اثر قارچ مایکوریزا و کود فسفر بر عملکرد و مقدار کوماریک‌اسید میوه خیار تلخ تحت رژیم‌های مختلف آبیاری

. مقدمه

در اکوسیستم‌های خاکی، گیاهان اغلب در معرض تنش‌های محیطی قرار می‌گیرند. خشکی، یکی از تنش‌های غیر زیستی مهم است و زمانی رخ می‌دهد که پتانسیل آب و تورگر به­حدی کاهش می‌یابد که عملکرد متابولیک‌های طبیعی و ظرفیت تولید مثلی گیاه را مختل می‌کند (Ahmad et al., 2014). هنگامی­که گیاهان در معرض کمبود آب قرار می‌گیرند، تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی بسیار پیچیده‌ای را تجربه می‌کنند (Sofy et al., 2021; McDowell et al., 2022). با­این­حال، گیاهان مجموعه‌ای از مکانیسم‌ها را برای مقاومت در برابر اثرات نامطلوب تنش خشکی در سطوح سلولی، بافتی و کل گیاه ایجاد کرده‌اند که ممکن است تفاوت‌هایی را در مورفولوژی، سرعت رشد، پتانسیل نفوذ بافت، پاسخ آنتی‌اکسیدانی و تنظیم هورمونی داشته باشند (Duan et al., 2007). گیاهان علاوه­بر برخورداری از سیستم‌های داخلی که آن‌ها را از تنش‌های زیستی و غیر زیستی محافظت می‌کند، می‌توانند روابط مفیدی با برخی از میکروارگانیسم‌های موجود در ریزوسفر برقرار کنند (Jatav et al., 2021) و خسارت­های ناشی از تنش خشکی را کاهش دهند. در این میان، همزیستی قارچ‌های مایکوریزی آربوسکولار (AMF[1]) یک راه مؤثر برای کمک به گیاهان خشکی‌زی جهت زنده­ماندن در شرایط نامطلوب است. شبکه هیف‌های خارجی مایکوریزا می‌تواند به‌طور قابل توجهی جذب آب و مواد مغذی (Verbruggen et al., 2013)، بهبود فتوسنتز (Ruiz-Sanchez et al., 2010) و تنظیم فرآیندهای متابولیک (Herrera-Medina et al., 2007) را برای افزایش تحمل به خشکی گیاهان میزبان افزایش دهد. کارایی قارچ­های مایکوریزا به نوع خاک، میزان فسفر خاک (Ortas, 2012) و نوع گونه­های مایکوریزا (Kafkas & Ortas, 2009) بستگی دارد. فسفر مؤثرترین عنصر در توسعه و کارایی مایکوریزا است (Ortas, 2012). در پژوهشی روی خربزه (Cucumis melo L.)، مایکوریزا باعث بهبود پارامترهای فیزیولوژیکی و فتوسنتزی گیاهان تلقیح­شده در مقایسه با گیاهان تلقیح­نشده در شرایط کم‌آبی شد (Cakmakci et al., 2017). همچنین گزارش شده است که AMF به­طور قابل توجهی باعث افزایش ترکیبات فنولی و تقویت سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی در تحمل به تنش خشکی می­شود (Begum et al., 2019).

گیاهان خانواده کدوئیان به­دلیل رشد سریع به­ویژه در مرحله گیاهچه‌ای و داشتن برگ‌های بزرگ و سیستم ریشه‌ای سطحی به مقدار زیادی آب برای رشد و نمو نیاز دارند. بنابراین، تغییرات جزئی در محتوای رطوبت خاک اثرات سوء قابل ملاحظه‌ای بر رشد و عملکرد آنها دارد (An & Liang, 2013). خیار تلخ یا کارلا (Momordica charantia) گیاهی گرمسیری، تک­پایه، یکساله، علفی و از خانواده کدوئیان (Cucubitaceae) است که خاصیت دارویی فراوانی دارد (Mahmood et al., 2019). بخش دارویی این گیاه شامل میوه و برگ­ها بوده که حاوی بیش از 34 ترکیب دارویی، کربوهیدرات‌ها، انواع پروتئین‌ها، فیبرها، ویتامین‌ها (شامل ویتامین C، E، A، B9، B3، B2، B1) و مواد معدنی (پتاسیم، کلسیم، منیزیم، روی، فسفر و آهن) می‌باشد (Sur & Ray, 2020). کوماریک­اسید یک متابولیت ثانویه متعلق­به ترکیبات فنلی در گیاهان و قارچ‌ها است که اثرات فارماکولوژی قوی مانند خاصیت آنتی‌اکسیدانی، ضد میکروبی، ضد ویروسی، ضد التهابی، تعدیل­کننده سیستم ایمنی، ضد سرطان، ضد جهش‌زایی، ضد دیابت و ضد چربی خون دارد (Pei et al., 2016; Boo, 2019). کوماریک­اسید یک پیش‌ساز مهم برای اسیدهای فنولیک (Li et al., 2018)، فلاونوئیدها (Caverzan et al., 2012) و استیلبن‌ها (Raja et al., 2017) می‌باشد. کافئیک­اسید (Zou et al., 2018)، کلروژنیک­اسید
 (Ruelland et al., 2009)، رزمارینیک­اسید (Theocharis et al., 2012) و فن­اتیل­استر­کافئیک­اسید (Dhillon et al., 2017) از مشتقات کوماریک­اسید هستند که ارزش دارویی بالایی دارند.

با وجود اینکه مطالعات زیادی در زمینه استفاده از قارچ­های مایکوریزا و کودهای فسفر بر خصوصیات رشدی و کیفیت گیاهان زراعی و باغی صورت گرفته است، اما هیچ مطالعه­ای در زمینه توانایی قارچ­های مایکوریزا و کودهای فسفر بر بهبود رشد و ترکیبات فنولیک میوه گیاه خیار تلخ تحت تنش خشکی صورت نگرفته است. بنابراین با­توجه­به اهمیت موضوع و ضرورت بکارگیری راهکارهای زیستی برای تولید بهینه گیاهان دارویی و همچنین کاهش اثرات تنش کم‌آبی، آزمایشی با هدف بررسی اثر تلقیح دو گونه قارچ مایکوریزا و کود فسفر بر عملکرد و تغییرات کوماریک­اسید میوه خیار تلخ تحت تنش رژیم‌های مختلف آبیاری صورت گرفت.

2. مواد و روش‌ها

1-2. مشخصات محل آزمایش

به­منظور بررسی اثر دو گونه قارچ مایکوریزا و کود فسفر بر صفات فیزیولوژیک، عملکرد و مقدار کوماریک­اسید میوه خیار تلخ (Momordica charantia) تحت رژیم‌های مختلف آبیاری، آزمایشی در سال زراعی 1400-1399 در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس اجرا شد. ارتفاع محل آزمایش از سطح دریا 1215 متر با طول جغرافیایی 51 درجه و 8 دقیقه شرقی و عرض جغرافیایی 35 درجه و 43 دقیقه شمالی می­باشد. میانگین بارندگی و دمای سالانه در طولانی­مدت (30 سال) به­ترتیب 6/232 میلی‌متر و 22 درجه سانتی‌گراد بود. قبل از شروع آزمایش، به­منظور بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی خاک، در عمق 0-30 سانتی‌متری، از چند نقطه زمین به‌صورت زیگزاگی نمونه­برداری انجام شد و پس از ترکیب نمونه­ها با یکدیگر، نمونه مرکبی تهیه و به آزمایشگاه خاک‌شناسی جهت ارزیابی خصوصیات منتقل شد. نتایج آزمون خاک در جدول 1 ارائه شده است. بافت خاک محل آزمایش لومی­شنی بود.

2-2. طرح آزمایشی

این تحقیق به‌صورت اسپلیت­فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. عوامل آزمایش شامل سه رژیم آبیاری: آبیاری کامل (I1) (قطع آبیاری تا تخلیه 20 درصد آب قابل استفاده موجود در منطقه ریشه و سپس آبیاری تا حد ظرفیت زراعی)، کم­آبیاری متوسط (I2) (قطع آبیاری تا تخلیه ۵0 درصد آب قابل استفاده موجود در منطقه ریشه و سپس آبیاری تا حد ظرفیت زراعی) و کم­آبیاری شدید (I3) (قطع آبیاری تا تخلیه ۸0 درصد آب قابل استفاده موجود در منطقه ریشه و سپس آبیاری تا حد ظرفیت زراعی) در کرت‌های اصلی و ترکیب فاکتوریل دو گونه قارچ Glomus mosseae (M1) و Glomus intraradices (M2) همراه­با شاهد بدون قارچ (M0) و کاربرد کود فسفر (P1) به­همراه شاهد بدون فسفر (P0) در کرت‌های فرعی به­صورت تصادفی قرار گرفت. مقدار کود فسفر بر اساس تجزیه خاک و همچنین نیاز خیار تلخ به کود فسفر در طی رشد، تعیین شد.

