مقدمه

بیماری مزمن التهابی روده (Chronic Inflammatory Enteropathy) در سگ‌ها یک وضعیت پیچیده و چندعاملی است که با التهاب مداوم دستگاه گوارش مشخص می‌شود و به علائمی، مانند استفراغ مزمن، اسهال، کاهش وزن و تغییرات اشتها منجر می‌گردد. این بیماری به‌دلیل پاسخ غیرطبیعی سیستم ایمنی به ترکیبات روده (مانند مواد غذایی و باکتری‌های فلور نرمال) ایجاد شده و تشخیص آن مبتنی بر رد سایر بیماری‌ها و نمونه‌برداری از روده است. درمان معمولاً شامل تغییرات غذایی (مانند رژیم‌های حذفی یا هیدرولیزه) و داروهای سرکوب‌کننده ایمنی است (1). با وجود اهمیت بالینی آن، علل دقیق CIE هنوز به‌خوبی مشخص نشده‎است؛ زیرا تحت تأثیر ترکیبی از اختلالات ایمنی، عوامل غذایی، عدم تعادل در میکروبیوم روده و استعداد ژنتیکی قرار دارد (2، 3)، این پیچیدگی، تشخیص و مدیریت را برای دامپزشکان چالش‌برانگیز می‌کند، در‌حالی‌که مطالعات برخی جنبه‌های CIE را روشن کرده است، مکانیسم‌های مولکولی و مسیرهای خاصی که باعث پیشرفت بیماری می‌شوند، هنوز به‌طور کامل شناخته نشده است و درک پاتوژنز آن به‌طور دقیق مشخص نیست (4، 5).

در سال‌های اخیر، پیشرفت‌های علم بیوانفورماتیک و زیست‌شناسی مولکولی راه‌های جدیدی برای بررسی بیماری‌هایی، مانند CIE گشوده است. به‌عنوان‌مثال، فناوری توالی‌یابی RNA تک‌سلولی (scRNA-seq) توانایی ما را در مطالعه ناهمگونی سلولی در بافت‌ها و اینکه هر بافت شامل جمعیت‌های سلولی متفاوت می‌باشد متحول کرده و بینش‌های جدیدی در‌مورد نقش‌ سلول‌ها در فرایندهای بیماری ارائه می‌دهد (6). با تحلیل بیان ژن در سطح تک‌سلولی، محققین می‌توانند ژن‌های متفاوت بیان‌شده differentially expressed genes (DEGs) و مسیرهای مولکولی‌ای که ممکن است برای توسعه و پیشرفت شرایط التهابی حیاتی باشند، شناسایی کنند (7). این رویکرد در بررسی بیماری‌های مزمن انسانی، به‌ویژه ارزشمند بوده و برای کشف تنظیم‌کننده‌های کلیدی التهاب و مسیرهای مرتبط با ایمنی استفاده شده است (8). با‌این‌حال، در‌زمینه CIE در سگ‌ها، کاربرد چنین تکنیک‌های پیشرفته‌ای هنوز محدود است و نیاز به مطالعات بیشتری برای پر کردن این شکاف وجود دارد (9).

یکی از زمینه‌های پژوهشی جالب‌توجه، بررسی ارتباط میان عفونت‌های ویروسی و بروز بیماری‌های التهابی مزمن است. برای نمونه، پاروویروس سگ‌ها که یک عفونت به‌شدت مسری و اغلب خطرناک محسوب می‌شود، عمدتاً به‌عنوان عاملی برای آسیب‌های حاد گوارشی شناخته شده است. با‌این‌حال اگرچه عفونت‌های ناشی از این ویروس معمولاً حالت حاد دارند، شواهد فزاینده‌ای نشان می‌دهند این ویروس‌ها قادر به ایجاد اختلالات ایمنی پایدار می‌باشند و می‌توانند در پیدایش بیماری‌های مزمنی، مانند «انتروپاتی التهابی مزمن» نقش داشته باشند (10). اگرچه شواهد مستقیمی درباره ارتباط پاروویروس با انتروپاتی التهابی مزمن (CIE) هنوز در دسترس نیست، این احتمال وجود دارد که عفونت‌های ویروسی در شروع یا تشدید التهاب مزمن نقش داشته باشند که بررسی این موضوع نیازمند مطالعات بیشتر است. درک چنین ارتباطاتی می‌تواند بینش‌های حیاتی در‌مورد علت‌شناسی بیماری CIE ارائه دهد و مبنای علمی برای توسعه راهبردهای درمانی مؤثرتر فراهم کند (11).

مطالعه حاضر به بررسی مسیرهای مولکولی درگیر در CIE می‌پردازد و تمرکز خاصی بر روی مسیر KEGG مرتبط با عفونت ویروس لوسمی سلولT ۱ (cfa05166) دارد. مطالعه حاضر با استفاده از تلفیق آنالیزهای بیوانفورماتیک و آزمایش‌های مولکولی نشان می‌دهد مسیر cfa05166 (عفونت ویروس لوسمی سلول T انسانی) به‌طور معنی‌داری در پاتوژنز انتروپاتی التهابی مزمن (CIE) نقش دارد. این مسیر از‌طریق تنظیم ۱۵ ژن کلیدی، از‌جمله EGR2، NFKBIA و SLC2A1 که در پاسخ ایمنی و التهاب دخیل می‌باشند، موجب اختلال در عملکرد سد روده‌ای و تشدید پاسخ التهابی می‌شود. شناسایی این مکانیسم‌ها می‌تواند زمینه‌ساز توسعه روش‌های تشخیصی غیرتهاجمی و درمان‌های هدفمند مبتنی بر مهار مسیرهای سیگنالینگ مرتبط باشد. مطالعه حاضر با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک و داده‌های scRNA-seq، به شناسایی و تحلیل ژن­های معنی­دار DEGs در این مسیر خواهد پرداخت، از‌جمله کاندیداهای قابل‌توجهی مانند نوراپیلین ـ ۱‌(NRP1)، ژن‌های پاسخ رشد زودهنگام EGR1 و EGR2 و فاکتور هسته‌ای سلول‌های T فعال (NFATC4) (12).

