بررسی تغییرات پارامترهای کیندلینگ در مدل آزمایشگاهی صرع الکتریکی کلاسیک پس از ضربه مغزی

آسیب‌های ناشی از ضربات مغزی (Traumatic brain injury) یکی از مشکلات جدی پزشکی است که به رغم کارهای فراوان جهت افزایش ایمنی، هنوز سالیانه بیش از 2 میلیون نفر در جهان درگیر پیامدهای فوری و تأخیری ناشی از تروما هستند که هزینه زیادی را برای سیستم دارو و درمان کشورها ایجاد می‌کند (10). کشور ما ایران نیز از دو جنبه در این مسئله درگیر است. یکی بالا بودن آمار تصادف‌های جاده‌ای است که از این نظر جزو چند کشور اول در جهان است و شمار زیاد مصدومین آسیب‌های مغزی را بدنبال داشته است و دیگری شمار قابل توجه جانبازان آسیب مغزی ناشی از جنگ ایران و عراق می‌باشد. صرع با شیوع جهانی 1درصد سومین نارسائی شایع نورولوژیک بعد از سکته مغزى و بیماری آلزایمر است و تروما مسئول 20درصد صرع‌های علامتی (symptomatic epilepsy) است.(10)  در آمریکا و اروپا بیش از نیم میلیون نفر مبتلا به صرع ناشی از تروما هستند. استراتژی فعلی در درمان صرع، دارو درمانی علامتی است. داروهای موجود ضد صرع شمار حملات را کاهش  می‌دهند بدون این که عامل ایجاد صرع را تحت تأثیر قرار دهند. علاوه بر این 30درصد بیماران مصروع به هیچ نوع درمان دارویی پاسخ نمی‌دهند و به اصطلاح دچار مقاومت دارویی می‌شوند. به رغم پژوهش‌های گسترده‌ای که در زمینه صرع صورت گرفته، هنوز پاتوفیزیولوژی آن به خوبی شناخته شده نیست. یکی از پیامدهای آسیب‌های مغزی، ابتلا به بیماری صرع (Post Traumatic Epilepsy; PTE) می‌باشد (10). آسیب مغزى ناشی از ضربه و ایسکمى از عوامل خطر شناخته شده در ایجاد این بیمارى هستند. به دنبال ضربه مغزی سیستم ایمنی فعال می‌شود و با ایجاد آماس عصبی علاوه بر صدمات جبران ناپذیر بر سیستم عصبی، شکل پذیری سیناپسهای مغزی (Neuronal plasticity) بطور برگشت ناپذیر تغییر می‌یابد و این امر زمینه ابتلا به صرع را فراهم می‌کند(9) .

مطالعات قبلی نشان دادند که ایجاد تروما به روش CCI  در موش صحرایی در دو مدل کیندلیگ شیمیایی و الکتریکی از نوع سریع سبب آسان شدن فرآیند صرعی شدن می‌شود (3). با توجه به پژوهش‌های بالا در این مطالعه از کیندلینگ الکتریکی کلاسیک استفاده شد به این ترتیب که روزانه یک تحریک تا مرحله صرعی شدن کامل داده شد اما در کیندلینگ الکتریکی سریع  هر روز 12 تحریک با فاصله زمانی 5 دقیقه داده می‌شود. در مدل کیندلیگ شیمیایی نیز با تزریق داخل صفاقی پنتیلن تترازول صرع ایجاد می‌کنند. با توجه به اینکه اثر تروما بر کیندلینگ الکتریکی کلاسیک که بیشتر شبیه به مدل‌های انسانی است تا کنون بررسی نشده است لذا هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر تشنجات الکتریکی بر پارامترهای کیندلینگ کلاسیک بعد از دریافت ضربه و ایجاد آسیب بود.

مواد و روش کار

حیوانات: در این مطالعه از 24 سر موش صحرایی نر  بالغ  270 گرمی  Wistar که در 3 گروه 8 تایی پرورش یافته انستیتو پاستور ایران استفاده شد.     