3-2. اعمال تیمارها

به­منظور تولید نشاء برای کشت در زمین اصلی، ابتدا بذرهای خیار تلخ تهیه­شده از پاکان بذر اصفهان با منشاء پاکستانی به­مدت 24 ساعت در آب مقطر خیسانده شد. سپس در سینی­های نشاء 45 تایی حاوی ترکیب کوکوپیت و پرلیت قرار گرفته و به‌صورت روزانه آبیاری شدند. بعد از گذشت 10 تا 15 روز از کاشت و در مرحله سه تا چهار برگی، نشاها به زمین اصلی منتقل شدند. قبل از انتقال به زمین اصلی و در طی مدت رشد نشاء پس از سبز­شدن اولین برگ از کود NPK با نسبت 20:20:20 برای تقویت نشاها همراه­با آب آبیاری استفاده شد. قطعه زمین مورد نظر در پاییز سال قبل توسط گاو آهن برگردان­دار شخم و برای نرم­کردن کلوخه­ها دوبار دیسک زده شد و سپس تسطیح شد. در بهار سال بعد، قبل از کشت، زمین با فاصله یک متر فاروبندی شد. وقتی حداقل دما به بالاتر از 15 درجه سانتی‌گراد رسید (20 اردیبهشت) نشاها به زمین اصلی منتقل شدند.

کرت­های آزمایشی دارای ابعادی معادل 12 متر مربع (سه در چهار متر) با چهار خط کشت با فاصله یک متر و فاصله روی ردیف 60 سانتی‌متر بودند. برای خاک­های سبک با درصد رس کم مقدار کود مورد نیاز برای خیار تلخ 184 کیلوگرم نیتروژن خالص، 112 کیلوگرم فسفر خالص و 124 کیلوگرم پتاسیم خالص در هکتار توصیه می­شود. با­توجه­به آزمایش‌های تجزیه خاک و نیاز خیار تلخ به کود نیتروژنی مقدار 318 کیلوگرم در هکتار کود اوره مصرف شد؛ به­این­صورت که نیمی از کود اوره مورد نیاز در گودال­های کاشت به­صورت زیر نشایی به زمین اضافه شد و نیمی دیگر در زمان گلدهی به خاک اضافه شد.

براساس نتایج آزمون خاک و نیاز خیار تلخ به کود فسفر مقدار 162 کیلوگرم در هکتار کود سوپرفسفات تریپل (52/74 کیلوگرم در هکتار فسفر خالص) براساس تیمارهای مورد نظر به خاک اضافه شد. تمامی کود فسفر قبل از کشت همراه­با کود نیتروژن به چاله‌های کشت اضافه و مقدار کمی خاک روی کودها ریخته شد. مقدار کود فسفر طبق تیمارهای کودی 72/9 گرم برای هر بوته در نظر گرفته شد. با­توجه­به غنی­بودن خاک از پتاس هیچ­گونه کود پتاسی به خاک اضافه نشد.

جهت تلقیح با قارچ، ریشه نشاها در خاک حاوی اسپور قارچ مایکوریزایی (هر گرم خاک مایکوریزایی حاوی 50 عدد اسپور زنده) آغشته شده و در داخل هر چاله بر اساس تیمار مورد نظر کشت شد. پس از کاشت گیاه تا قبل از استقرار گیاه، آبیاری روزانه و به­صورت قطره­ای (توسط تیپ­های با فواصل منفذ 20 سانتی‌متر و قطر داخلی 5/16 میلی­متر) و بر اساس نیاز گیاه انجام شد و پس از آن آبیاری به­وسیله اعداد قرائت­شده از TDR طبق تیمارهای آبیاری تا آخر فصل رشد انجام گرفت. کنترل علف‌های هرز بدون استفاده از علف‌کش­ها و به‌صورت وجین دستی در طی فصل رشد انجام شد.

در آزمایشگاه میزان رطوبت وزنی و درصد رطوبت حجمی اندازه‌گیری و درصد آب قابل استفاده (D) بر اساس معادله (1) تعیین (Martin et al., 1990) و سپس با استفاده از معادله (2) درصد تخلیه آب قابل استفاده محاسبه شد.

n: تعداد نمونه خاک گرفته­شده از عمق مؤثر توسعه ریشه، FCi: رطوبت خاک در ظرفیت مزرعه (پتانسیل رطوبتی معادل 16 درصد وزنی و 56/22 درصد حجمی قرائت­شده توسط دستگاه TDR) در نمونه i ام، θi: رطوبت خاک در نمونه i ام و Wp: رطوبت خاک در نقطه پژمردگی دائم (پتانسیل رطوبتی معادل 78/6 درصد وزنی و 56/9 درصد حجمی قرائت­شده توسط دستگاه TDR) می­باشد. از مقایسه رطوبت­هاى اندازه­گیرى­شده به­وسیله حسگرها با روش نمونه­بردارى و توزین، اعتبارسنجى صورت گرفت
 (Vanclooster et al., 1994). حجم آب مصرفی در این تحقیق در طول فصل رشد خیار تلخ در شرایط آبیاری کامل با تعداد 39 دفعه آبیاری 13104 لیتر، در شرایط کم­آبیاری متوسط با 26 دفعه آبیاری 12480 لیتر و در شرایط کم­آبیاری شدید با 13 دفعه آبیاری 7488 لیتر بود.

4-2. اندازه­گیری صفات مورد بررسی

1-4-2. کلروفیل کل

کلروفیل کل بر اساس روشArnon  (1967) و اصلاح­شدهLichthentaler  (1987) با استفاده از عصاره استونی برگ تازه (2/0 گرم برگ تازه فریزشده با 15 میلی‌لیتر استون 80 درصد ساییده و سانتریفوژ شد) در طول موج‌های 8/646 و 2/663 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر (Varian Cary Win UV 6000i, Australia) قرائت شده و طبق معادله‌ (3) محاسبه شد.

2-4-2. نشت یونی برگ

به‌منظور تعیین نشت یونی برگ، 3/0 گرم از بافت تازه برگ در دو مرحله با آب دوبار تقطیرشده شستشو ‌شد. بعد از خرد­کردن، نمونه‌ها در فالکون حاوی 20 میلی­لیتر آب مقطر قرار داده شدند. نمونه‌ها به­مدت 24 ساعت روی شیکر گذاشته و پس از آن توسط دستگاه EC متر نشت یونی محلول (L₁) اندازه‌گیری ‌شد. در مرحله‌ی بعد به نمونه‌ها 20 میلی­لیتر آب مقطر اضافه و به­مدت 20 دقیقه در دمای 120 درجه سانتی­گراد اتوکلاو شدند. در نهایت نشت یونی محلول (L₂) بعد از به­تعادل­رسیدن با دمای محیط اندازه‌گیری و میزان نشت یونی از معادله (4) محاسبه شد (Lutts et al., 1996).

3-4-2. مالون­دی‌آلدهید و پرولین

جهت تعیین مقدار مالون­دی‌آلدهید برگ از روش Heath & Packer (1968) و برای اندازه‌گیری پرولین از روش
Bates et al.  (1973) استفاده شد.

4-4-2. آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

2/0 گرم از بافت گیاهی تازه منجمد­شده در نیتروژن مایع در بافر پتاسیم فسفات 05/0 مولار، 7=pH در دمای 4-0 درجه سانتی‌گراد سائیده و عصاره­گیری شد و سپس همگن حاصل در 12000 دور در دقیقه در دمای 4-2 درجۀ سانتی­گراد به­مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول روئی برای سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مورد استفاده قرار گرفت.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز به­روش Cakmak & Horst (1991) انجام شد. بر این اساس از عصاره آماده­شده در مرحله قبل برای سنجش فعالیت کاتالاز استفاده شد. محلول واکنش شامل عصارۀ آنزیمی، بافر و پراکسید هیدروژن با غلظت نهایی 10 میلی­مولار بود. تجزیه آب اکسیژنه با کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر پیگیری و به­ازای هر میلی­گرم پروتئین در عصارۀ آنزیمی بیان شد. جهت تعیین فعالیت آسکوربات­پراکسیداز، کمپلکس واکنشی (یک میلی­لیتر) شامل 250 میکرولیتر از محلول بافر فسفات 100 میلی­مولار (7 =pH)، 250 میکرولیتر از آسکوربات یک میلی­مولار، 250 میکرولیتر از EDTA 4/0 میلی‌‌مولار، 190 میکرولیتر آب دو بار تقطیرشده، 10 میکرولیتر از پراکسید هیدروژن 10 میلی­مولار و 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج­شده بود. جذب واکنش آنزیمی در طول موج 290 نانومتر در زمان شروع و پس از یک دقیقه از شروع واکنش قرائت شد. واحد فعالیت آنزیم بر حسب میکرومول آسکوربات اکسیدشده بر دقیقه محاسبه شد (Yoshimura et al., 2000).