این ژن‌ها که به‌خاطر نقش خود در تنظیم ایمنی و التهاب شناخته می‌شوند، اهداف امیدوارکننده‌ای برای درک مکانیسم‌های دقیق بیماری انتروپاتی التهابی مزمن (CIE) به شمار می‌آیند. مطالعه حاضر بیومارکرهای بالقوه‌ای شامل نوراپیلین ـ ۱ (NRP1)، ژن‌های پاسخ رشد زودهنگام EGR1 و EGR2 و فاکتور هسته‌ای سلول‌های T فعال (NFATC4) را شناسایی کرده است. انتخاب این فاکتورها بر‌اساس مشارکت آن‌ها در مسیرهای سیگنالینگ التهاب و پاسخ ایمنی، نقش آن‌ها در تنظیم فرایندهای سلولی کلیدی، مانند تکثیر و تمایز، پتانسیل بالای هدف درمانی به‌دلیل قابلیت مهار دارویی و همچنین بیان تفاوت‌ معنی‌دار در نمونه‌های بیماران صورت گرفته است. بررسی هم‌زمان این نشانگرها می‌تواند باعث درک بهتر پاتوژنز بیماری و توسعه راهبردهای درمانی نوین شود.

هدف اصلی مطالعه حاضر، کشف مسیرهای سیگنالینگ سلولی و پاسخ‌های ایمنیِ مختل‌شده در سگ‌های مبتلا به CIE ازطریق تلفیق یافته‌های زیست‌شناسی مولکولی و مشاهدات بالینی است. مطالعه حاضر به دنبال تعمیق درک مکانیسم‌های بیماری، شناسایی اهداف درمانی جدید و ارتقای دقت تشخیص و پیش‌آگهی در حیوانات بیمار می‌باشد. دستاوردهای مطالعه حاضر نه‌تنها گزینه‌های درمانی را برای سگ‌های مبتلا بهبود می‌بخشد، بلکه به حوزه‌های گسترده‌تری از دامپزشکی مقایسه‌ای و مطالعه بیماری‌های التهابی کمک خواهد کرد (13، 14).

مواد و روش‌ کار

آنالیز تک‌سلولی (شناسایی ژن‌های متفاوت بیان‌شده (DEGs) از تجزیه‌و‌تحلیل داده‌های RNA-Seq تک‌سلولی): مطالعه حاضر شامل تجزیه‌و‌تحلیل یک مجموعه داده از CIE بود که از پایگاه داده GEO-NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)  به دست آمده است. آنالیزها با استفاده از کلیدواژه‌های تخصصی در پایگاه‌های GEO و KEGG انجام شد که به شناسایی ۳۸۵ ژن معنی­دار منجر گردید. در ادامه اهداف نهایی مطالعه بر‌اساس هم‌گرایی یافته‌های بیوانفورماتیک و تأیید تجربی تعیین شدند. این مجموعه داده، شامل 3 نمونه از حیوانات سالم و 4 نمونه از سگ‌های مبتلا به CIE بود. به‌منظور تضمین صحت داده‌ها، ارزیابی کیفیت دقیق و پیش‌پردازش با استفاده از بسته Seurat نسخه 3 در زبان برنامه­نویسی R انجام شد. با اعمال معیارهای کنترل کیفیت، سلول‌های با کیفیت پایین فیلتر شدند و تحلیل‌های بعدی بر روی 7 نمونه (3 سالم و 4 مبتلا به CIE) انجام پذیرفت. نمونه‌ها با استفاده از روش مبتنی بر Findanchor در بستهSeurat  ادغام شدند و سلول‌های اصلی با فیلتر کردن داده‌های توالی‌یابی RNA تک‌سلولی (scRNA-seq) شناسایی شدند. سلول‌هایی که معیارهای کیفیت را نداشتند از تجزیه‌و‌تحلیل بیشتر حذف شدند. داده‌های بیان ژن از سلول‌های اصلی با استفاده از یک مدل رگرسیون خطی نرمال‌سازی شدند. از این مجموعه داده نرمال‌شده، ۲۰۰۰ ژن با تنوع بالا با استفاده از تابع FindVariableFeatures  شناسایی شدند. این ژن‌ها سپس با استفاده از مؤلفه‌های اصلی Principal Component Analysis (PCA)  تجزیه‌و‌تحلیل شدند تا ماتریس داده‌های با ابعاد بالا به یک فرمت با ابعاد پایین‌تر و قابل‌مدیریت‌تر کاهش یابند. ۲۰ مؤلفه اصلی اول برای تحلیل‌های بعدی حفظ شدند، تجزیه مؤلفه‌های اصلی (PCA) بر روی داده‌های بیان نرمال‌شده ۲۰۰۰ ژن با تنوع بالا انجام شد. بر‌اساس روش ElbowPlot، بیست مؤلفه اول که حاوی بیشترین واریانس بیولوژیکی بودند برای تحلیل‌های بعدی، از‌جمله خوشه‌بندی سلولی و ترسیم UMAP انتخاب شدند. همان‌طور که با روش ElbowPlot تعیین شد، خوشه‌بندی در یک وضوح 4/0 انجام شد تا سلول‌هایی با پروفایل‌های بیان مشابه گروه‌بندی شوند.

