ارزیابی تنوع ژنتیکی آویشن‌های بومی ایران (.Thymus spp) با استفاده از نشانگرهای ملکولی ISSR

مقدمه

گیاهان منبع اصلی تولید دارو در سالهای دور بوده اند که در پی عوارض داروهای شمیایی دوباره در سال های اخیر  مورد توجه قرار گرفته اند. داروهای گیاهی به‌ ویژه هنگام مصرف طولانی و بیماری­های مزمن بسیار مناسب­تر هستند (Omid Beygi, 2009). جنس آویشن، یکی از جنس­های خانواده نعنا و زیر خانواده نپتودا(Nepetoideae) است .اسانس آویشن، در ردیف 10 اسانس معروف دنیا است که جایگاه اقتصادی خاصی در تجارت جهانی دارد. در بین داروهای گیاهی تولید شده نیز گیاه آویشن در جهان بعد از نعنا، دارای رتبه دوم است (Omid Beygi, 2006). با توجه به درصد بالای اسانس در برخی از آویشن‌های بومی ایران و نیز درصد بالای ترکیبات فنولی در آن‌ها (بویژه تیمول)، می­توان آن را به عنوان جایگزین مناسبی برای گونه رسمی اروپایی (T. vulgavis) جهت مقاصد مختلف، به‌ویژه کاربردهای دارویی در نظر گرفت (Nickavar et al., 2004).

 در مورد تعداد گونه­های آویشن از نظر تاکسونومی، گزارش­های متفاوتی وجود دارد. تعداد گونه­های آن در بعضی از گزارش­ها به 800 گونه می­رسد، اما با در نظر گرفتن کمترین مقدار تنوع مورفولوژیکی، 215 گونه از این جنس گزارش شده است (Morales, 2012). دلیل وجود تنوع بالا در بین گونه­های آویشن، مقدار بالای دورگ­گیری بین گونه­ای در این جنس است (Jamzad, 2009). از میان گونه­های آویشن، 18 گونه در ایران شناسایی شده است که از این تعداد، قبلاً 14 گونه و زیرگونه توسط پروفسور ریشینگر در فلور ایرانیکا گزارش شده‌ است و چهار گونهT. persicus‚
 T. carmanicus‚ T. daenensis‚ T. trautvetteri انحصاری کشورمان است.

 اگرچه سابقه کشت و کار گیاهان دارویی به هزاران سال پیش باز می­گردد، اما باید بیان داشت که در زمینه اصلاح این گیاهان ارزشمند، تاکنون اقدام قابل ملاحظه­ای صورت نگرفته است ) Bernath., 2002 Nemth., 2000;). در حال حاضر، تعداد ارقام اصلاح شده گیاهان دارویی اندک است. حدود 75-60 درصد از گیاهان دارویی که امروزه در کشت و صنعت­ها، کاشته و تولید می شوند، از طریق روش‎های ساده انتخاب در بین جمعیت‏های وحشی یا توده‏های بومی به‌دست آمده­‌اند. کارایی انتخاب، به وجود و شناخت دقیق تنوع ژنتیکی بستگی دارد)  Bernath, 2002 Nemth, 2000;)  در کشور ما، تحقیق روی اکثر گیاهان دارویی اندمیک یا بومی، تحت الشعاع گیاهان زراعی قرار گرفته است. بنابراین پیشرفت در زمینه اصلاح و بهره‌برداری از این گیاهان، نیازمند استفاده از تنوع ژنتیکی آن‌ها است (Rahim Malek et al., 2009). تنوع زنتیکی، اساس اصلاح نباتات و ماده خام ضروری برای آن است. یک بهنژادگر در صورتی می‌تواند امید به موفقیت زیادی در برنامه‌های بهنژادی خود داشته باشد که شانس انتخاب مواد مناسب برای او فراهم باشد. به‌همین دلیل، منابع خویشاوند وحشی گیاهی، یکی از مهم‌ترین، پرارزشترین و حیاتی‌ترین ذخایر و منابع طبیعی بشر محسوب می‌شوند (Vejdani, 1993).