5-4-2. فسفر

جهت اندازه‌گیری فسفر، نمونه‌های برگی برداشت­شده تحت دمای 70 درجه سانتی‌گراد طی 72 ساعت خشک شد و با استفاده از یک آسیاب ویبراتوری پودر و از غربال یک میلی‌متری عبور داده شد. سپس از هر نمونه دو گرم توزین و با 10 میلی‌لیتر اسیدهیدروکلریدریک یک نرمال در دمای اتاق به­مدت 24 ساعت نگهداری و آماده‌سازی شد. برای اندازه­گیری غلظت فسفر از یون‌های ارتوفسفات در محیط اسیدی با محلول وانادات­مولیبدات که کمپلکس زرد رنگ فسفوواناداو­مولیبدات را تشکیل می‌دهد استفاده ‌شد، حداکثر جذب در طول موج 430 نانومتر قرائت شد (Chapman & Pratt, 1962).

6-4-2. کلونیزاسیون ریشه

برای تعیین درصد همزیستی قارچ‌ها با ریشه گیاه خیار تلخ، ابتدا از ریشه بوته­های موجود از هر کرت در زمان رسیدگی کامل نمونه‌برداری و با استفاده از روش Phillips & Hayman (1970) ریشه­ها رنگ­آمیزی شدند. برای تعیین درصد کلونیزاسیون ریشه از روش تلاقی خطوط مشبک استفاده شد.

7-4-2. عملکرد میوه

به‌منظور تعیین عملکرد نهایی، در طول آزمایش تعداد میوه شمارش و وزن میوه هر بار پس از برداشت توسط ترازوی دیجیتالی مدل A&D ساخت کشور ژاپن با دقت 01/0 گرم توزین و ثبت شد. در نهایت وزن هر مرحله با هم جمع و به­عنوان وزن نهایی میوه در بوته ثبت و سپس نسبت­به هکتار محاسبه شد.

8-4-2. کوماریک­اسید میوه

برای اندازه­گیری ترکیبات فنلی میوه از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) استفاده شد. برای این منظور 20 میکرولیتر از عصاره تهیه­شده از میوه خشک به HPLC مدل KNAUER-Germany تزریق شد (Aleksandra et al., 2011).

9-4-2. محاسبات آماری

از نرم­افزار SAS 9.2 برای تجزیه و تحلیل داده­ها استفاده شد. قبل از تجزیه و تحلیل داده­ها، تست نرمال­بودن ‌‌‏‌داده­ها انجام و پس از اطمینان از حالت توزیع نرمال، نسبت­به تجزیه و تحلیل ‌‌‏‌آن‌ها اقدام شد. مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون دانکن (5%) انجام شد. برای رسم نمودار­ها از نرم­افزار Microsoft Office 2013 استفاده شد.

3. نتایج و بحث

1-3. کلروفیل کل

با­توجه­به نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها، مقدار کلروفیل کل برگ به‌طور معنی‌داری تحت اثرات اصلی رژیم آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه آبیاری در مایکوریزا (p<0.01) و کود فسفر در مایکوریزا (p<0.05) قرار گرفت؛ اما تغییر معنی‌داری نسبت­به دیگر اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه نداشت (جدول 2).

طبق نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل دوگانه رژیم آبیاری در قارچ مایکوریزا، در هر دو شرایط تلقیح و عدم تلقیح قارچ مایکوریزا با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید مقدار کلروفیل کل روندی کاهشی داشت و این کاهش تحت عدم تلقیح و تلقیح توسط گونه Glomus intraradices در کم‌آبیاری شدید نسبت­به آبیاری کامل معنی‌دار بود. با تلقیح توسط گونه
 Glomus mosseae نیز با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری متوسط مقدار کلروفیل کل نسبت­به آبیاری کامل کاهش معنی‌داری داشت؛ اما با کاهش بیشتر آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید کاهش جزیی غیر معنی‌داری نسبت­به آبیاری کامل نشان داد. نتایج همچنین نشان داد در هر سطح آبیاری تحت تلقیح هر دو گونه قارچ کاربردی مقدار کلروفیل کل نسبت­به عدم تلقیح افزایش معنی‌داری داشت و در شرایط کم­آبیاری متوسط گونه Glomus intraradices و تحت شرایط کم­آبیاری شدید گونه
 Glomus mosseae بیشترین تأثیر را بر کلروفیل کل داشت (شکل A1). اختلاف معنی‌دار دو گونه در هر دو شرایط کم­آبیاری متوسط و شدید می‌تواند به­دلیل اختلاف در همزیستی گونه‌ها در هر دو شرایط آبیاری با گیاه میزبان بوده باشد که باعث اختلاف در جذب آب و عناصر غذایی و در نتیجه مقدار کلروفیل برگ شده است.

براساس نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل دوگانه کود فسفر در قارچ مایکوریزا، در شرایط عدم تلقیح و تلقیح توسط دوگونه قارچ مایکوریزا، با کاربرد کود فسفر مقدار کلروفیل کل افزایش یافت و این افزایش فقط تحت گونه Glomus intraradices غیر معنی‌دار بود. در هر دو سطح کود فسفر نیز هر دو گونه قارچ مایکوریزا اثر افزایشی معنی‌داری نسبت­به عدم تلقیح بر کلروفیل کل داشتند. بیشترین مقدار کلروفیل کل نیز به بوته‌های تحت تلقیح با گونه Glomus mosseae در شرایط مصرف کود فسفر اختصاص داشت (شکل B1).

شکل 1. مقایسه میانگین تغییرات کلروفیل کل برگ خیار تلخ تحت اثرات متقابل رژیم‌ آبیاری×قارچ مایکوریزا (A) و کود فسفر×قارچ مایکوریزا (B). P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

تنش خشکی با القای تولید ROS[2] باعث آسیب اکسیداتیو و تخریب غشای سلولی می­شود که کاهش مقدار کلروفیل برگ را به دنبال دارد. طبق یافته­هایMaluleke  (2022) مقدار کلروفیل خیار تحت کم­آبیاری شدید کاهش قابل توجهی نسبت­به کم­آبیاری متوسط و آبیاری مطلوب نشان داد که با نتایج حاصل از این بررسی مبنی بر کاهش مقدار کلروفیل تحت تنش کم­آبیاری مطابقت دارد. نتایج بررسی حاضر نشان داد در هر سطح آبیاری، تلقیح توسط قارچ­های مایکوریزا اثر افزایشی معنی­داری بر مقدار کلروفیل برگ داشت (شکل A1). به­نظر می­رسد قارچ­های AMF با افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و در نتیجه کاهش ROS از تخریب غشای سلول و تجزیه کلروفیل جلوگیری کرده (Begum et al., 2019) و از طرف دیگر با تنظیم فعالیت آنزیم کلروپلاست باعث سنتز کلروفیل در برگ می­شوند. در بررسی‌هایی روی کدوی پوست­کاغذی مقدار کلروفیل کل برگ با کاهش آبیاری کاهش و تحت تلقیح توسط قارچ‌های مایکوریزا در هر سطح آبیاری افزایش داشت؛ اما این افزایش در شرایط کم­آبیاری متوسط و شدید نسبت­به عدم تلقیح معنی‌دار بود (Nazari Nasi et al., 2018).

