در سال­های اخیر، نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در مقایسه با ذرات میکرونی، به­دلیل فعالیت کاتالیزوری قوی­تر به­طور گسترده در محصولات صنعتی و مصرفی استفاده‌شده است. این افزایش فعالیت کاتالیزوری به اندازة کوچک­تر این نانوذرات (افزایش نسبت سطح به حجم) نسبت داده‌شده است (9). این خواص نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم به­دلیل فعالیت زیستی و ایجاد چالش برای سلامت انسان­ها، نگرانی­هایی را ایجاد کرده است (27). از 1628 محصول مصرفی در 30 کشور جهان که بر اساس فناوری نانو تولیدشده‌اند، برای تولید 179 محصول (تقریباً 11 درصد کل محصول) از نانوذرات تیتانیوم ازجمله دی­اکسید تیتانیوم (TiO₂) استفاده‌شده است (13). در حال حاضر نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در انواع محصولات مانند کرم­های ضدآفتاب و دیگر لوازم‌آرایشی، پوشش و رنگ­های ویژه (27) و در فرآیندهای فتوکاتالیستی صنعتی و تولید شیشه­های خود تمیز شونده (23) استفاده می­شود.  

رشد سریع تعداد مطالعه­ها در این زمینه تأیید می­کنـد که نگرانـی زیادی در زمینة ایمنی و بی­خطری نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم وجود دارد. در این زمینه، حیوانات مدل گوناگونی با روش‌های مختلف مواجهه مورد آزمایش قرارگرفته‌اند (9). همة این مطالعه­ها نشان داده­اند که نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم از دی­اکسید تیتانیوم میکرونی سمی­ترند (17،25). استفادة وسیع از نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم احتمال قرارگرفتن انسان­ها در معرض این نانومواد و رهایش آن‌ها به محیط‌زیست را افزایش داده است که می­تواند خطر بالقوه برای سلامتی انسان­ها، حیوانات و اکوسیستم باشد (25). بسیاری از مطالعه­ها در زمینه سمیت حاد نشان داده­اند که نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم سمیت کمی برای موجودات زنده آبزی دارند یا برای آن‌ها بی­خطرند (7)، اما مطالعه­های اخیر بیانگر آن است که نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم می­تواند اثر نامطلوبی بر موجودات آبزی داشته باشد. برای مثال، این یافته­ها نشان می­دهند که مواجهه با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم سبب تغییر در بیان برخی از ژن­های ماهی گورخری (5)، مرگ دافنی ماگنا (18)، نارسایی تنفسی و سایش اپیتلیوم روده و تنش اکسیداتیو در قزل­آلای رنگین­کمان (10) شده است. بنابراین، افزایش استفاده از نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در کالاهای مختلف و استفاده احتمالی آن‌ها در صنایع شیلاتی، بررسی آثار این نانوذرات بر آبزیان را ضروری کرده است، ازاین‌رو، در این پژوهش با استفاده از نشانگرهای زیستی هیستوپاتولوژیکی آثار نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در سمیت حاد بر بافت­های آبشش، کبد و رودة ماهی آزاد دریای خزر به­عنوان گونة در معرض خطر و یکی از گزینه­های اصلی برای تنوع‌بخشی به ماهیان سردابی پرورشی کشور، موردبررسی قرارگرفته است.

مواد و روش‌کار

ویژگی­های نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم آناتاز: نانوذرات پودری دی‌اکسید تیتانیوم آناتاز (CAS number= 13463-67-7) محصول شرکت Us-nano آمریکا از شرکت پیشگامان نانو مواد ایرانیان خریداری شد. بنا بر اطلاعات شرکت سازنده، مشخصات نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم آناتاز به این شرح می‌باشد: خلوص 99 درصد، متوسط اندازه 10-15 نانومتر، مساحت سطح ویژه 200-240 مترمربع در گرم، رنگ سفید، دانسیته توده 24/0 گرم در سانتی‌متر مکعب و دانسیته واقعی 9/3 گرم در سانتی‌متر مکعب.

بررسی اثر سمیت حاد نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم گونة ماهی: بچه ماهیان آزاد دریای خزر (Salmo caspius) برای این آزمایش با میانگین وزن 3/4±46/27 گرم از مرکز بازسازی ذخایر آزادماهیان شهید باهنر کلاردشت تهیه شدند.