برای خوشه‌بندی بیشتر از  Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) بر‌اساس ۲۰ مؤلفه اصلی استفاده شد. این کار امکان نمایش واضح و قابل‌تفسیر داده‌ها را در دو بعد فراهم کرد. روش UMAP با قرار دادن سلول‌های دارای پروفایل بیان مشابه در خوشه‌های مجاور و نمایش تفاوت‌های بین گروه‌های آزمایشی (سالم در مقابل CIE) به‌صورت تجمع‌های جداگانه، این امکان را برای محقق فراهم می‌کند تا بتواند الگوهای بیولوژیکی را به‌صورت بصری شناسایی و تفسیر کند. برای شناسایی DEGs بین نمونه‌های CIE و سالم، از تابع FindMarkers در Seurat استفاده شد. ژن‌هایی که تغییر 05/0‌>adjusted P value و |logFC| ≥1، طبق آزمون ویلکاکسون، به‌عنوان معنی‌دار در نظر گرفته شدند. این رویکرد چارچوبی قوی برای کشف تفاوت‌های مولکولی کلیدی بین نمونه‌های سالم و مبتلا به CIE ‌ارائه داد و بینش‌هایی در‌مورد مکانیسم‌های دخیل در بیماری ارائه کرد.

تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG: برای درک بهتر مسیرهای بیولوژیکی درگیر در CIE، یک تحلیل غنی‌سازی KEGG بر روی ژن­های معنی­دار بیان‌شده در مطالعه حاضر انجام شد. این تحلیل با استفاده از ابزار Functional Annotation در پلتفرم  DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)که یک منبع رایج برای آنالیز عملکردی و مسیرها است، انجام شد. برای اطمینان از قابلیت اطمینان نتایج، نرخ کشف کاذب False Discovery Rate (FDR) زیر 05/0 در نظر گرفته شد که یک رویکرد استاندارد برای در نظر گرفتن مقایسه‌های متعدد و کاهش خطای مثبت‌های کاذب است. این مرحله به شناسایی مرتبط‌ترین مسیرهای مرتبط با CIE کمک کرد و بینش‌های ارزشمندی درمورد مکانیسم‌های مولکولی بیماری فراهم آورد.

آزمایشات ‌In vivo: در مطالعه مربوط به  CIEدر سگ‌ها، مجموعاً ۳۵ نمونه جمع‌آوری شد که شامل ۲۵ سگ مبتلا به CIE و ۱۰ سگ کنترل سالم بود. بعد از دریافت تأییدیه اخلاقی، رضایت آگاهانه از صاحبان حیوانات برای جمع‌آوری نمونه‌ها از حیوانات مبتلا انجام شد و نمونه‌های بافتی، بیوپسی‌های ر‌وده، از سگ‌های مورد‌مطالعه جمع‌آوری شد. سگ‌های مبتلا به CIE با استفاده از آزمایش رپید کیت CPV و معاینات بالینی تأیید شدند، در‌حالی‌که نمونه‌های سالم بر‌اساس عدم سابقه بیماری گوارشی و نتایج منفی آزمایش‌های ویروسی انتخاب گردیدند. نمونه‌های سواپ روده با روش‌های استریل جمع‌آوری شدند. برای استخراج  RNA از نمونه‌های سواب گرفته‌شده از ناحیه مقعد، از کیت‌های استخراج RNA مبتنی بر ستون (کیت‌ Sinaclon، ایران یا روش‌های فاز مایع (TRIzol)) استفاده شد. به‌منظور استخراج RNA از نمونه‌های سواب مقعد با غلظت کم، از روش فاز مایع (TRIzol) استفاده شد تا با بهره‌گیری از بازدهی بالای این روش در استخراج از حجم‌های پایین نمونه، حداکثر مقدار RNA حاصل گردد. نمونه‌ها در یک بافر لیز سلولی قرار گرفتند و به‌طور کامل ورتکس شدند تا اطمینان حاصل شود که لیز سلولی به‌طور کامل انجام شده است. در روش مبتنی بر ستون، پس از سانتریفیوژ، مایع فوقانی به ستون منتقل و مراحل شست‌وشو طبق پروتکل کیت انجام شد. RNA نهایی با استفاده از آب RNase-free جدا شد. در روش TRIzol، پس از افزودن کلروفرم و سانتریفیوژ، فاز آبی حاوی RNA جدا و RNA با استفاده از ایزوپروپانول رسوب داده شد. پس از رسوب‌دهی RNA، پلت حاصل با اتانول ۷۰ درصد شست‌وشو و در آب عاری از RNase حل گردید. خلوص و غلظت RNA با استفاده از اسپکتروفتومتر NanoDrop (مدل Nano Mahan، ایران) اندازه‌گیری شد و نمونه‌ها با نسبت جذب 260/280 نانومتر در محدوده 8/1 تا 1/2 مورد تأیید قرار گرفتند. یکپارچگی RNA نیز با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز یک درصد و مشاهده نوارهای واضح 28S و 18S بدون حضور آلودگی تأیید گردید. برای انجام واکنش‌های دقیق ریل ـ تایم PCR، از RNA با غلظت نهایی 50 نانوگرم در میکرولیتر استفاده شد که بر‌اساس پروتکل‌های استاندارد بهینه‌سازی شده است. RNA استخراج‌‌شده در دمای ۸۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد تا از تخریب آن جلوگیری شود. سپس DNA مکمل (cDNA) از RNA استخراج‌‌شده با استفاده از کیت ترانسکریپشن معکوس (پارس توس، ایران) سنتز شد. پرایمرهای مربوط به ژن‌های هدف مرتبط با CIE توسط شرکت پیشگام ایران سنتز شدند (جدول ۱) و بر روی مسیرهای کلیدی التهابی و تنظیمی تمرکز داشتند.  پرایمرها پس از طراحی و ارزیابی پارامترهای ضروری (مانند ویژگی، کارایی، دمای ذوب و عدم تشکیل ساختار ثانویه) با نرم‌افزار  GeneRunner (Hastings Software, Inc., USA)، بررسی شدند و سپس سطح بیان ژن‌های هدف در نمونه‌های گروه‌های CIE و کنترل با روش Real-time PCR با استفاده از کیت SYBR Green (سیناکلون، ایران) در دستگاه (ABI (Applied Biosystems, USA، مورد سنجش قرار گرفت.