2-3. مالون­دی­آلدهید

نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که محتوای مالون­دی­آلدهید برگ به‎طور معنی‏داری (p<0.01) تحت اثرات اصلی رژیم آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه این عوامل قرار گرفت (جدول 2). نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل سه­گانه عوامل مورد بررسی نشان داد با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری متوسط و شدید مقدار مالون­دی­آلدهید برگ روند افزایشی معنی­داری نسبت­به آبیاری کامل داشت. نتایج همچنین نشان داد در هر سطح آبیاری و در هر تیمار از کود فسفر تلقیح دو گونه قارچ مایکوریزا اثری کاهشی بر مقدار مالون­دی­آلدهید برگ داشت. طبق نتایج به­دست­آمده در شرایط کم­آبیاری متوسط تحت کاربرد کود فسفر با تلقیح دوگونه قارچ مایکوریزا مقدار مالون­دی­آلدهید کاهش معنی­داری نسبت­به عدم کاربرد مایکوریزا نشان داد؛ اما این کاهش در شرایط آبیاری کامل معنی­دار نبود. در شرایط کم­آبیاری شدید نیز با کاربرد کود فسفر مقدار مالون­دی­آلدهید کاهش داشت و این کاهش فقط تحت تلقیح با گونه Glomus mosseae قابل توجه و معنی­دار بود. بیشترین مقدار مالون­دی­آلدهید به بوته­های تلقیح­نشده و عدم کاربرد کود فسفر در شرایط کم­آبیاری شدید اختصاص داشت (شکل 2).

شکل 2. مقایسه میانگین تغییرات مالون­دی‌آلدهید برگ خیار تلخ تحت اثر متقابل رژیم آبیاری×کود فسفر×قارچ مایکوریزا. P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

مالون­دی­آلدهید (MDA) شاخصی مهم برای آسیب به غشاء است. نتایج بررسی ما نشان داد که با کاهش آبیاری به­دلیل تخریب غشای سلولی مقدار مالون­دی­آلدهید برگ خیار تلخ افزایش داشت؛ ولی در هر سطح آبیاری تلقیح توسط قارچ مایکوریزا و مصرف کود فسفر باعث کاهش مالون­دی­آلدهید برگ شد (شکل 2). به­نظر می­رسد قارچ­های مایکوریزا آربسکولار از طریق افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی کاتالاز (شکل 5) و آسکوربات­پراکسیداز (شکل 6) باعث کاهش تولید ROS و تخریب غشاء و کاهش مقدار MDA برگ شده­اند. طبق یافته­های Ahmad et al. (2018) در خیار، تحت تلقیح با قارچ مایکوریزا گونه
 Glomus versiforme فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی CAT و POD افزایش و مقدار MDA نسبت­به عدم تلقیح کاهش داشت. در مطالعات دیگری محققان نشان دادند که تلقیح با قارچ‌های مایکوریزا آربسکولار باعث کاهش معنی‌دار محتوای MDA در گیاهان تحت تنش خشکی متوسط و شدید شد (Chandrasekaran, 2022).

3-3. نشت یونی برگ

طبق نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها، نشت یونی برگ به­طور معنی­داری تحت اثرات اصلی رژیم آبیاری (p<0.05)، کود فسفر، قارچ مایکوریزا (p<0.01) و اثرات متقابل دوگانه آبیاری (بجز رژیم آبیاری در کود فسفر) و سه‌گانه (p<0.05) قرار گرفت (جدول 2). براساس نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل سه‌گانه فاکتورهای آزمایشی، کمترین نشت یونی برگ (05/50 درصد) به بوته‌های تحت تلقیح توسط گونه Glomus mosseae در شرایط آبیاری کامل و مصرف کود فسفر اختصاص داشت. نتایج نشان داد در شرایط عدم کاربرد و کاربرد کود فسفر، با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید نشت یونی برگ تحت عدم تلقیح و تلقیح توسط گونه Glomus mosseae افزایش معنی‌دار و تحت گونه Glomus intraradices افزایش غیر معنی‌داری نسبت­به آبیاری کامل داشت. نتایج نشان داد در شرایط کم­آبیاری متوسط و شدید گونه Glomus intraradices بیشترین تأثیر را بر پایداری غشای سلول تحت مصرف و عدم مصرف کود فسفر داشت؛ به‌طوری‌که باعث کاهش معنی‌دار نشت یونی برگ نسبت­به عدم تلقیح شد. تحت شرایط آبیاری کامل در شرایط مصرف کود فسفر فقط گونه Glomus mosseae باعث کاهش معنی‌داری نشت یونی برگ نسبت­به عدم تلقیح شد (شکل 3).

شکل 3. مقایسه میانگین تغییرات نشت یونی برگ خیار تلخ تحت اثر متقابل رژیم آبیاری × کود فسفر × قارچ مایکوریزا. P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

اندازه‌گیری نشت الکترولیت سلول‌های گیاهی روشی مناسب برای ارزیابی پایداری غشاء در اثر تنش‌های محیطی مانند تنش کم­آبی است؛ زیرا تنش خشکی پایداری غشاء سلول را کاهش داده و نشت یون‌ها را به خارج از سلول افزایش می‌دهد
 (El Basyoni et al., 2017). محققان در یک بررسی‌ نشان دادند که قارچ مایکوریزا با افزایش مقدار آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیر آنزیمی و افزایش جذب عناصری همچون فسفر و کلسیم باعث استحکام دیواره سلولی و کاهش نشت یونی در شرایط تنش می‌شود (Goss et al., 2017). این نتایج تأییدکننده پژوهش حاضر است. در یک بررسی محققان نشان دادند که تحت تلقیح توسط قارچ‌های مایکوریزا آربسکولار، نشت یونی برگ کاهش قابل توجهی نسبت­به عدم تلقیح داشت (Chandrasekaran, 2022). در بررسی دیگری بر سویا گیاهان تلقیح­شده با مایکوریزا آربسکولار کاهش تجمع گونه‌های فعال اکسیژن و کاهش نشت یونی را تحت تنش خشکی نشان دادند (Begum et al., 2023).

4-3. پرولین

نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که محتوای پرولین برگ به‌طور معنی‌داری تحت اثرات اصلی رژیم آبیاری، کود فسفر و قارچ مایکوریزا قرار گرفت؛ اما تغییر معنی‌داری نسبت­به اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه این عوامل نداشت (جدول 2). طبق نتایج مقایسه میانگین اثرات اصلی با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری متوسط و شدید مقدار پرولین برگ نسبت­به آبیاری کامل به­ترتیب افزایش 39/7 و 14/16 درصدی و معنی‌داری داشت (شکل A4). با کاربرد کود فسفر نیز مقدار پرولین برگ افزایش 50/4 درصدی و معنی‌داری نسبت به عدم کاربرد داشت (شکل B4). نتایج نشان داد تحت تلقیح توسط هر دو گونه Glomus mosseae و
 Glomus intraradices مقدار پرولین برگ نسبت­به عدم تلقیح افزایش معنی‌داری داشت؛ اما بین دو گونه تفاوت معنی‌داری بر این صفت مشاهده نشد (شکل C4).

شکل 4. مقایسه میانگین تغییرات پرولین برگ خیار تلخ تحت رژیم‌های مختلف آبیاری (A)، کود فسفر (B) و تلقیح با قارچ مایکوریزا (C). P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

تنظیم اسمزی یکی از سازوکارهای مهم در پاسخ به تنش­های محیطی است که نوعی سازگاری به تنش کمبود آب می­باشد و از طریق تجمع مواد محلول درون سلول­ها، می­تواند به حفظ تورژسانس سلول­ها و فرآیندهای وابسته به آن در پتانسیل‌های پایین آب منجر شود. پرولین یک محافظ اسمزی حیاتی می­باشد که مسئول تنظیم اسمزی، خاموش­کردن ROS و حفظ تعادل ردوکس تحت تنش‌های غیر زیستی است (Hidangmayum & Dwivedi, 2018). براساس نتایج بررسی حاضر مقدار و پرولین برگ تحت تنش خشکی، تلقیح توسط دو گونه قارچ مایکوریزا و مصرف کود فسفر افزایش داشت. در بررسی­های Begum et al. (2019) قارچ­های AMF باعث افزایش مقدار پرولین در شرایط تنش خشکی شدند که با نتایج این بررسی مطابقت دارد. طبق یافته‌های
Razavi et al.  (2022) مقدار پرولین برگ سه ژنوتیپ رازیانه (Foeniculum vulgare) تحت تنش خشکی افزایش 36 درصدی نشان داد. در بررسی دیگری تلقیح توسط AMF سنتز قندها و پرولین را افزایش داد و باعث بهبود تحمل به تنش خشکی در گیاهان شد (Mona et al., 2017).

5-3. آنزیم­های آنتی­اکسیدانی

کاتالاز و آسکوربات­پراکسیداز از جمله آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مورد بررسی بودند. طبق نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها آنزیم کاتالاز به‌طور معنی‌داری (p<0.01) تحت اثرات اصلی آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه آبیاری در مایکوریزا و کود فسفر در مایکوریزا قرار گرفت؛ اما تغییر معنی‌داری نسبت­به دیگر اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه نشان نداد (جدول 2). آنزیم آسکوربات­پراکسیداز نیز از واکنش معنی‌داری (p<0.01) نسبت­به اثرات اصلی آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه (بجز آبیاری در مایکوریزا) و سه‌گانه برخوردار بود (جدول 2).