جراحی و کاشت الکترود در مغز موش: موش‌ها با تزریق داخل صفاقی مخلوطی از کتامین (mg/kg 60) و زایلاین (mg/kg 10) بیهوش شدند و سپس بر روی دستگاه استریوتاکس ثابت گردیدند. سطح استخوان جمجمه را از بافت‌های اضافی جدا می‌شد تا نقطه برگما و لامبدا به صورت آشکار دیده شود. در سطح جمجمه بوسیله مته دندانپزشکی در سه نقطه سوراخ ایجاد شد، در یکی از آن‌ها یک الکترود تک قطبی و در دو سوراخ باقی مانده دو عدد پیچ عینک قرار داده می‌شود سپس یک الکترود سه قطبی در هسته قاعده ای- جانبی آمیگدال (بر اساس مختصات اطلس پاکسینوس: AP:2.5، L:4.8،V: 7.4 ) قرار داده شد (8). پس از آن محل الکترودها و پیچ‌ها در سطح جمجمه با اکریل دندانپزشکی محکم می‌شد. حیوان به محیط پاکیزه و گرم منتقل شد تا به هوش آید. تمامی آزمایشات مطابق با کتاب راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد  و کلیه روش‌ها مورد تایید کمیته اخلاق تحقیق موسسه تحقیقاتی پاستور بوده است (National Institutes of Health Publication No.80-23, revised 1996).

ایجاد ترومای مغزی: موش‌ها با تزریق داخل صفاقی مخلوطی از کتامین (mg/kg 60) و زایلاین (mg/kg 10) بیهوش شدند. حیوان در استریوتاکس فیکس شده و قطعه‌ای از جمجمه به قطر mm 5 در ناحیه آهیانه بریده و برداشته شد. تروما توسط مدل CCI با مشخصات: سرعت ضربه m/sec 150، فشار وارده بر بالای پیستون psi130، فشار وارده بر پایین پیستون psi20، سرعت حرکت پیستون m/sec 5/4 و مدت زمان ضربه msec 150 (شرایط بهینه‌ای که موجب ایجاد ضایعه‌ای به قطرmm 2 در سطح کورتکس می‌گردد) به سطح کورتکس مغز حیوانات اعمال شد(4). سپس قطعه جدا شده جمجمه در محل اولیه خود گذاشته شده و با کمک اکریل دندانپزشکی در جای خود محکم شد. بعد حیوانات به اتاق ریکاوری منتقل شدند.

تحریک الکتریکی حیوانات جراحی شده: به این منظور هسته قاعده‌ای- جانبی آمیگدال با استفاده از جریان الکتریکی با مشخصات موج مربعی تک فازی، با تواتر 50Hz ، پهنای هر موج 1ms و شدت جریان 50µA و مدت زمان تحریک دو ثانیه تحریک شد. وقتیکه شدت جریان اعمال شده برای تحریک نورونهای موجود در آمیگدال کافی بود، این نورونها بطور همزمان شروع به تولید پتانسیل عمل می‌نمودند که این پتانسیلهای عمل بصورت تخلیه‌های پیاپی بوسیله نرم افزار کامپیوتری ثبت می‌شدند. در صورت دیده نشدن امواج تخلیه متعاقب هر 5 دقیقه یکبار 50µA بر شدت جریان قبلی افزوده شده و این عمل تا زمانیکه امواج تخلیه متعاقب به مدت حداقل پنج ثانیه مشاهده شود تکرار می‌شد. این شدت جریان بعنوان شدت جریان آستانه در نظر گرفته شد. سپس تحریکات الکتریکی با شدت آستانه هر 24 ساعت یکبار به حیوانات اعمال شد تا زمانیکه حیوان در 3 بار تحریک متوالی مرحله 5 تشنج (تشنجات فراگیر) را  نشان می‌داد. در این حالت حیوان بطور برگشت ناپذیر صرعی و در اصطلاح کیندل شده بود (7). رفتارهای تشنجی بر اساس تقسیم بندی Racine به 5 مرحله تقسیم می‌شوند: 1) حرکات دهان و صورت، 2) تکان دادن سر به طرف بالا و پایین، 3) کلونوس اندام 4) ایستادن روی دو پای عقبی همراه با کلونوس دو اندام جلویی، 5) ایستادن روی دو پا و از دست دادن تعادل(11).

گروه‌های آزمایشی(گروه کنترل): شش روز پس از کاشت الکترود تحریکات کیندلینگ در موش‌ها شروع شد و تا زمانی که 3 بار مرحله 5 را نشان دهند ادامه می‌یافت.

گروه تروما: پنج روز پس از کاشت الکترود ، موش‌ها تحت ترومای مغزی قرار گرفتند. 24 ساعت پس از اعمال تروما آستانه تحریک موش‌ها تعیین و تحریکات کیندلینگ در موش‌ها شروع شد و تا زمانی که 3 بار مرحله 5 را نشان دادند ادامه داشت.

گروه شم: تمام شرایط گروه تروما رعایت شد با این تفاوت که تروما به موش‌ها اعمال نشد و فقط قطعه جمجمه بریده شده و دوباره با اکریل دندانپزشکی در جای خود محکم شد.