برای تحلیل داده‌ها، روش ΔΔCt برای ارزیابی سطوح بیان نسبی ژن‌ها به کار رفت. این روش شامل مقایسه مقادیر Ct (آستانه چرخه) ژن‌های هدف در نمونه‌های CIE با نمونه‌های کنترل بود که به یک ژن خانه‌داری بتااکتین نرمال‌سازی شد. این رویکرد به شناسایی بیومارکرهای بالقوه CIE کمک کرده و بررسی ارزشمندی در‌مورد پاتوفیزیولوژی این بیماری در سگ‌ها ارائه داد.

نتایج

آنالیز بیوانفورماتیک: مجموعه داده GSE254005 از پایگاه GEO به ‌دست آمد و به‌عنوان پایه‌ای برای تحلیل استفاده شد. پس از نرمال‌سازی داده‌ها، جمعیت‌های سلولی با استفاده از بسته Seurat طبقه‌بندی شدند. نتایج نشان داد سلول‌ها می‌توانند به ۲۰ خوشه متمایز گروه‌بندی شوند. برای بررسی تفاوت‌ها بین نمونه‌های CIE و کنترل، ژن­های معنی­دار با استفاده از تابع FindMarkers  به دست آمدند. درمجموع ۳۸۵ ژن معنی­دار شناسایی شد که در مقایسه نمونه‌های CIE (n=4) با کنترل‌های سالم (n=3) به ‌دست آمد.

مطالعات بیشتر در‌مورد آنالیزهای ژن­های معنی­دار از‌طریق تحلیل غنی‌سازی مسیر KEGG انجام شد. این تحلیل یک مسیر سیگنال‌دهی مرتبط با ویروس لوسمی سلول T انسانی نوع ۱ (cfa05166) یا HTLV-1 را مشخص کرد که شامل ۲۱۷ ژن است. از میان این‌ها، ۱۵ ژن به‌طور معنی‌داری در‌زمینه مطالعه حاضر مرتبط شناخته شدند که در جدول ۲ خلاصه شده است. این یافته‌ها بینش‌ ارزشمندی در‌مورد مکانیسم‌های مولکولی زیرین CIE ارائه می‌دهند و مسیرهای بالقوه‌ای را پیشنهاد می‌کنند که ممکن است به توسعه و پیشرفت بیماری کمک کنند.

نتایج Real-Time PCR: بر‌اساس نتایج حاصل از ‌Real-Time PCR، بیان ژن در نمونه‌های بیمار نسبت به کنترل برای ژن EGR2 در گروه CIE به میزان ۵ برابر کاهش معنی‌دار نشان داد (01/0>‌P)، در‌حالی‌که ژن‌های SLC2A1 و NFATC4 به‌ترتیب با ۲ و ۳ برابر افزایش معنی‌دار همراه بودند (05/0>P).‌ ژن‌ CSF2 به میزان 5/0 برابر (05/0P<)‌ وETS2  به میزان 8/0 برابر کاهش معنی‌دار (01/0>P) و ژن‌های FOS 5/1 برابر (05/0P<‌) و ICAM1 به میزان 2/1 افزایش معنی‌دار (05/0P<) نشان دادند. از نظر آماری، هیچ تغییر معنی‌داری در بیان دو ژن NFBIA و CDC20 مشاهده نشد. سطح بیان ژن NFBIA 97/0 برابر کنترل و بیان ژن CDC20 نیز بدون تغییر معنی‎دار بود، اما ژن CCND1، به میزان 8/1 برابر افزایش بیان داشت (تصویر ۱).