مطالعات در سطح جمعیت نشان می­دهد که نشانگرهای DNA، کارایی زیادی در تشخیص تنوع دارند و اطلاعات زیادی را فراهم می­آورند. این نشانگرها، گروه­های ژنتیکی و تشابه بین آن‌ها را مشخص می­سازند و در تخمین تنوع درون گروه‏ها و مطالعه روابط تکاملی آن‌ها با خویشاوندان وحشی نیز بسیار موثر هستند (Sharma et al., 1996). یکی از تکنیک­هایی که اخیرا برای بررسی تنوع ژنتیکی، مورد استفاده گسترده پژوهشگران قرار گرفته است، تکنیک ISSR است. این تکنیک، ترکیبی از مزیت­های تکرارپذیری و دقت AFLP وSSR  و فراگیری و عمومیت RAPD را دارا می‏باشد. در واقع این تکنیک، به‌دلیل داشتن آغازگرهایی با توالی ساده تکراری با طول 25-16 جفت باز، همراه با توالی لنگر در سمت 3’ و یا 5’ خود، تکرارپذیری بالایی دارد. به‌علاوه وجود این تعداد باز، سبب بالا بردن دمای اتصال (c60-45) می­شود که این موضوع، خود سبب افزایش دقت کار[1] می­شود. دو مورد از مزیت‏های مهم این نشانگر این است که  نیازی به اطلاعات قبلی از توالی ژنوم ندارد و هزینه این روش نسبت به روش‏ هایی نظیر SSR و AFLP خیلی پائین‏تر و اجرای آن  نیز راحت­تر است (Aga et al., 2005). مطالعه بر روی قابلیت تکرارپذیری ISSR نشان داده است که تنها باندهای ضعیف، قابلیت تکرار را ندارند و حدود 95-92 درصد از قطعات، در ژنوم افراد مختلف یک گونه و همچنین در PCR های مختلف، قابل مشاهده و بررسی است (Fang, 1998).

در بررسی تنوع ژنتیکی و تمایز جغرافیایی 17 توده آویش دنایی با استفاده از 13 آغازگر ISSR، تعداد 356 باند تولید شد که تعداد 228 باند، چند شکل بودند. دندروگرام تولید شده از داده­ها، توده­های بررسی شده را در دو گروه ژنتیکی متمایز قرار داد و انشعاب ژنتیکی آن‌ها، ارتباطی قوی با مناطق جغرافیایی و رویشگاهی آن‌ها نشان داد (Rahim Malek et al., 2009).

به‌منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی درون و برون محیطی گیاه دارویی آویشن کرمانی، از نشانگر­های ملکولی ISSR استفاده شد که از مجموع 12 آغازگر به‌کار رفته، 127 باند با وضوح بالا تولید شد که از این تعداد، 22 باند، یک شکل و 105 باند دارای چند شکلی بودند (Bigdello, 2011).

در بررسی تنوع ژنتیکی 31 تک بوته T. caespititus جمع آوری شده از سه منطقه کوروا، فلوریس و گارسیوسا با استفاده از 11 آغازگر ISSR و 17 آغازگر RAPD، به‌ترتیب 127 و 199 باند چند شکل تولید شد. اطلاعات به‌دست آمده، گیاهان جمع‌آوری شده از مناطق کوروا و فلوریس را در گروه جداگانه­ای از گیاهان جمع آوری شده از منطقه گارسیوسا قرار داد (Trindade et al., 2009).

هدف از این پژوهش، بررسی تنوع ژنتیکی در بین و درون جمعیت­های گونه­های مختلف آویشن­ بومی ایران و تعیین فاصله ژنتیکی موجود در بین جمعیت‏های مختلف، برای شناسایی جمعیت‏های دارای بیشترین فاصله از هم بود.

مواد و روش‏ها

در این تحقیق، از 12 آغازگر ISSR جهت بررسی تنوع ژنتیکی در 23 جمعیت آویشن استفاده شد. بذرهای 22 جمعیت از چهار گونه آویشن­ بومی ایران از موسسه تحقیقات جنگل‏ها و مراتع کشور، شرکت پاکان بذر اصفهان و پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی تهیه شد. همچنین در کنار این نمونه­ها، بذر نمونه آویشن ولگار
(T. vulgaris) نیز به عنوان شاهد، برای مقایسه با جمعیت­های بومی ایران، از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد (جدول 1).

جدول 1- مشخصات جمعیت‏های آویشن مورد بررسی در این پژوهش.

Table 1.  Characteristics of 23 thyme population used in this study.