براساس نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل دوگانه رژیم آبیاری در قارچ مایکوریزا، بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز به بوته‌های تحت تلقیح با گونه Glomus intraradices در شرایط کم­آبیاری شدید اختصاص داشت. در هر تیمار از قارچ مایکوریزا با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش معنی‌داری نسبت­به آبیاری کامل داشت. نتایج نشان داد تحت شرایط کم­آبیاری متوسط گونه Glomus mosseae و تحت شرایط کم­آبیاری شدید گونه Glomus intraradices اثر افزایشی معنی‌داری نسبت­به عدم تلقیح بر فعالیت این آنزیم داشت. با آبیاری کامل بوته‌های خیار تلخ هر دو گونه قارچ مایکوریزا اثر افزایشی معنی‌داری نسبت­به عدم تلقیح بر آنزیم کاتالاز داشتند (شکل A5). طبق نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل کود فسفر در قارچ مایکوریزا، فعالیت آنزیم کاتالاز تحت هر دو گونه Glomus mosseae و Glomus intraradices با کاربرد کود فسفر افزایش معنی‌داری نسبت­به عدم مصرف فسفر داشت و در شرایط کاربرد کود فسفر تلقیح هر دوگونه قارچ مایکوریزا اثر افزایشی معنی‌داری نسبت­به عدم تلقیح بر فعالیت آنزیم کاتالاز داشت (شکل B5).

شکل 5. مقایسه میانگین تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز برگ خیار تلخ تحت اثرات متقابل رژیم‌ آبیاری در قارچ مایکوریزا (A) و کود فسفر در قارچ مایکوریزا (B). P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

براساس نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل سه‌گانه بین تیمارها، بیشترین فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز به بوته­های تحت تلقیح با گونه Glomus mosseae و مصرف کود فسفر در شرایط کم­آبیاری شدید اختصاص داشت. نتایج نشان داد در شرایط آبیاری کامل و کم­آبیاری شدید تحت عدم کاربرد کود فسفر با تلقیح بوته­ها توسط دو گونه قارچ مایکوریزا فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز نسبت­به عدم تلقیح کاهش معنی­دار و تحت کاربرد کود فسفر افزایش معنی­داری داشت. تحت شرایط کم­آبیاری متوسط نیز در شرایط مصرف کود فسفر فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز با تلقیح دو گونه قارچ مایکوریزا افزایش معنی‌داری نشان داد. نتایج همچنین نشان داد در هر سطح آبیاری و تلقیح توسط دوگونه قارچ مایکوریزا با کاربرد کود فسفر فعالیت این نوع آنزیم از افزایش معنی‌داری نسبت­به عدم کاربرد کود فسفر برخوردار بود (شکل 6).

شکل 6. مقایسه میانگین تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز برگ خیار تلخ تحت اثر متقابل رژیم آبیاری×کود فسفر×قارچ مایکوریزا. P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

طبق نتایج بررسی حاضر با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی کاتالاز و آسکوربات­پراکسیداز افزایش یافت و در هر سطح آبیاری، تلقیح دوگونه قارچ مایکوریزا و مصرف کود فسفر اثر افزایشی بر مقدار دو آنزیم مذکور داشتند. نتایج یافته‌های دیگر محققان نیز نشان داد فعالیت آنزیم­های کاتالاز و آسکوربات­پراکسیداز سورگوم تحت تلقیح با قارچ­های مایکوریزا در شرایط تنش و عدم تنش افزایش داشت و فعالیت این آنزیم در شرایط تنش متوسط و شدید نسبت­به آبیاری مطلوب افزایش یافت (Kamali & Mehranan, 2020). در بررسی دیگری بیشترین فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و آسکوربات­پراکسیداز (APX) تحت تلقیح قارچ میکوریزا در 50 درصد ظرفیت زراعی به­دست آمد (Najafi et al., 2021). به­نظر می‌رسد قارچ‌های مایکوریزا با بهبود دسترسی به عناصر غذایی همچون نیتروژن، فسفر و پتاسیم نقش مهمی در تولید بیومولکول‌هایی همچون پروتئین‌های مختلف دارند که منجر به تولید و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و در نهایت کاهش اثرات منفی رادیکال‌های فعال اکسیژن در شرایط تنش خشکی می‌شود (Hashem et al., 2016).

6-3. فسفر برگ

نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که مقدار فسفر برگ به­طور معنی­داری تحت اثرات اصلی آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه کود فسفر در قارچ مایکوریزا (p<0.01) و آبیاری در قارچ مایکوریزا (p<0.05) قرار گرفت؛ اما تغییر معنی‌داری نسبت­به دیگر اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه نداشت (جدول 2). طبق نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل آبیاری در قارچ مایکوریزا، در هر دو گونه قارچ مایکوریزا و تیمار شاهد با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید مقدار فسفر برگ روند کاهشی معنی‌داری نسبت­به آبیاری کامل داشت؛ اما در هر سطح آبیاری مقدار فسفر برگ تحت تلقیح توسط دو گونه قارچ مایکوریزا افزایش معنی‌داری نسبت­به عدم تلقیح نشان داد (شکل A7). طبق نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل کود فسفر در قارچ مایکوریزا، مقدار فسفر برگ تحت تلقیح و عدم تلقیح قارچ مایکوریزا با کاربرد کود فسفر افزایش داشت و این افزایش در شرایط عدم تلقیح غیر معنی‌دار بود (شکل B7). این نشان می‌دهد که همزیستی هر دو گونه قارچ مایکوریزا باعث بهبود جذب فسفر از خاک شده است.

خشکسالی دسترسی گیاه را برای جذب مواد مغذی همچون فسفر، از خاک محدود می‌کند (Suriyagoda et al., 2014). پژوهشگران بر این باورند که افزایش جذب فسفر تحت تلقیح قارچ مایکوریزا، کمک قابل توجهی به اکوسیستم و همچنین افزایش تحمل گیاهان در برابر خشکسالی می‌کند (Hijikata et al., 2004). در یک بررسی محققان نشان دادند تحت تلقیح توسط قارچ‌های مایکوریزا مقدار فسفر برگ افزایش یافت؛ به‌طوری‌که باعث بهبود رشد و افزایش تحمل گیاه به خشکی شد (Tariq et al., 2018). جذب یون‌های فسفات غیر قابل حل و انتقالی در خاک به سمت گیاه (Fitter et al., 2011)، افزایش سطح جذب فسفر و تولید و ترشح آنزیم‌های فسفاتاز می‌تواند از دلایل افزایش جذب فسفر تحت تلقیح با قارچ‌های مایکوریزایی بوده باشد
 (Marschner, 2012).

شکل 7. مقایسه میانگین تغییرات فسفر برگ خیار تلخ تحت اثرات متقابل رژیم‌ آبیاری در قارچ مایکوریزا (A) و کود فسفر در قارچ مایکوریزا (B). P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

7-3. کلونیزاسیون ریشه

نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که درصد کلونیزاسیون ریشه به­طور معنی­داری تحت اثرات اصلی آبیاری، قارچ مایکوریزا (p<0.01) و اثر متقابل دوگانه آبیاری در قارچ مایکوریزا قرار گرفت؛ اما تغییر معنی‌داری نسبت­به کود فسفر و دیگر اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه نداشت (جدول 2). براساس نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل آبیاری در قارچ مایکوریزا، با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید درصد کلونیزاسیون هر دو گونه قارچ مایکوریزا کاهش معنی­داری نسبت­به آبیاری کامل و کم­آبیاری متوسط داشت. با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری متوسط درصد کلونیزاسیون هر دو گونه قارچ مورد بررسی تغییر معنی‌داری نشان نداد.