بحث

از‌جمله ژن‌های قابل‌توجه می‌توان به NRP1 (نوراپیلین ۱) اشاره کرد که در تنظیمات عصبی و ایمنی نقش دارد. همچنین EGR1 و EGR2 (پاسخ اولیه رشد ۱ و ۲) که فاکتورهای رونویسی حیاتی برای پاسخ‌های سلولی می‌باشند و CSF2 (فاکتور تحریک‌کننده کلونی ۲) که برای هماتوپوئز و توسعه سلول‌های ایمنی ضروری است. سایر ژن‌های مهم شامل این موارد می‌باشند: SLC2A1 ‌(عضو خانواده حامل ۲، عضو ۱) که یک ناقل گلوکز است؛ FOS که بخشی از کمپلکس فاکتور رونویسی AP-1 است و ETS2 و ICAM1 که برای سیگنال‌دهی سلولی و پاسخ‌های ایمنی حیاتی می‌باشند. همچنین NFATC4 و NFKBIA نقش‌های محوری در تنظیم فرایندهای التهابی ایفا می‌کنند. در‌حالی‌که CDC20، CCND1 (سیکلین D1) و ESPL1 (پول‌های اضافی مانند ۱، جداکننده) در تنظیم چرخه سلولی دخیل می‌باشند. در‌نهایت، CREB3L3 (پروتئین باندکننده عنصر پاسخ‌دهنده به cAMP مشابه ۳) و TSPO (پروتئین ترانسلوکاتور) به پاسخ‌های استرسی، تکثیر سلولی و آپوپتوز کمک می‌کنند و عملکردهای متنوع این ژن‌ها را بیشتر نشان می‌دهند. یافته‌ها نشان‌دهنده تغییرات قابل‌توجهی در بیان ژن نسبت به β-actin بودند. به‌عنوان‌مثال، EGR2 به‌طور قابل‌توجهی افزایش بیان (۵ برابر) داشت که با نقش شناخته‌شده‌اش در تمایز و تکثیر سلولی همخوانی دارد. در مقابل، CSF2 و ETS2 کاهش بیان را نشان دادند که با نقش‌های آن‌ها در پاسخ‌های التهابی سازگار است. کاهش چشمگیر NFKBIA نشان‌دهنده افزایش سیگنال‌دهی NF-κB است که معمولاً با پاتولوژی‌های التهابی مرتبط است. افزایش بیان SLC2A1 و NFATC4 نیز نقش‌های آن‌ها را در متابولیسم گلوکز و تنظیم ایمنی تأیید می‌کند. افزایش جزئی FOS و ICAM1 نشان‌دهنده پاسخ‌های تطبیقی سلولی است. درحالی‌که CDC20 پایدار ماند. ازسوی‌دیگر، افزایش بیان CCND1 نیز با نقش آن در تنظیم چرخه سلولی، به‌ویژه در شرایط تکثیر همخوانی دارد. در مطالعه حاضر، با بهره‌گیری از تحلیل‌های توالی‌یابی RNA تک‌سلولی (scRNA-seq) بر روی داده‌های بارگذاری‌شده در پایگاه داده GEO، ژن‌های دارای بیان افتراقی در سگ‌های مبتلا به بیماری التهابی روده (CIE) شناسایی شدند. با استفاده از بسته نرم‌افزاری Seurat برای ادغام داده‌ها، نرمال‌سازی و کاهش ابعاد، مطالعه حاضر کیفیت بالای داده‌ها را تضمین کرده و به بررسی دقیق چشم‌انداز سلولی مرتبط با CIE پرداخته است. ژن‌های کلیدی مانند NRP1، EGR1، EGR2 و NFATC4  شناسایی شدند که به‌ویژه در‌زمینه مسیر عفونت ویروس لوسمی T انسانی ۱ (cfa05166) اهمیت دارند. این مسیر که شامل ۲۱۷ ژن است، پیچیدگی پاسخ‌های ایمنی و فرآیندهای التهابی را نشان می‌دهد. از میان این ژن‌ها، ۱۵ ژن به‌عنوان ژن‌های مهم شناسایی شدند که نشان‌دهنده نقش بالقوه آن‌ها در پاتوژنز CIE است.

مقایسه نتایج مطالعه حاضر با مطالعات پیشین نشان داد الگوی بیان ژن‌های التهابی و ایمونولوژیک در سگ‌های مبتلا به CIE از تشابه قابل‌توجهی با مکانیسم‌های گزارش‌شده در بیماری‌های آلرژیک و التهابی برخوردار است. در ادامه به مهم‌ترین جنبه‌های این مقایسه اشاره می‌شود: یافته‌های مطالعه حاضر نشان داد بیان ژن‌های مرتبط با پاسخ اینترفرون ـ گاما (مانند CXCL9،CXCL10  وSTAT1) به‌طور معنی‌داری افزایش یافته است. این الگو مشابه یافته‌های مطالعات در بیماران مبتلا به بیماری‌های التهابی روده (IBD) و آلرژی‌های غذایی است (13).

این یافته‌ها به‌ویژه در مورد عفونت پاروویروس، که یک پاتوژن شایع ویروسی در سگ‌ها است و آسیب شدیدی به دستگاه گوارش وارد می‌کند، معنی‎دار می‌باشند. پاروویروس با تحریک پاسخ‌های ایمنی و التهابی شدید، احتمالاً از طریق مسیرهای مولکولی مشترک با CIE، به آسیب بافتی منجر می‌شود (15). برای نمونه، مطالعهSampath  و همکاران در سال ۲۰۲۱ نشان داد که فعال‌شدن مسیرهای وابسته به اینترفرون-گاما در بیماران مبتلا به آلرژی غذایی نیز در ایجاد التهاب موضعی و سیستمیک نقش کلیدی دارد. این اشتراک در مکانیسم‌های التهابی می‌تواند دلیل بروز علائم مشابه در این دو بیماری باشد (10).