بذرها در سینی نشا و در محیط کشت کوکوپیت و پرلیت، در گلخانه­های گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران کاشته شدند. پس از جوانه زدن و رشد، گیاهچه‏­‌ها در مرحله چهار برگی از سینی نشا به گلدآن‌های سفالی منتقل شدند. پس از رشد مناسب گیاهچه­ها، از هر جمعیت، پنچ گیاه به‌صورت تصادفی انتخاب شدند و برای استخراج DNA، از برگ‌های سالم و جوان هر گیاه، نمونه‌برداری شد. برگ‏­‌های جمع‌آوری شده پس از انجماد در ازت مایع، به فریزری با دمای منفی 80 منتقل شدند. استخراج DNA از گیاه آویشن با روش تغییر یافته CTAB (Murray & Thompson, 1989) و در چندین مرحله انجام شد. کمیت و کیفیت DNA  استخراجی نیز با استفاده از نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش، از 12 آغازگر ISSR استفاده شد (جدول 2).

 آغازگر­های به‌کار رفته در این پژوهش، آغازگرهایی بودند که در سایر مطالعات انجام گرفته بر روی گونه­های مختلف آویشن و یا سایر گیاهان خانواده نعنا (Bigdelo et al., 2011; Rahim Malek et al., 2009; Trindade et al., 2009) بیشترین مقدار چند شکلی را نشان داده بودند. توالی آغازگر­های به کار رفته در جدول 2 آورده شده اند.

جدول 2- توالی آغازگر­هایISSR  مورد استفاده.

Table 2. ISSR primers used for analysis of Iranian thyme.

حجم واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، 20 ماکرولیتر (بافرX  10،MgCl₂: 4 mM  ، dNTP: 0.25 mM، Primer : 0.5 pM ،  2 %: Formamide ، 30 ng/  DNA: (  در نظر گرفته شد و برنامه تکثیر به‌صورت Touch down انجام شد (شکل 1). الکتروفورز محصولات حاصل از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، با استفاده از ژل آگارز دو درصد و به مدت دو ساعت، با جریان 90 ولت صورت گرفت. رنگ آمیزی ژل، با استفاده از اتیدیوم بروماید صورت گرفت و در نهایت، عکس برداری از نمونه‏ها  با استفاده از دستگاه ژک داک انجام شد.

شکل 1- برنامه زمانی واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای آغازگرهای ISSR مورد استفاده.

Figure 1. Polymerase chain reaction timing applied for ISSR primers.

نمره­دهی باندها، به‌صورت یک برای وجود باند و صفر برای عدم وجود باند انجام شد. محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) بر اساس فرمول  (Prasad et al., 2000) محاسبه شد. پارامترهای تعداد آلل‌های مشاهده شده(Na)، تعداد آلل‌های موثر (Ne (، میزان جریان ژنی (Nm)، مقادیر فاصله ژنتیکی (D)، شباهت ژنتیکی (I)، ماتریس تشابه و تجزیه واریانس ملکولی (AMOVA) با استفاده از نرم افزار  GenAlEx v. 6. 1(Peakall & Smouse, 2006) مورد محاسبه و بررسی قرار گرفت. ضریب تمایز ژنی بین جمعیت­ها (GST) با استفاده از نرم افزار Popgen محاسبه شد و برای رسم دندروگرام بر اساس روش UPGMA و بر اساس ماتریس تشابه، از نرم افزار NTSYS استفاده شد. در این مطالعه، جهت تفکیک و گروه‌بندی نمودار خوشه‌ای، مکان خط برش با استفاده از روش جذرگیری بر روی محور فاصله مشخص شد.