در تیمار عدم تلقیح با کاهش آبیاری از سطح آبیاری مطلوب درصد کلونیزاسیون کاهش معنی‌داری داشت (شکل 8). کلونیزاسیون ریشه توسط قارچ‌های مایکوریزا آربسکولار باعث افزایش تشکیل ریشه و خواص هیدرولیکی ریشه شده که نتیجه در ایجاد یک سیستم ریشه بسیار کارآمد برای جذب آب و مواد مغذی دارد (Quiroga et al., 2018). مطالعات قبلی نشان داد که کلونیزاسیون ریشه توسط قارچ‌های مایکوریزا آربسکولار و رشد هیف تحت تنش کمبود آب کاهش یافت (Boutasknif et al., 2018;
Zou et al., 2019) که تاییدکننده نتایج پژوهش حاضر است. به نظر می‌رسد در شرایط محدودیت آب خاک، جوانه‌زنی و توسعه هاگ قارچ کاهش یافته که در نتیجه در کاهش درصد کلونیزاسیون ریشه داشته است (Püschel et al., 2021). در بررسی دیگر محققان نیز کاهش کلونیزاسیون ریشه تحت تنش کم­آبی گزارش شده است (Zhang et al., 2019). در مطالعه‌ای دیگر نیز درصد کلونیزاسیون ریشه شنبلیله توسط قارچ گونه Glomus intraradices با کاهش میزان رطوبت خاک کاهش معنی‌داری نشان داد (Siavash Moghaddam et al., 2017).

شکل 8. مقایسه میانگین تغییرات درصد کلونیزاسیون ریشه خیار تلخ تحت اثر متقابل رژیم آبیاری×قارچ مایکوریزا.  I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

8-3. عملکرد میوه

با­توجه­به نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها، عملکرد میوه به­طور معنی­داری (p<0.01) تحت اثرات اصلی آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه این عوامل قرار گرفت (جدول 2). براساس نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل سه­گانه بین تیمارها، بیشترین عملکرد میوه خیار تلخ (27/3133 گرم بر متر مربع) به بوته­های تلقیح­شده توسط گونه Glomus mosseae در شرایط آبیاری کامل و مصرف کود فسفر اختصاص داشت که دارای اختلاف معنی­داری با سایر ترکیبات تیماری بود. نتایج نشان داد در هر سطح آبیاری و در هر تیماری از کود فسفر با تلقیح بوته‌ها توسط دو گونه قارچ Glomus mosseae و
Glomus intraradices عملکرد میوه نسبت­به عدم تلقیح افزایش معنی­داری داشت. نتایج همچنین نشان داد در شرایط آبیاری کامل و کم­آبیاری متوسط تحت عدم تلقیح و تلقیح توسط گونه Glomus mosseae با کاربرد کود فسفر عملکرد میوه افزایش و تحت تلقیح با گونه Glomus intraradices کاهش معنی­داری نشان داد. در شرایط کم­آبیاری شدید نیز با کاربرد کود فسفر تحت تلقیح هر دو گونه قارچ مایکوریزا عملکرد میوه کاهش معنی­داری نسبت­به عدم مصرف کود فسفر نشان داد (شکل 9).

خانواده کدوئیان به‌خصوص خیار گیاهانی حساس به کمبود آب می­باشند. طی بررسی‌های انجام­شده در خیار تلخ
 (Momordica Charantia L.) با کاهش آبیاری از سطح 80 تا 40 درصد ظرفیت زراعی وزن میوه کاهش معنی­داری داشت (Mohasseli & Farbood, 2022) که با نتایج حاصل از این بررسی مبنی بر کاهش عملکرد میوه تحت تنش کم­آبیاری مطابقت دارد. در بررسی­های دیگری بر هندوانه، کاربرد قارچ مایکوریزا در شرایط تنش خشکی عملکرد میوه را در سطحی برابر شرایط آبیاری مطلوب افزایش داد (Yang & He, 2022). قارچ مایکوریزا همچنین با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی از طریق افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی همچون کاتالاز و پراکسیداز و تجمع پرولین تحت تنش خشکی نقش مهمی در افزایش رشد و عملکرد دارد (Sheteiwy et al., 2021).

شکل 9. مقایسه میانگین تغییرات عملکرد میوه خیار تلخ تحت اثر متقابل رژیم آبیاری×کود فسفر×قارچ مایکوریزا. P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

9-3. کوماریک­اسید

نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که مقدار کوماریک­اسید میوه به‌طور معنی‌داری (p<0.01) تحت اثرات اصلی آبیاری، کود فسفر، قارچ مایکوریزا و اثرات متقابل دوگانه (بجز کود فسفر در مایکوریزا) و سه‌گانه قرار گرفت (جدول 2). طبق نتایج مقایسه میانگین اثر متقابل سه­گانه بین تیمارها، بیشترین مقدار کوماریک­اسید میوه (11 پی­پی­ام) به بوته­های تحت کم­آبیاری شدید و تلقیح­شده توسط گونه Glomus mosseae با کاربرد و عدم کاربرد کود فسفر اختصاص داشت. نتایج نشان داد در هر سطح آبیاری و در شرایط مصرف و عدم مصرف کود فسفر با تلقیح بوته‌ها توسط هر دو گونه قارچ مایکوریزا مقدار کوماریک­اسید میوه افزایش معنی­داری نسبت­به عدم تلقیح نشان داد. براساس نتایج به­دست­آمده با کاهش آبیاری تا سطح کم­آبیاری شدید با تلقیح بوته‌ها توسط هر دوگونه Glomus mosseae و Glomus intraradices مقدار کوماریک­اسید افزایش معنی‌داری نسبت­به آبیاری کامل در هر دو شرایط مصرف (بجز تیمار شاهد) و عدم مصرف کود فسفر داشت (شکل 10).

فنولیک‌ها به­دلیل خواص آنتی‌اکسیدانی، ضد التهابی و ضد دیابتی خود مورد توجه هستند، آنها به‌عنوان یک جزء حیاتی رژیم غذایی انسان در نظر گرفته می‌شوند و دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی فوق‌العاده هستند (Kumar & Goel, 2019). آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی اغلب ترکیبات فنولی هستند که در همه بخش‌های یک گیاه وجود دارند. این ترکیبات متابولیت‌های ثانویه هستند که به­دلیل دارابودن خصوصیات اکسایش و کاهشی می‌توانند گونه‌های فعال اکسیژن را با دادن اتم هیدروژن و تبدیل آنها به ترکیبات غیر رادیکالی پایدارتر مهار کنند (Wijngaard et al., 2009). بنابراین در شرایط تنش افزایش این متابولیت‌های ثانویه می‌تواند یک واکنش دفاعی در مقابل تولید گونه‌های فعال اکسیژن بوده باشد. در پژوهشی با کاهش آبیاری اسیدهای فنولیکی همچون فرولیک­اسید، کوماریک­اسید و کافئیک­اسید دو رقم انگور افزایش معنی­داری نسبت­به آبیاری روزانه داشت (Moayedinezhad et al., 2020) که با نتایج حاصل از این بررسی مبنی­بر افزایش ترکیب فنولیکی کوماریک­اسید تحت تنش خشکی مطابقت دارد. قارچ‌های میکوریزا­آربوسکولار با بهبود متابولیسم گیاه هم بر کیفیت و هم بر کمیت متابولیت‌های ثانویه تأثیر می‌گذارند
 (Fokom et al., 2019). طبق نتایج بررسی حاضر تحت کاربرد هر دو گونه قارچ مایکوریزا مقدار ترکیب فنولیکی کوماریک­اسید میوه افزایش یافت (شکل 10).

شکل 10. مقایسه میانگین تغییرات کوماریک­اسید میوه خیار تلخ تحت اثر متقابل سه­گانه رژیم آبیاری×کود فسفر×قارچ مایکوریزا.
 P0: عدم کاربرد کود فسفر، P1: کاربرد کود فسفر، I1: آبیاری نرمال، I2: تنش کم­آبیاری متوسط، I3: تنش کم­آبیاری شدید، M0: شاهد (بدون تلقیح)، M1: Glomus mosseae، و M2: Glomus intraradices.

ns، * و ** به­ترتیب نشان­دهنده عدم معنی­داری و معنی داری در سطح احتمال پنج و یک درصد می­باشند.

4. نتیجه­گیری

با­توجه­به نتایج کلی از این بررسی تحت تلقیح دو گونه قارچ مایکوریزا و مصرف کود فسفر تجمع پرولین در برگ افزایش یافت که با حفظ یکپارچگی غشاء (کاهش MDA) و کاهش نشت یونی برگ باعث حفاظت دستگاه فتوسنتزی در برابر تنش اکسیداتیو ناشی از کم‌آبیاری و افزایش جذب فسفر و سنتز کلروفیل شد که به افزایش رشد و عملکرد میوه منجر شد. بیشترین عملکرد میوه به بوته‌های تحت تلقیح با گونه Glomus mosseae و کاربرد فسفر در شرایط آبیاری کامل اختصاص داشت. از طرفی قارچ­های مایکوریزا با افزایش ترکیبات فنولیک کوماریک­اسید میوه در شرایط کم‌آبیاری نقش مهمی در افزایش کیفیت میوه داشتند. بیشترین مقدار کوماریک­اسید میوه (تقریباً 11 پی­پی­ام) به بوته­های تحت تلقیح با گونه Glomus mosseae در شرایط مصرف و عدم مصرف کود فسفر و تحت شرایط کم­آبیاری شدید مربوط بود. بنابراین با­توجه­به نتایج به­دست­آمده از بررسی حاضر می­توان کاربرد دو گونه
 Glomus mosseae و Glomus intraradices و عنصر فسفر کافی را جهت بهبود عملکرد و کیفیت میوه گیاه خیار تلخ تحت شرایط کم‌آبیاری و آبیاری کامل پیشنهاد کرد.