مطالعه حاضر نشان داد کاهش بیان ژن NRP1 ممکن است به اختلال در عملکرد لنفوسیت‌ها و افزایش التهاب منجر شود. این یافته با مطالعات قبلی محققین همسو است که نشان دادند عفونت‌های قارچی و باکتریایی در سگ‌ها می‌توانند با ایجاد اختلال در عملکرد لنفوسیت‌ها و کاهش بیان ژن‌های تنظیم‌کننده تحمل ایمنی، به افزایش حساسیت به آلرژی‌های غذایی و محیطی منجر شوند (16). همچنین، مطالعه Loh و  Tangدر سال 2018 به نقش محور روده در ایجاد آلرژی‌های غذایی اشاره کرده و نشان داد اختلال در عملکرد لایه موکوس روده می‌تواند به حساسیت غذایی از‌طریق مسیرهای التهابی منجر شود (17).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد عوامل محیطی می‌توانند از‌طریق تغییرات اپی‌ژنتیک بر بیان ژن‌های مرتبط با سیستم ایمنی تأثیر بگذارند. این نتایج با مطالعه Sampath و همکاران در سال 2021 همخوانی دارد که گزارش کردند تغییرات اپی‌ژنتیک ناشی از عوامل محیطی (مانند رژیم غذایی، آلاینده‌ها و میکروبیوم روده) می‌تواند به افزایش میزان شیوع آلرژی‌های غذایی منجر شود (10). همچنین، مطالعه Abrams و همکاران در سال 2021 نشان داد تغییرات اپی‌ژنتیک در ژن‌های مرتبط با سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی می‌تواند زمینه‌ساز توسعه بیماری‌های آلرژیک باشد (18).

مطالعه حاضر نشان داد تغییرات در میکروبیوم روده می‌تواند بر بیان ژن‌های مرتبط با پاسخ ایمنی تأثیر بگذارد. این یافته با مطالعه Brough و همکاران در سال 2020 همسو است که گزارش کردند تغییرات در ترکیب میکروبیوم روده می‌تواند به اختلال در تحمل ایمونولوژیک و افزایش خطر ابتلا به آلرژی‌های غذایی منجر شود (19). همچنین مطالعه Perkin و همکاران در سال 2016 نشان داد تغییرات میکروبیوم روده ناشی از مصرف پروبیوتیک‌ها می‌تواند به پیشگیری از آلرژی‌های غذایی کمک کند (20).

یافته‌های مطالعه حاضر می‌تواند در بررسی دقیق پیشگیری و درمان بیماری‌های التهابی و آلرژیک نقش مهمی داشته باشد. به‌عنوان مثال، شناسایی ژن‌های کلیدی درگیر در پاتوژنز بیماری می‌تواند به توسعه راهکارهای درمانی هدفمند (مانند ایمونوتراپی) منجر شود. این نتایج با مطالعه Santos و همکاران در سال 2023 همسو است که نشان دادند ایمونوتراپی مبتنی بر آنالیز ژن‌های خاص می‌تواند به تحمل ایمونولوژیک در بیماران مبتلا به آلرژی‌های غذایی کمک کند (21). همچنین مطالعه Du Toit و همکاران در سال 2015 نشان داد مداخلات زودهنگام، مانند معرفی زودهنگام آلرژن‌های غذایی می‌تواند به پیشگیری از توسعه آلرژی‌های غذایی کمک کند (22). اگرچه نتایج مطالعه حاضر شباهت‌های قابل‌توجهی با مطالعات آلرژی در انسان نشان می‌دهد، اما تفاوت‌های گونه‌ای بین سگ و انسان می‌تواند کاربرد این یافته‌ها را محدود کند. به‌عنوان مثال، برخی از ژن‌های شناسایی‌شده در سگ ممکن است آنالوگ مستقیمی در انسان نداشته باشند. همچنین مطالعه حاضر بر روی نمونه‌های بافتی متمرکز بود و ارزیابی پاسخ‌های عملکردی سیستم ایمنی نیاز به مطالعات بیشتر دارد. این محدودیت‌ها مشابه محدودیت‌های گزارش‌شده در مطالعات انسانی است.

تفسیر نتایج مطالعه حاضر باید با در نظر گرفتن یک ملاحظه روش‌شناختی مهم صورت گیرد؛ نمونه‌های بافتی مورد‌بررسی در پژوهش حاضر، به‌طور انحصاری از سگ‌های مبتلا به عفونت حاد پاروویروس (Canine Parvovirus‌Infection) اخذ شده‌اند. پاروویروس سگ، به‌عنوان یک پاتوژن ویروسی با تروپیسم مشخص برای سلول‌های اپیتلیال روده در حال تکثیر، یک اثر ایمونوپاتولوژیک کاملاً ویژه و مختص به خود را ایجاد می‌کند. در‌نتیجه الگوی بیان ژن مشاهده‌شده در مطالعه حاضر، عمدتاً و به‌طور اجتناب‌ناپذیری بازتاب‌دهنده‌ پاسخ ایمنی‌التهابی میزبان به این ویروس خاص است. اگرچه به‌طور نظری، اشتراکاتی در برخی از مسیرهای التهابی پایه بین بیماری‌های مختلف روده محتمل است، اما تعمیم مستقیم و بدون قید‌و‌شرط این نتایج به مکانیسم‌های بیماری‌زایی سایر اشکال بیماری التهابی روده (IBD) که اتیولوژی‌های کاملاً متفاوت و اغلب چندعاملی دارند (مانند موارد با پایه خودایمنی یا ایدیوپاتیک)، قابل‌توجیه نیست؛ بنابراین تمرکز اصلی و ارزش بنیادی این تحلیل، در شناسایی ژن‌های کاندید کلیدی و تبیین نقش بالقوه‌ی آن‌ها در آبشاری از وقایع ایمونولوژیک است که به‌طور خاص در طول چرخه عفونت پاروویروس رخ می‌دهد. برای مثال، ژن‌هایی که در مطالعه حاضر تفاوت بیان معنی‌داری نشان دادند، عمدتاً در مسیرهایی، مانند پاسخ به ویروس، آپوپتوز و التهاب نوتروفیلی دخیل می‌باشند که مستقیماً با پاتوژنز پاروویروس مرتبط می‌باشند. بدیهی است مطالعات آینده‌نگر گسترده‌تری که شامل نمونه‌هایی از حیوانات مبتلا به انواع مختلف و تعریف‌شده‌ IBD باشند، برای تمایز بین نشانگرهای زیستی کلی در التهاب روده و نشانگرهای اختصاصی مرتبط با اتیولوژی‌های خاص، ضروری خواهد بود.