بافت شناسی: موش‌ها با اتر تحت بیهوشی قرار گرفتند. مغزها از جمجمه بیرون آورده شده و رنگ آمیزی2,3, 5- triphenyl tetrazolium chlorid (TTC; Sigma-Aldrich, Canada)  انجام شد. در برش‌های مرگ سلولی و محل درست الکترود در نمونه‌ها بررسی شد. داده‌های بدست آمده از موش‌هایی که در آن‌ها الکترود در محل درست نبود از نتایج حذف شد.

آنالیز آماری: برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از آنالیز واریانس یکطرفه ( NOVA) و تست تکمیلیTurkey-Kramer  استفاده شد. 0.05 >Pملاک معنی‌دار بودن تفاوت بین میانگین داده‌ها در گروه تست و کنترل بود.

نتایج

رنگ آمیزی TTC  آسیبی به عمقml  0.5±2 از سطح سخت شامه نشان داد (تصویر 1). همچنین ضربه مدل CCI  سبب آسان شدن در صرعی شدن در مدل کیندلینگ الکتریکی کلاسیک شد بطوریکه در گروه شاهد و شم موش‌ها بطور میانگین بعد از 14 تحریک صرعی شدند. شمار تحریکات الکتریکی لازم برای صرعی شدن  در موش‌های دچار تروما بطور معنی‌داری کاهش یافت (5 تحریک) (میانگین 13.6667در گروه کنترل، میانگین 12.6667 ثانیه در گروه شم و میانگین 5.16667 ثانیه در گروه تروما) (42.28 = (2،17) F، 0.001>P)(نمودار 1).

علاوه بر این نتایج بدست آمده از اثر تروما بر پارامترهای کیندلینگ الکتریکی کلاسیک نشان داد که امواج متعاقب تخلیه در مرحله 5 کیندلینگ (ADD5)  در گروه تروما بیشتر از گروه‌های کنترل و شم بود (میانگین 76.1667در گروه کنترل، میانگین 81.1667 ثانیه در گروه شم و میانگین 112 ثانیه در گروه تروما) (125/3 = (2،17) F، 0.001>P)(نمودار 2). همچنین امواج متعاقب تخلیه در مرحله 3 کیندلینگ (ADD3)  در گروه تروما بیشتر از گروه‌های کنترل و شم بود (میانگین   11.5 در گروه کنترل، میانگین 13.3333 ثانیه در گروه شم و میانگین 29.8333 ثانیه در گروه تروما)(94/42 = (2،17) F، 0.001>P) (نمودار 3). طول دوره ی مرحله پنجم تشنج (S5D)در گروه تروما بیشتر از گروه‌های کنترل و شم بود (میانگین 29.1667 در گروه کنترل، میانگین 31.1667 ثانیه در گروه شم و میانگین 46.3333 ثانیه در گروه تروما) ( 23/53= (2،17) F، 0.001>P)(نمودار 4)، همچنین طول دوره ی تشنج (SD) در گروه تروما بیشتر از گروه‌های کنترل و شم بود (میانگین 85.665  در گروه کنترل، میانگین 90.333 ثانیه در گروه شم و میانگین 123.333 ثانیه در گروه تروما) (83/54 = (2،17) F، 0.001>P) (نمودار 5). آستانه تحریک در گروه تروما کمتر از گروه‌های کنترل و شم بود (میانگین  450 در گروه کنترل، میانگین416.667ثانیه در گروه شم و میانگین 133.333 ثانیه در گروه تروما) (86/13 = (2،17) F، 0.001>P) 0.001 (نمودار 6).

بحث

  هدف از این مطالعه بررسی تغییرات پارامترهای کیندلینگ در مدل آزمایشگاهی صرع الکتریکی کلاسیک متعاقب ترومای مغزی بود. بر اساس نتایج گفته شده در گروه شاهد و شم موش‌ها بطور میانگین بعد از 14 تحریک صرعی شدند. تعداد تحریکات الکتریکی لازم برای صرعی شدن موش‌ها در موش‌های دچار تروما بطور معنی‌داری کاهش یافت (5 تحریک)، همچنین امواج متعاقب تخلیه در مرحله  5(ADD5)، در مرحله 3 (ADD3)،  طول دوره مرحله پنجم تشنج (S5D)  و طول دوره تشنج (SD)  در گروه شم تغییر معنی‌داری با گروه کنترل نداشت  ولی در گروه تروما بیشتر از گروه کنترل شد. در گروه شاهد و شم آستانه  تحریکات در حد µA 200 تا 500 بود ولی در موش‌های دچار تروما شدت تحریکات در حد µA 100  تا 200 بود.