5. منابع

Ahmad, H., Hayat, S., Ali, M., Liu, T., & Cheng, Z. (2018). The combination of arbuscular mycorrhizal fungi inoculation (Glomus versiforme) and 28‐homobrassinolide spraying intervals improves growth by enhancing photosynthesis, nutrient absorption, and antioxidant system in cucumber (Cucumis sativus L.) under salinity. Ecology and Evolution, 8(11), 5724-5740.‏

Ahmad, P., Jamsheed, S., Hameed, A., Rasool, S., Sharma, I., Azooz, M.M., & Hasanuzzaman, M. (2014). Drought stress induced oxidative damage and antioxidants in plants. In Oxidative damage to plants. Academic Press. 345-367.

Aleksandra, C.M., Neda, M.M., Anamarija, I.M, Marijana, B.S., Ivan, L.M., & Ivana, J.S. (2011). Development of a rapid resolution HPLC method for the separation and determination of 17 phenolic compounds in crude plant extracts. Central European Journal of Chemistry, 9(1), 133-142.

An, Y., & Liang, Z. (2013). Drought tolerance of Periploca sepium during seed germination: Antioxidant defense and compatible solutes accumulation. Acta Physiologiae Plantarum, 35(3), 959-967.‏

Arnon, A.N. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23(1), 112-121.‏

Bates, L.S., Waldren, R.P., & Teare, I.D. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39(1), 205-207.‏

Begum, N., Ahanger, M.A., Su, Y., Lei, Y., Mustafa, N.S.A., Ahmad, P., & Zhang, L. (2019). Improved drought tolerance by AMF inoculation in maize (Zea mays) involves physiological and biochemical implications. Plants, 8(12), 579.‏

Begum, N., Xiao, Y., Wang, L., Li, D., Irshad, A., & Zhao, T. (2023). Arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis alleviates drought stress in soybean with overexpressing the GmSPL9d gene by promoting photosynthetic apparatus and regulating the antioxidant system. Microbiological Research, 273, 127398.

Boo, Y.C. (2019). p-Coumaric acid as an active ingredient in cosmetics: A review focusing on its antimelanogenic effects. Antioxidants, 8(8), 275.

Boutasknit, A., Baslam, M., Ait-El-Mokhtar, M., Anli, M., Ben-Laouane, R., Douira, A., ..., & Meddich, A. (2020). Arbuscular mycorrhizal fungi mediate drought tolerance and recovery in two contrasting carob (Ceratonia siliqua L.) ecotypes by regulating stomatal, water relations, and (in) organic adjustments. Plants, 9(1), 80.

Cakmak, I., & Horst, W. (1991). Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities in root tip of soybean (Glysin max L.). Plant Physiology, 83, 463-468.

Cakmakci, O., Cakmakci, T., Durak, E.D., Demir, S., & Sensoy, S. (2017). Effects of arbuscular mycorrhizal fungi in melon (Cucumis melo L.) seedling under deficit irrigation. Fresenius Environmental Bulletin, 26(12), 7513-7520.‏

Caverzan, A., Passaia, G., Rosa, S.B., Ribeiro, C.W., Lazzarotto, F., & Margis-Pinheiro, M. (2012). Plant responses to stresses: role of ascorbate peroxidase in the antioxidant protection. Genetics and Molecular Biology, 35, 1011-1019.

Chandrasekaran, M. (2022). Arbuscular mycorrhizal fungi mediated alleviation of drought stress via non-enzymatic antioxidants: A meta-analysis. Plants, 11(19), 2448.

Chapman, H.D., & Pratt, P.F. (1962). Methods of analysis for soils, plants and waters. Soil Science, 93(1), 68.‏

Dhillon, N.P., Lin, C.C., Sun, Z., Hanson, P.M., Ledesma, D.R., Habicht, S.D., & Yang, R.Y. (2017). Varietal and harvesting stage variation in the content of carotenoids, ascorbic acid and tocopherols in the fruit of bitter gourd (Momordica charantia L.). Plant Genetic Resources, 15(3), 248-259.

Duan, B., Yang, Y., Lu, Y., Korpelainen, H., Berninger, F., & Li, C. (2007). Interactions between drought stress, ABA and genotypes in Picea asperata. Journal of Expriment Botany, 58, 3025-3036.

El Basyoni, I., Saadalla, M., Baenziger, S., Bockelman, H., & Morsey, S. (2017). Cell membrane stability and association mapping for drought and heat tolerance worldwide wheat collection. Sustainability, 9, 1606.

Fitter, A.H., Helgason, T., & Hodge, A. (2011). Nutritional exchanges in the arbuscular mycorrhizal symbiosis: Implications for sustainable agriculture. Fungal Biology Reviews, 25(1), 68-72.‏

Fokom, R., Adamou, S., Essono, D., Ngwasiri, D.P., Eke, P., Mofor, C.T., ..., & Sharma, A.K. (2019). Growth, essential oil content, chemical composition and antioxidant properties of lemongrass as affected by harvest period and arbuscular mycorrhizal fungi in field conditions. Industrial Crops and Products, 138, 111477.

Goss, M.J., Carvalho, M., & Brito, I. (2017). Functional diversity of mycorrhiza and sustainable agriculture: Management to overcome biotic and abiotic stresses. Academic press, London.

Hashem, A., Abd_Allah, E.F., Alqarawi, A.A., Al-Huqail, A.A., Wirth, S., & Egamberdieva, D. (2016). The interaction between arbuscular mycorrhizal fungi and endophytic bacteria enhances plant growth of Acacia gerrardii under salt stress. Frontiers in Microbiology, 7, 1089.

Heath, R.L., & Packer, L. (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 125(1), 189-198.

Herrera-Medina, M.J., Steinkellner, S., Vierheilig, H., Ocampo Bote, J.A., & Garcia Garrido, J. (2007). Abscisic acid determines arbuscule development and functionality in the tomato arbuscular mycorrhiza. New Phytologist, 175(3), 554-564.

Hidangmayum, A., & Dwivedi, P. (2018). Plant responses to Trichoderma spp. and their tolerance to abiotic stresses: A review. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 7(1), 758-766.‏

Hijikata, N., Murase, M., Tani, C., Ohtomo, R., Osaki, M., & Ezawa, T. (2010). Polyphosphate has a central role in the rapid and massive accumulation of phosphorus in extraradical mycelium of an arbuscular mycorrhizal fungus. The New Phytologist, 186(2), 285-289.

Jatav, S.S., Parihar, M., Patra, A., Singh, S.K., Chitara, M.K., Mohapatra, K.K., & Rana, K. (2021). Soil microbes in plant growth promotion and for mitigation of abiotic stress of drought. Soil Microbiomes for Sustainable Agriculture: Functional Annotation, 175-201.

Kafkas, S., & Ortas, I. (2009). Various mycorrhizal fungi enhance dry weights, P and Zn uptake of four Pistacia species. Journal of Plant Nutrition, 32(1), 146-159.‏

Kamali, S., & Mehraban, A. (2020). Nitroxin and arbuscular mycorrhizal fungi alleviate negative effects of drought stress on Sorghum bicolor yield through improving physiological and biochemical characteristics. Plant Signaling & Behavior, 15(11), 1813998.‏

Kumar, N., & Goel, N. (2019). Phenolic acids: Natural versatile molecules with promising therapeutic applications. Biotechnology Reports, 24, e00370.

Li, S., Yang, Y., Zhang, Q., Liu, N., Xu, Q., & Hu, L. (2018). Differential physiological and metabolic response to low temperature in two zoysiagrass genotypes native to high and low latitude. Plos One, 13(6), e0198885.

Lichthentaler, H.K. (1987). Chlorophyll and carotenoids-pigments of photosynthetic biomembranes, In Methods in Enzymology. Edited by Colowick, SP., Kaplan, No. Vol. 148.