بررسی‌ها نشان داد التهاب مزمن روده در سگ‌های مبتلا به CIE با تخریب پرزهای روده، کاهش یکپارچگی سد مخاطی و اختلال در پاسخ ایمنی تنظیمی همراه است. به‌ویژه کاهش بیان ژن‌های کلیدی مانند NRP1 و اختلال در عملکرد لنفوسیت‌ها نقش مهمی در تداوم التهاب دارد.

علاوه‌بر‌این مشخص شده است پاروویروس با اتصال به گیرنده‌های ترانسفرین روی سلول‌های در حال تقسیم سریع (مانند اپیتلیوم روده) باعث تخریب کریپت‌های روده‌ای، آتروفی پرزها و مرگ سلولی می‌شود. این آسیب‌ها به اسهال خونریزی‌دهنده و اختلال در جذب مواد مغذی منجر می‌گردد؛ بنابراین هر دو شرایط CIE و CPV باعث تخریب ساختار روده می‌شوند، اما مکانیسم‌های متفاوتی دارند‌. CIE یک التهاب ایمونو‌محور با اختلال در تنظیم ایمنی است، در‌حالی‌کهCPV  یک عفونت ویروسی مستقیم با تخریب سلولی است(23).

در مطالعه حاضر مشخص شد افزایش بیان ژن‌های پیش‌التهابی مانند CXCL9 و CXCL10 و کاهش عملکرد لنفوسیت‌ها به فعالیت غیرطبیعی سیستم ایمنی و التهاب مزمن منجر می‌شود. Kalli و همکاران در سال 2010 نشان دادند عفونت CPV باعث کاهش لنفوسیت‌ها (لنفوپنی) و تضعیف ایمنی سلولی می‌شود که احتمال عفونت‌های ثانویه را افزایش می‌دهد (24). درنتیجه در ‌CIE، سیستم ایمنی بیش‌فعال و فاقد تنظیم مناسب است. در‌حالی‌که در ‌CPV، سیستم ایمنی تضعیف می‌شود.

تغییرات در بیان ژن‌های تنظیم‌کننده ایمنی در CIE مانند  NRP1و‌EGR2  ممکن است تحت تأثیر عوامل ژنتیکی و اپی‌ژنتیک باشد. Nandi  و Kumar  در سال 2010 نشان دادند برخی نژادهای سگ (مانند دوبرمن) حساسیت بیشتری به CPV  نشان می‌دهند که نشان‌دهنده پایه ژنتیکی برای حساسیت به عفونت است (25). در‌نتیجه در هر دو حالت ممکن است حیوان بیمار تحت تأثیر عوامل ژنتیکی قرار گرفته باشد، اما در CIE تمرکز بر تنظیم ایمنی است. در‌حالی‌که در CPV تمرکز بر حساسیت به عفونت ویروسی است.

پاروویروس و CIE ممکن است از مسیرهای التهابی مشترکی عمل کنند، زیرا افزایش بیان EGR2 و NFATC4 در CIE نشان می‌دهد که این ژن‌ها در التهاب ناشی از عفونت‌های ویروسی مانند پاروویروس نیز نقش دارند. به‌طور مشابه، کاهش بیان CSF2 و  ETS2  ممکن است نشان‌دهنده یک پاسخ التهابی کاهش‌یافته باشد که به‌طور بالقوه ارتباط بین اختلال ایمنی ناشی از پاروویروس و التهاب مزمن در CIE را نشان می‌دهد. همچنین درگیری مسیر عفونت ویروس لوسمی T انسانی ۱ به‌طور‌کلی نشان می‌دهد تعاملات ویروسی، مانند آنچه در عفونت پاروویروس دیده می‌شود، می‌تواند به پاتوژنز CIE با مختل کردن هموستاز ایمنی کمک کند (26). با بررسی پروفایل‌های بیان ژنی در انتروپاتی‌های التهابی مزمن سگ‌ها، مطالعات transcriptomics ژن‌های کلیدی متعددی را شناسایی کرده‌اند که در تنظیم پاسخ ایمنی و التهاب روده نقش محوری ایفا می‌کنند. در‌زمینه انتریت ناشی از پاروویروس که با التهاب حاد و تخریب گسترده مخاط روده همراه است، تجزیه‌و‌تحلیل ژن‌های متفاوت بیان‌شده  نشان می‌دهد ژن‌هایی، مانند NRP1 (Neuropilin-1)، EGR2 (Early Growth Response 2) و NFATC4 (Nuclear Factor of Activated T-Cells 4) به‌طور معنی‌داری تنظیم‌شده‌اند.