شرایط اجرای آزمایش: بچه ماهیان در دانشکدة علوم دریایی دانشگاه تربیت مدرس به مدت یک هفته با شرایط آزمایشگاهی در مخازن آب شیرین (تانک­های 300 لیتر) سازگار و با غذای تجاری (بیومار) تغذیه شدند (1 درصد وزن بدن). سپس، به‌منظور جلوگیری از جذب نانوذرات به­وسیله مدفوع، 24 ساعت قبل از شروع آزمایش، غذادهی به ماهی­ها قطع شد (13). در طول دورة سازگاری تلفاتی در بین ماهیان مشاهده نشد. بعدازاین مدت ماهی­ها به­طور تصادفی به تانک­های آزمایش (100 لیتر) انتقال داده شدند. میزان تراکم ماهی­ها در هر تانک 100 لیتری حدود 7/2 گرم در لیتر بود (در هر تانک 7 ماهی). شاخص­های کیفی آب مانند PH، اکسیژن محلول، دما، سختی کل در طول آزمایش با استفاده از دستگاه دیجیتال (Lovibond water testing) اندازه­گیری شد. میانگین دما (درجه سانتی‌گراد)، pH، سختی (میلی‌گرم کربنات کلسیم) و اکسیژن محلول (درصد اشباع) به ترتیب 26/0±62/18، 08/0± 25/8، 34/6±246، 04/2±6/90 بود. آزمایش تحت شرایط نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی انجام شد. برای آزمایش از آب شهری کلرزدایی و هوادهی­شده استفاده شد.

غلظت­های 0، 01/0، 1/0، 1، 10 و 100 میلی‌گرم در لیتر انتخاب و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. آزمایش به مدت 4 روز (96 ساعت) تحت شرایط ساکن با تعویض آب و تجدید غلظت­ها انجام شد و آب مخازن مورد آزمایش هر 24 ساعت یک‌بار تعویض و غلظت­های نانوذرات موردمطالعه مجدداً در مخازن اضافه شد. در طول آزمایش برای جلوگیری از جذب نانوذرات به غذا و مدفوع ماهی­ها، غذادهی انجام نشد. ماهی­های گروه شاهد تحت شرایط یکسان با گروه­های آزمایشی قرار داشتند.

برای آزمایش هیستوپاتولوژی، در پایـان دوره از هـر تیـمـار 6 ماهی به­طور تصادفی برای نمونه­برداری از بافت آبشش، کبد و روده انتخاب شدند. ماهی­ها در پودر گل میخک (100 میلی‌گرم در لیتر) بی‌هوش شدند. به­منظور تثبیت نمونه­ها، بافت­ها بلافاصله به محلول بوئن انتقال داده شدند. برای انجام مطالعات بافت­شناسی ابتدا نمـونه­های بافتی از محلول بوئن خارج و به الکل 70 درصد انتقال داده شدند. سپس نمونه­های بافتی در دستگاه خودکار آماده‎سازی بافت (Tissue processor, DID SABZ DS 2080/H) آبگیری، شفاف­سازی و پارافینه شدند. در ادامه نمونه‌های قالب­گیری­شده با دستگاه میکروتوم (Accu-Cut SRM 200 Rotary Microtome) با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند. از هر نمونه 3 لام سریالی با کیفیت مناسب تهیه شد و رنگ­آمیزی لام­های حاصله به روش رایج هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. برش­های ایجادشده با چسب انتالان روی لام چسبانده شدند، سپس لام­های تهیه­شده با میکروسکوپ نوری (OPTIKA) مجهز به دوربین در بزرگ­نمایی­های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند. برای مطالعه آسیب­شناسی بافت آبشش در هر تیمار 500 تیغه ثانویه شمارش شد و تعداد تیغه ثانویه­ای که دچار آسیب شده بودند نسبت به تعداد کل تیغه ثانویه سنجیده شد. شدت تغییرات کمتر از 10 درصد، "بدون تغییر (-)"؛ شدت تغییرات بین 10 تا 30 درصد "تغییر ملایم (+)"؛ شدت تغییرات بین 31 تا 60 درصد "تغییر متوسط (++)" و شدت تغییرات بین 60 تا 100 درصد "تغییر شدید (+++)" در نظر گرفته شد. همچنین، برای تعیین آسیب­دیدگی روده و کبد در تیمارهای آزمایشی حالت­های غیرطبیعی ساختمان این دو اندام به­صورت کیفی در چهار سطح بدون تغییر (-)، تغییر ملایم (+)، تغییر متوسط (++) و تغییر شدید (+++) مورد بررسی قرار گرفتند (6،26).

