, R. F. & Gururani, M. A. (2018). Photosystem II extrinsic proteins and their putative role in abiotic stress tolerance in higher plants. Plants, 7(4), 100.
26. Shi, Y. L., Cai, Z. Y., Li, D., Lu, J. L., Ye, J. H., Liang, Y. R. & Zheng, X. Q. (2019). Effect of freezing on photosystemII and assessment of freezing tolerance of tea cultivar. Plants, 8(10), 434.
27. Strydhorst, S., Olson, M. A., Vasanthan, T., McPhee, K. E., McKenzie, R. H., Henriquez, B., Tieulie, J., Middleton, A., Dunn, R., Pfiffner, P., Coles, K., Bandara, M., Kruger, A., Bowness, R., Bing, D. J. & Beauchesne, D. (2015). Adaptability and Quality of Winter Pea and Lentil in Alberta. Agronomy Journal, 107(6), 2431-2448.
28. Swoczyna, T., Mojski, J., Baczewska-Dabrowska, A. H., Kalaji, H. M. & Elsheery, N. I. (2020). Can we predict winter survival in plants using chlorophyll a fluorescence? Photosynthetica, 58(2), 248-257.
29. Thalhammer, A., Hincha, D. K. & Zuther, E. (2014). Measuring freezing tolerance: electrolyte leakage and chlorophyll fluorescence assays. Plant cold acclimation: Methods in Molecular Biology, 1166, 15–24.
30. Wisniewski, M., Glenn, D. M. & Fuller, M. P. (2002). Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. Journal of the American Society for Horticultural Science, 127(3), 358-364.
31. Zhao, Y., Han, Q., Ding, Ch., Huang, Y., Liao, J., Chen, T., Feng, S., Zhou, L., Zhang, Z., Chen, Y., Yuan, S. & Yuan, M. (2020). Effect of low temperature on chlorophyll biosynthesis and chloroplast biogenesis of rice seedlings during greening. International Journal of Molecular Sciences, 21, 1390.
32. Zhou, R., Hyldgaard, B., Yu, X., Rosenqvist, E., Magana Ugarte, R., Wu, Z., Ottosen, C. O. & Zhao, T. (2018a). Phenotyping of faba beans (Vicia faba) under cold and heat stresses using chlorophyll fluorescence. Euphytica, 214(68), 1-13.
33. Zhou, R., Wu, Z., Wang, X., Rosenqvist, E., Wang, Y., Zhao, T. & Ottosen, C. O. (2018b). Evaluation of temperature stress tolerance in cultivated and wild tomatoes using photosynthesis and chlorophyll fluorescence. Horticulture, Environment, and Biotechnology, 59, 499–509.
34. Zhou, R., Yu, X., Ottosen, C. O., Rosenqvist, E., Zhao, L., Wang, Y., Yu, W. & Zhao, T. (2017). Drought stress had a predominant effect over heat stress on three tomato cultivars subjected to combined stress. BMC Plant Biology, 17 (1), 1-13.
35. Zushi, K., Kajiwara, S. & Matsuzoe, N. (2012). Chlorophyll a fluorescence OJIP transient as a tool to characterize and evaluate response to heat and chilling stress in tomato leaf and fruit. Scientia Horticulturae, 148, 39-46.

[1] -Survival