به نظر می‌رسد NRP1 با تعدیل سیگنالینگ سیتوکین‌های پیش‌التهابی و فاکتورهای رشد اندوتلیال عروقی (VEGF)، موجب افزایش نفوذپذیری عروقی و نشت لوکوسیت‌ها به بافت روده می‌شود که این امر به تشدید آسیب بافتی منجر می‌گردد. هم‌زمان، فاکتور رونویسی EGR2، که به‌سرعت در پاسخ به استرس و محرک‌های التهابی القا می‌شود، با تنظیم تمایز و فعال‌سازی لنفوسیت‌های T و ماکروفاژها، تولید سیتوکین‌هایی، مانند TNF-α و IL-6 را افزایش داده و پاسخ التهابی را تشدید می‌کند. ازسوی‌دیگر، NFATC4 به‌عنوان یک عامل رونویسی وابسته به کلسیم، احتمالاً در هایپرتروفی و آپوپتوز سلول‌های اپیتلیال روده و تعدیل پاسخ ایمنی ذاتی نقش دارد. در‌مجموع، این ژن‌ها در یک شبکه مولکولی هماهنگ عمل می‌کنند که نتیجه آن تقویت آبشار التهابی و آسیب پاتولوژیک به مخاط روده در طی عفونت پاروویروسی است (27-29).

به‌طور مقایسه‌ای، مطالعات قبلی در‌مورد CIE عمدتاً بر‌اساس توالی‌یابی RNA کل یا تحلیل‌های بافت‌شناسی بوده‌اند که فاقد دقت لازم برای ضبط ناهمگونی سلولی می‌باشند. به‌عنوان مثال، Li  و همکاران در سال ۲۰۱2 از توالی‌یابی RNA کل برای مطالعه میکروبیوم روده و پاسخ ایمنی مخاطی در سگ‌های مبتلا به CIE استفاده کردند که در آن‌ها سیتوکین‌های التهابی شناسایی شدند، اما بینش‌های خاص سلولی را ارائه ندادند (30). به‌طور مشابه، Jergens  و همکاران در سال 2012 نقش‌های سیتوکین‌ها را در CIE با استفاده از آزمایش‌های چندگانه بررسی کردند، اما در این مطالعه درک تعاملات خاص سلولی محدود بودند (13). در مقابل، رویکرد scRNA-seq مطالعه حاضر درک دقیقی از بیان ژن در سطح تک‌سلولی ارائه می‌دهد و زیرجمعیت‌های خاص سلولی را که ممکن است نشان‌دهنده وضعیت پاتولوژی CIE باشند، نمایان می‌سازد.

غنی‌سازی ژن متفاوت بیان‌شده در مسیرهای مرتبط با ایمنی با یافته‌های سایر گونه‌ها، مانند انسان‌ها و موش‌ها، همخوانی دارد. به‌طوری‌که مسیرهای مشابهی در بیماری التهابی روده Inflammatory bowel disease (IBD) دخیل می‌باشند. به‌عنوان مثال، EGR1  و NFATC4 به‌عنوان تنظیم‌کننده‌های فعال‌سازی و تمایز سلول‌های T شناخته می‌شوند که به پاسخ‌های التهابی در CIE سگ‌ها و IBD انسانی کمک می‌کنند. این شباهت بین‌گونه‌ای نشان‌دهنده مکانیسم‌های حفظ‌شده اختلال ایمنی است و پتانسیل مدل‌های مقایسه‌ای را برای پیشبرد درک ما از این بیماری‌ها برجسته می‌کند (31).

نتیجه‌گیری نهایی: مطالعه حاضر با به‌کارگیری تجزیه‌وتحلیل scRNA-seq، اولین بررسی پروفایل جامع از بیماری التهابی روده (CIE) در سگ‌ها را ارائه می‌دهد. در مطالعه حاضر ۳۸۵ ژن متفاوت بیان‌شده شناسایی شده است که شامل تنظیم‌کننده‌های کلیدی التهاب و پاسخ ایمنی نظیر EGR2، SLC2A1 و NFATC4 می‌شوند. تجزیه‌وتحلیل غنی‌سازی مسیرها، فعال‌شدگی چشمگیر مسیرهای التهابی و ایمنی ذاتی مرتبط با پاتوژنز CIE را نشان داد. مطالعات آینده با درنظرگیری نمونه‌های بالینی متنوع‌تر، از‌جمله مبتلایان به انتروپاتی التهابی ایدیوپاتیک، آلرژی غذایی و بیماری التهابی روده (IBD) می‌تواند به شناسایی نشانگرهای زیستی دقیق‌تر و مکانیسم‌های مشترک پاتوژنز بین این اختلالات کمک شایانی کند. یافته‌های حاصل از مطالعه حاضر بینش دقیق دررابطه‌با مکانیزم مولکولی CIE ارائه می‌دهد و اهداف امیدوارکننده‌ای برای توسعه بیومارکرهای تشخیصی و درمان‌های هدفمند در آینده شناسایی می‌کند.

ملاحظات اخلاقی

مطالعه حاضر بر‌اساس قرارداد اصول اخلاقی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته (شماره: ۱۹0۶/۰۳/۷) انجام شد. کلیه پروتکل‌های مطالعه مطابق با دستورالعمل‌های بین‌المللی کار با حیوانات تنظیم و اجرا گردید. تأییدیه اخلاقی با شناسه IR.UT.KGUT.REC.1906.03 از کمیته اخلاق در پژوهش‌های دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان دریافت شد.

سپاسگزاری

نویسندگان از کلینیک دامپزشکی مهرگان کرمان برای فراهم‌آوری امکانات تشخیصی، بالینی و همکاری در جمع‌آوری نمونه‌ها صمیمانه تشکر می‌کنند.

تعارض منافع

هیچ گونه تعارض منافعی در ارتباط با این مطالعه وجود ندارد.