در آزمایش سمیت حاد نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در مدت 96 ساعت، هیچ گونه تلفاتی در غلظت­های موردمطالعه مشاهده نشد. بر اساس دستورالعمل آزمون سمیت حاد ماهی­ها (20)، اگر در غلظت 100 میلی­گرم در لیتر در حداقل 7 ماهی، مرگ­و­میری مشاهده نشود با حدود اطمینان 99 درصد می­توان گفت که LC₅₀ آن ماده بیشتر از 100 میلی­گرم در لیتر است. بنابراین، در مطالعة حاضر LC₅₀ نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بیشتر از 100 میلی­گرم در لیتر خواهد بود.

تغییرات بافت­شناختی در بافت­های مورد آزمایش (آبشش، کبد و روده) ماهی آزاد دریای خزر در طول دورة سمیت حاد در جدول 1 خلاصه‌شده و این تغییرات در تصاویر 1 تا 3 نشان داده‌شده است.

بافت­شناسی طبیعی آبشش در ماهیان گروه شاهد در تصویر a1 نشان داده‌شده است که به­خوبی سلول­های کلراید، سلول ستونی (پیلار)، رشته­های آبششی و سلول­های اپیتلیالی با ساختار طبیعی قابل‌مشاهده‌اند. آبشش ماهیانی که در معرض دی­اکسید تیتانیوم قرارگرفته بودند به­طور وابسته به دوز دچار تغییرات بافت­شناختی شد. در بالاترین دوز نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم (100 میلی­گرم در لیتر)، تغییرات هیستوپاتولوژیکی آبشش شامل چماقی ­شکل ­شدن رأس تیغه آبششی، هایپرپلازی، کوتاهی تیغة ثانویه، هایپرتروفی، جوش­خوردگی تیغه آبششی، ادم (خیز) و جداشدگی اپیتلیالی بود (تصویر b,c1).

کبد گروه شاهد ساختار بافتی طبیعی را نشان داد (تصویر a2). مواجهة ماهیان با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم به میزان 1/0 میلی­گرم در لیتر به تجمع ملانوماکروفاژها، احتقان سینوزوئید و هستة پیکنوتیک پراکنده در سلول­های کبدی منجر شد. تجمع ملانوماکروفاژها، سلول­های کبدی با هستة پیکنوتیک و واکوئلاسیون در کبد ماهی آزاد دریای خزر قرارگرفته در معرض 1 میلی­گرم در لیتر نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم مشاهده شد. تغیـیـرات بافـت­شـناختی در ماهـیان قرارگرفته در معرض 10 و 100 میلی­گرم در لیتر نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم آشکارتر بود. این ضایعات شامل افزایش تجمع ملانوماکروفاژها، اتساع سینوزوئیدها و تجمع سلول­های خونی، سلول­های کبدی با هستة پیکنوتیک، واکوئلاسیون و کانون­های نکروزه بود (تصویر b,c2).

رودة ماهیان در گروه شاهد بافت­شناسی طبیعی را نشان داد (تصویر a3). تغییرات بافتی، مانند ضخیم­شدن لامینا پروپریا، واکوئلاسیون، جداشدگی اپیتلیال، فرسایش پرزهای روده و نکروز در رودة ماهیانی که در معرض نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم قرارگرفته بودند، مشاهده شد (تصویرb3).

بحث

در پژوهش حاضر، نتایج آزمون سمیت حاد نشان داد که نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم منتقل­شونده از آب به مدت 4 روز اثری بر بقای بچه­ماهی آزاد دریای خزر موردمطالعه نداشت. با در نظر گرفتن سطوح سمیت (12،13)، طبق نتایج پژوهش حاضر نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم "نسبتاً غیر سمی" (100<) محسوب می­شود.