این نتایج نشان داد که تغییرات آناتومیک وفیزیولوژیک همراه با TBIدر سیستم لیمبیک، در پیشرفت صرع بدنبال ضربه مغزی شرکت دارد. بنابر این می‌توان نتیجه گرفت که آسیب به مغز موجب افزایش صرع زائی درسیستم لیمبیک می‌شود. از آنجایی که در روزهای اول کیندلینگ چون تحریک فقط به هسته آمیگدال سیستم لیمبیک داده می‌شود ایجاد صرع بصورت موضعی و بصورت جزیی است ولی با پیشروی روزها، هسته‌های اطراف از جمله هسته‌های حرکتی را درگیر میکند (5،6). حدس ما برای افزایش یافتن پارامترهای کیندلینگ پس از ضربه این است که  متعاقب ضربه مغزی سیستم ایمنی فعال می‌شود (1)  و شکل پذیری سیناپسهای مغزی (Neuronal plasticity) بطور برگشت ناپذیر تغییر می‌دهد و آستانه تحریک نورون‌ها کاهش می‌یابد (10) و زودتر از نورون‌های موش‌های غیرترومایی دچار Firing می‌شوند. و به همین دلیل موش‌های ترومایی زودتر صرعی می‌شوند و در نتیجه آستانه تحریک در موش‌های ترومایی پایین تر از موش‌های غیرترومایی شده است.

همچنین احتمال می‌رود که بخشی از این اثر تسهیلی ناشی از فرایندهای آماسی و آزادسازی سایتوکاینهای التهابی IL1-beta و  TNF-alpha ناشی از تروما می‌باشد. این فرایند التهابی به نوبه خود موجب آسیب عصبی، مرگ سلولی و تغییرات سیناپسی می‌گردد که نتیجه نهایی آن تسهیل اکتساب صرع می‌باشد(5).

همانند یافته‌های این پژوهش، Eslami و همکاران در سال 2015 نشان دادند که تروما با مدل CCI  بر موش صحرایی در دو مدل کیندلیگ شامل کیندلینگ شیمیایی و کیندلینگ الکتریکی از نوع Rapid باعث تسهیل در فرآیند صرعی شدن می‌شود (3).

در تحقیقی که بوسیله .DA Coulterو همکارانش در سال 1995 انجام شد مشخص گردید که ارتباط زیادی بین ضربه به سر و پیشرفت صرع در لوب تمپورال وجود دارد.دراین آزمایش از روشFluid Percussion Injury برای ایجاد تروما استفاده شد .القا صرع بوسیله پیلوکارپین و بصورت invitro انجام شد. تغییرات کمی و کیفی ایجاد شده در ناحیه لیمبیک مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادکه تغییرات آناتومیک وفیزیولوژیک همراه با TBIدر سیستم لیمبیک، در پیشرفت صرع بدنبال ضربه مغزی شرکت دارد. بنابر این نتیجه گرفته شد آسیب به مغز موجب افزایش اپی لپتوژنز درسیستم لیمبیک می‌شود (2).

برخلاف یافته‌های ما  Hunt و همکاران بیان نمودند که تروما با مدل FPI  سرعت صرعی شدن را در مدل کیندلینگ شیمیایی تغییر نمی‌دهد. به نظر می‌رسید شدت تروما با مدل FPI آنقدر کافی نبود که بتواند در گروه تروما صرع را تسهیل کند (4). 

براساس نتایج بدست امده از این مطالعه تروما روند اکتساب صرع در مدل صرعی کیندلینگ الکتریکی کلاسیک را تسریع می‌کند. و همینطور باعث افزایش در پارمترهای کیندلینگ مانند امواج متعاقب تخلیه در مرحله  5(ADD5)، در مرحله 3 (ADD3)، طول دوره مرحله پنجم تشنج (S5D)  و طول دوره تشنج (SD) در گروه تروما نسبت به گروه کنترل و شم شد. و همینطور کاهش آستانه تحریک در گروه تروما نسبت به گروه کنترل و شم شد.

این مطالعه نشان داد که تروما باعث تغییراتی در پارامترهای کیندلینگ می‌شود. برای مشخص شدن مکانیسم دقیق اثر تروما بر پارامترهای کیندلینگ نیاز به مطالعات بیشتری از جمله مطالعات مولکولی است.

تشکر و قدردانی

از همکاری انستیتو پاستور ایران و همچنین معاونت پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران که حمایت‌های مالی انجام طرح را عهده دار شدند، تشکر و قدردانی می‌شود.

تعارض در منافع

بین نویسندگان  هیچ گونه تعارض در منافع  گزارش نشده است