Lutts, S., Kinet, J.M., & Bouharmont, J. (1996). NaCl-induced senescence in leaves of rice (Oryza sativa L.) cultivars differing in salinity resistance. Annals of Botany, 78(3), 389-398.‏

Mahmood, M.S., Rafique, A., Younas, W., & Aslam, B. (2019). Momordica charantia L.(bitter gourd) as a candidate for the control of bacterial and fungal growth. Pakistan Journal of Agricultural Sciences, 56(4).‏

Maluleke, M.K. (2022). Metabolite profile of African horned cucumber (Cucumis metuliferus E. May. Ex Naudin) fruit grown under differing environmental conditions. Scientific Reports, 12(1), 1-18.‏

Marschner, P. (2012). Phosphorus, in Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plant, 3rd Edn. London: Academic Press; Elsevier Ltd.), 265–277.

Martin, D.L., Stegman, E.C., & Fereres, E. (1990). Irrigation scheduling principles. IN: Management of Farm Irrigation Systems. American Society of Agricultural Engineers, St. Joseph, MI. 1990. p 155-203, 19 fig, 9 tab, 81 ref.‏

McDowell, N.G., Sapes, G., Pivovaroff, A., Adams, H.D., Allen, C.D., Anderegg, W.R., ..., & Xu, C. (2022). Mechanisms of woody-plant mortality under rising drought, CO2 and vapour pressure deficit. Nature Reviews Earth & Environment, 3(5), 294-308.

Moayedinezhad, A., Mohammadparast, B., Hosseini Salekdeh, G., Mohsenifard, E., & Nejatian, M.A. (2020). Effects of drought stress on total phenolics, phenolic acids, polyamines and some organic acids in two important Iranian grapevine cultivars, Journal of Plant Process and Function, 8(34), 19-26.‏

Mohasseli, V., & Farbood, F. (2022). Effect of compost on growth characteristics and macronutrients concentration in Momordica Charantia L. under moisture stress. Iranian Journal of Soil Research, 35(4), 353-366.

Mona, S.A., Hashem, A., Abd_Allah, E.F., Alqarawi, A.A., Soliman, D.W.K., Wirth, S., & Egamberdieva, D. (2017). Increased resistance of drought by Trichoderma harzianum fungal treatment correlates with increased secondary metabolites and proline content. Journal of Integrative Agriculture, 16(8), 1751-1757.‏

Najafi, S., Nazari Nasi, H., Tuncturk, R., Tuncturk, M., Sayyed, R.Z., & Amirnia, R. (2021). Biofertilizer application enhances drought stress tolerance and alters the antioxidant enzymes in medicinal pumpkin (Cucurbita pepo convar. pepo var. Styriaca). Horticulturae, 7(12), 588.‏

Nazari Nasi, H., Amirnia, R., & Zardashti, M. (2018). Effect of drought stress and biofertilizers on some physiological characteristics and grain yield of medicinal pumpkin plants. Journal of Crops Improvement, 20(1), 205-217.

Ortas, I. (2012). The effect of mycorrhizal fungal inoculation on plant yield, nutrient uptake and inoculation effectiveness under long-term field conditions. Field Crops Research, 125, 35-48.‏

Pei, K., Ou, J., Huang, J., & Ou, S. (2016). p‐Coumaric acid and its conjugates: Dietary sources, pharmacokinetic properties and biological activities. Journal of the Science of Food and Agriculture, 96(9), 2952-2962.

Phillips, J.M., & Hayman, D.S. (1970). Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55(1), 158-IN18.‏

Püschel, D., Bitterlich, M., Rydlová, J., & Jansa, J. (2021). Drought accentuates the role of mycorrhiza in phosphorus uptake. Soil Biology and Biochemistry, 157, 108243.

Quiroga, G., Erice, G., Aroca, R., Zamarreño, Á.M., García-Mina, J.M., & Ruiz-Lozano, J.M. (2018). Arbuscular mycorrhizal symbiosis and salicylic acid regulate aquaporins and root hydraulic properties in maize plants subjected to drought. Agricultural Water Management, 202, 271-284.

Raja, V., Majeed, U., Kang, H., Andrabi, K.I., & John, R. (2017). Abiotic stress: Interplay between ROS, hormones and MAPKs. Environmental and Experimental Botany, 137, 142-157.

Razavi, S.M., Ghorbanian, A., & Abadi, A. (2022). Impact of drought stress on growth–yield parameters, volatile constituents and physio-biochemical traits of three Foeniculum vulgare genotypes. Agricultural Research, 11(4), 591-607.‏

Ruelland, E., Vaultier, M.N., Zachowski, A., & Hurry, V. (2009). Cold signalling and cold acclimation in plants. Advances in Botanical Research, 49, 35-150.

Ruiz-Sánchez, M., Aroca, R., Muñoz, Y., Polón, R., & Ruiz-Lozano, J.M. (2010). The arbuscular mycorrhizal symbiosis enhances the photosynthetic efficiency and the antioxidative response of rice plants subjected to drought stress. Journal of Plant Physiology, 167(11), 862-869.

Sheteiwy, M.S., Ali, D.F.I., Xiong, Y.C., Brestic, M., Skalicky, M., Hamoud, Y.A., ..., & El-Sawah, A.M. (2021). Physiological and biochemical responses of soybean plants inoculated with arbuscular mycorrhizal fungi and Bradyrhizobium under drought stress. BMC Plant Biology, 21(1), 1-21.‏

Siavash Moghaddam, S., Rahimi, A., Heydarzadeh, S., Moradzadeh, S., & Hasanloo, M. (2017). The effect of mycorrhizal symbiosis on the yield and biochemical traits of fenugreek under water deficit stress. Journal of Medicinal Plants Biotechnology, 3(1), 39-52.

Sofy, M.R., Aboseidah, A.A., Heneidak, S.A., & Ahmed, H.R. (2021). ACC deaminase containing endophytic bacteria ameliorate salt stress in Pisum sativum through reduced oxidative damage and induction of antioxidative defense systems. Environmental Science and Pollution Research, 28, 40971-40991.

Sur, S., & Ray, R.B. (2020). Bitter melon (Momordica charantia), a nutraceutical approach for cancer prevention and therapy. Cancers, 12(8), 2064.

Suriyagoda, L.D., Ryan, M.H., Renton, M., & Lambers, H. (2014). Plant responses to limited moisture and phosphorus availability: A meta-analysis. Advances in Agronomy, 124, 143-200.

Tariq, A., Pan, K., Olatunji, O.A., Graciano, C., Li, Z., Sun, F., ..., & Zhang, A. (2018). Phosphorous fertilization alleviates drought effects on Alnus cremastogyne by regulating its antioxidant and osmotic potential. Scientific Reports, 8(1), 5644.

Theocharis, A., Clément, C., & Barka, E.A. (2012). Physiological and molecular changes in plants grown at low temperatures. Planta, 235, 1091-1105.

Vanclooster, M., Viaene, P., Diels, J., & Chistiaens, K. (1994). WAVE, A mathematical model for simulating water and agrochemicals in the soil and vadose environment, Release 2.1.

Verbruggen, E., van der Heijden, M.G., Rillig, M.C., & Kiers, E.T. (2013). Mycorrhizal fungal establishment in agricultural soils: Factors determining inoculation success. New Phytologist, 197(4), 1104-1109.

Wijngaard, H.H., Rossle, C., & Brunton, N. (2009). A survey of Irish fruit and vegetable waste and by-products as a source of polyphenolic antioxidants. Food Chemistry, 116(1), 202-207.

Yang, P., & He, S. (2022). The effects of arbuscular mycorrhizal fungi and deficit irrigation on the yield and sugar content of watermelons (Citrullus lanatus). Horticultural Science, 49(4), 225-233.‏

Yoshimura, K., Yabuta, Y., Ishikawa, T., & Shigeoka, S. (2000). Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stresses. Plant Physiology, 123(1), 223-234.

Zhang, Z., Zhang, J., Xu, G., Zhou, L., & Li, Y. (2019). Arbuscular mycorrhizal fungi improve the growth and drought tolerance of Zenia insignis seedlings under drought stress. New Forests, 50(4), 593-604.

Zou, K., Shang, S., Tian, L., Zhu, G., Zhou, M., & Pan, Q. (2018). Effects of low temperature stress on osmotic solutes of grafted bitter gourd seedlings. Chinese Journal of Tropical Crops, 39(8), 1533-9.

Zou, Y.N., Wu, H.H., Giri, B., Wu, Q.S., & Kuča, K. (2019). Mycorrhizal symbiosis down-regulates or does not change root aquaporin expression in trifoliate orange under drought stress. Plant Physiology and Biochemistry, 144, 292-299.

[1]. Arbuscular mycorrhizal fungi

1. Reactive Oxygen Species