آبشش ماهیان جزء اندام­­های مهم محسوب می­شود که وظایف مهمی، ازجمله تبادل گازهای تنفسی، دفع مواد زائد نیتروژنی، تنظیم اسید- باز و تنظیم فشار اسمزی بر عهده دارد (8) و درعین‌حال مکانی است که در معرض مستقیم آلودگی­های محیطی، ازجمله نانوذرات قرار دارد. بنابراین، آسیب جدی به آبشش می­تواند اختلال در وظایف این اندام حیاتی، ازجمله تبادل اکسیژن و دی‌اکسید کربن و تنظیم اسمزی ایجاد کند و درنتیجه به مرگ ماهیان منجر شود. نتایج مطالعه بافت­شناسی اثر کوتاه­مدت (حاد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر آبشش بچه ماهیان آزاد دریای خزر نشان داد که اگرچه در آزمون تلفات حاد مرگ­و­میری مشاهده نشد ولی در دوزهای متوسط و بالا تغییرات هیستوپاتولوژیکی آبشش شامل چماقی ­شکل ­شدن رأس تیغه آبششی، هایپرپلازی، کوتاهی تیغه ثانویه، هایپرتروفی، جوش­خوردگی تیغه آبششی، ادم و جداشدگی اپیتلیالی مشاهده شد. ضایعات دیده‌شده در پژوهش حاضر، مشابه ضایعاتی بود که در پژوهش­های معدود دیگر در زمینه اثر نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بر ماهیان، گزارش‌شده است. هایپرپلازی، آماس، چماغی­شدن رأس تیغه ثانویه، تلانژکتازی مویرگی، خـوردگی و چسبندگی (جوش­خوردگی) تیغة ثانویه و کوتاه­شدن تیغه آبششی در کپور (19)، هایپرتروفی سلول­های کلراید و دژنره­شدن سلول­های موکوسی (16) و خیز و ضخیم­شدن تیغه­ها و رشته­های آبششی در کپور معمولی (12) بعد از مواجهه ماهیان موردمطالعه با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم مشاهده‌شده است. هایپرپلازی و هایپرتروفی اپیتلیالی تیغة آبششی واکنش جبرانی برای کاهش ورود و جذب مواد سمی است (11). باوجود افزایش فاصله بین آب و خون در اثر این واکنش جبرانی و کاهش جذب مواد سمی، کاهش سطح تنفسی و درنتیجه اختلالات تنفسی ایجاد می­شود (22). با کوتاهی تیغة آبششی، تماس آبشش­ها با آب کاهش‌یافته و درنتیجه در میزان تبادل گازها و یون­ها اختلال ایجاد می‌شود (22). عدم تعادل اسمزی ناشی از نانوذرات احتمالاً موجب ادم و جداشدگی اپیتلیالی در تیغه ثانویه شده است (19). 

کبد یکی از مهم­ترین اندام­های بدن ماهی است که در فرایندهای سم­زدایی نقش دارد. هیستوپاتولوژی کبد ماهیان راهی سودمند برای مطالعه اثرات مواجهة حیوانات آبزی با سموم موجود در محیط آبی است (11). تغییرات بافتی مشاهده‌شده در بچه ماهیان آزاد دریای خزر قرارگرفته در معرض نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در آزمایش­های حاد شامل افزایش تجمع ملانوماکروفاژها، اتساع سینوزوئیدها و تجمع سلول­های خونی، سلول­های کبدی با هسته پیکنوتیک، واکوئلاسیون و کانون­های نکروزه بود. این ضایعات در دوزهای بالاتر مشهودتر بود. نقش مهم ماکروفاژها می­تواند جارو­کردن نانوذرات باشد (22،24). در پژوهش حاضر، واکوئلاسیون و هستة پیکنوتیک مهم­ترین تغییر هیستوپاتولوژیکی کبد بچه ماهیان آزاد دریای خزر تیمارشده با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بود. بروز هستة پیکنوتیک نشان­دهنده مراحل اولیه نکروز است (1). در پژوهش‌های متعددی نشان داده‌شده که گونه­های اکسیژن فعال (ROS) ناشی از نانوذرات نقش مهمی در ایجاد نکروز/ آپوپتوز سلول­ها دارند (برای مثال، 2،14). Mansouri و همکاران در سال 2016 (19) نشان دادند که قرارگرفتن کپور معمولی در معرض هم­زمان نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم و نانو اکسید مس باعث ناهنجاری­های بافتی در کبد ازجمله واکوئلاسیون، نکروز سلول­های کبدی، تجزیه هسته، اتساع و تجمع خون در سینوزوئید، پیگمنتاسیون و اجتماعات ملانوماکروفاژ شده است. واکوئلاسیون کبد نشان­دهندة عدم تعادل بین نرخ سنتز مواد در سلول­های پارانشیمی و نرخ آزادسازی این مواد به گردش خون سیستمیک است (21). اتساع سینوزوئیدهای کبدی احتمالاً برای حمل بیشتر مواد برای سم­زدایی و نشان دهندة افزایش جریان خون در بافت کبدی است و به‌عنوان سازوکار کمکی برای سم‌زدایی عمل می­کند. بنابراین، سینوزوئیدها به‌منظور تسهیل این جریان خون متسع می­شوند  (21). احتقان (تجمع خون) می­تواند مسئول دژنراسیون سلولی و نکروز کبد ماهی باشد. به‌طورکلی، ضایعات کبدی ممکن است ناشی از اثرات تجمع نانوذرات و آسیب اکسیداتیو باشد (30).

روده در تماس مستقیم با آلاینده­های موجود در آب بوده و مسیر احتمالی برای ورود بسیاری از نانومواد است (4). در پژوهش حاضر، تغییرات هیستوپاتولوژیکی روده در بچه ماهیان آزاد دریای خزر تیمارشده با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم شامل ضخیم­شدن لامینا پروپریا، واکوئلاسیون، ساییدگی و نکروز پرزهای روده بود. لامینا پروپریا بافت همبند عروقی حاوی اعصاب و لکوسیت­هاست که زیر اپیتلیوم قرار دارد و همراه با لایه اپیتلیوم مخاط (مکوزا) را تشکیل می­دهد (29) و افزایش ضخامت لامینا پروپریا ممکن است ناشی از اختلال در گردش خون (3) و / یا پاسخ التهابی (15) باشد. مشابه نتایج پژوهش حاضر، نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم باعث ساییدگی و جوش‌خوردگی پرزهای روده و واکوئلاسیون سلول­های اپیتلیالی روده قزل­آلای رنگین­کمان شده است (10). در پژوهش مشابه­ای کپور معمولی با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم و نانواکسید مس مواجهه هم‌زمان داده شدند که افزایش سلول­های خونی، انبساط ساختار پرز، نکروز و ساییدگی پرز روده مشاهده شد (19). مشخص‌شده که تنش، ازجمله آلاینده­های موجود در آب می­تواند موجب افزایش نوشیدن آب محتوی نانوذرات شود (13،28)، بنابراین، در این شرایط دستگاه گوارش بیشتر در معرض نانوذرات قرار می­گیرد. ازاین‌رو، آسیب­های بافتی مشاهده­شده در پژوهش حاضر می­تواند ناشی از بلعیدن نانوذرات نقره و دی­اکسید تیتانیوم توسط ماهی آزاد دریای خزر باشد.

نتایج این پژوهش نشان داد که اگرچه نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم در آزمون سم­شناسی حاد (کوتاه­مدت) مرگ­ومیری ایجاد نکرد و از این نظر ماده نسبتاً غیر سمی محسوب می­شود، با توجه به آسیب بافتی مشاهده­شده در آزمون سمیت حاد نشان می­دهد که این نانوذرات قابلیت آسیب­زایی در این ماهی را دارد.

سپاسگزاری

نگارندگان بر خود لازم می­دانند از همکاری کلیه عزیزانی که در اجرای این پژوهش فعالیت مؤثری داشته­اند، تشکر و قدردانی نمایند.

تعارض منافع

بین نویسندگان هیچ گونه تعارض منافع گزارش نشده است.

جدول 1. یافته‌های هیستوپاتولوژیکی آبشش، کبد و رودة ماهی آزاد دریای خزر بعد از مواجهة حاد (4 روزه) با غلظت‌های مختلف نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم.

^* بدون تغییر (-)، تغییر ملایم (+)، تغییر متوسط (++) و تغییر شدید (+++).

تصویر 1. تغییرات بافت­شناختی مشاهده­شده در آبشش­های ماهی آزاد دریای خزر بعد از 4 روز مواجهه با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم. (a) گروه شاهد، (b) 10 میلی­گرم در لیتر، (c) 100 میلی­گرم در لیتر. هایپرپلازی (Hp)، کوتاهی تیغة ثانویه (SSL)، هایپرتروفی (Ht)، جوش­خوردگی تیغة آبششی (LF)، جداشدگی اپیتلیالی (EL). (هماتوکسیلین و ائوزین، بزرگنمایی ×400).

تصویر 2. هیستوپاتولوژی کبد ماهی آزاد دریای خزر بعد از قرارگرفتن در معرض نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم به مدت 4 روز. (a) گروه شاهد، (b) 10 میلی­گرم در لیتر، (c) 100 میلی­گرم در لیتر. هپاتوسیت (H)، فضای سینوزوئید (S)، تجمع سلول­های خونی (AB)، کانون­هایی از مراکز ملانوماکروفاژ (MA)، هستة پیکنوتیک (PN)، واکوئلاسیون (V) و نکروز (N). (هماتوکسیلین و ائوزین، بزرگنمایی ×400).

تصویر 3. مورفولوژی روده در ماهی آزاد دریای خزر بعد از مواجهه با نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم به مدت 4 روز. (a) گروه شاهد، (b) 100 میلی­گرم در لیتر. سلول­های ستونی (C)، سلول­های جامی (GC)، لامینا پروپریا (LP)، لایة فشرده (Co)، لایة عضلانی داخلی (I) و لایة عضلانی خارجی (E، تصویر a)، واکوئلاسیون (V)، جداشدگی اپیتلیال (EL)، فرسایش پرزهای روده (E) و نکروز (N) (هماتوکسیلین و ائوزین، بزرگ­نمایی بزرگنمایی ×400).