نتایج و بحث

از بین 12 آغازگر به‌کار رفته در این پژوهش، 10 آغازگر، پلی‌مورفیسم نشان دادند و دو آغازگر P₈ وP₁₀ باند مناسبی جهت ارزیابی و بررسی جمعیت‏های مورد مطالعه نشان ندادند. در مجموع، 57 آلل شناسایی شد که در این بین، آغازگرهای P₂، P₄ و  P₅با چهار آلل، دارای کمترین تعداد آلل و آغازگر P₆ با هشت آلل، دارای بیشترین تعداد آلل در بین آغازگرهای مورد بررسی بودند. میانگین تعداد آلل در کل جایگاه‌ها، 7/5 بود (جدول 3). از آن‌جا که تعداد آلل هر نشانگر ریزماهواره، یکی از شاخص­هایی است که مناسب بودن هر مکان ژنی را برای تخمین تنوع ژنتیکی نشان می‌دهد (Roder et al.,1998)، بنابراین آغازگر­هایی که تعداد آلل زیادی نشان داده‌اند، برای بررسی تنوع ژنتیکی مناسب تشخیص داده می­‌شوند. با بررسی آلل‌ها مشاهده شد که برخی از آغازگر­ها در بعضی از ژنوتیپ­‌ها، هیچ باندی را تکثیر نکردند. با توجه به سالم بودن DNA و چند بار تکرار آزمایش، به‌نظر می‌رسد که وقوع جهش در یک یا دو طرف ناحیه تکرار شونده، مانع چسبیدن آغازگرها و تکثیر ناحیه بین دو آغازگر شده است.

بیشترین درصد چند شکلی با متوسط 43/70 درصد، به آغازگر  P₉( شکل 2)و کمترین درصد چندشکلی با متوسط 13/39 درصد، به آغازگر  تعلق داشت. متوسط درصد چند شکلی در بین تمامی آغازگرهای مورد استفاده، 2/52 درصد بود (جدول 3).

در تحقیقی که بر روی 25 نمونه آرتیمیزیای مربوط به پنچ منطقه با استفاده از 10 آغازگر ISSR صورت گرفت، 78 باند به‌دست آمد که از این تعداد، 54 باند چند شکل بودند؛ در این مطالعه، درصد چند شکلی 67/66 درصد بود (Shafai et al., 2011).

 محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) محاسبه شده برای 10 آغازگر مورد استفاده با متوسط 68/0 از 55/0 برای آغاگر ₁₂P تا 92/0 برای آغازگر ₉P متغیر بود. میزان اطلاعات چند شکلی، یکی از شاخص‌های مهم جهت مقایسه نشانگر­های مختلف از لحاظ قدرت تمایز آن‌ها می­باشد. مقادیر بالای این معیار، نشان دهنده چند شکلی بالا و وجود آلل یا آلل­های نادر در یک جایگاه نشانگری است که در تفکیک و تمایز افراد، نقش بسزایی دارد (Agrama & Tuinstra, 2003). بنابراین آغازگر P₉ با بیشترین مقدار PIC، بهتر از سایر نشانگرهای به‌کار رفته توانست فاصله ژنتیکی نمونه‌ها را مشخص کند.

میانگین تعداد آلل­‌های مشاهده شده، 12/1 بود که بیشترین آن با متوسط 46/1 به آغازگرها­ی P₅ و ₉ Pوکمترین آن با متوسط 01/1 به آغازگر P₁ تعلق داشت. تعداد آلل‌های موثر نیز با متوسط 34/1 از دامنه 48/1 برای آغازگر  P₅تا 29/1 برای آغازگر ₄P متغیر بود. شاخص اطلاعاتی شانون (I) با متوسط 29/0، از 21/0 برای آغازگر P₇ تا 37/0 برای آغازگر  P₉متغیر بود. ضریب شانون نیز همانند محتوای اطلاعات چندشکلی، میزان چند شکلی آغازگر را نشان می‌دهد (جدول 3).

به‌منظور بررسی روابط بین جمعیت‌ها، شاخص‌های بین جمعیتی برای تک تک آغازگرها به‌طور جداگانه بررسی شد (جدول 3). اولین شاخص، تنوع ژنتیکی کل (H_T) بود که با میانگین 3/0، از 2/0 برای آغازگر P₁₂ تا 458/0 برای آغازگر P₅ متغیر بود. از نظر شاخص تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی (Hs) نیز آغازگر  P₁₂با متوسط 16/0 کمترین و آغازگر‌های P₅ و P₉ با متوسط 25/0 بیشترین مقدار را نشان دادند. با توجه به نتایج، بین شاخص‌های شانون، تنوع ژنتیکی کل، تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی و تعداد آلل‌های مشاهده شده و موثر، رابطه مستقمی وجود داشت (جدول 3).

شکل 2- الگوی باندی حاصل از تکثیر DNA ژنومی جمعیت­های مختلف آویشن توسط آغازگر ₉P بر روی ژل آگارز دو درصد.

Figure 2. The bands produced by ISSR primer P₉ in some thymus population of on 2% agarose gel.

ضریب تمایز ژنی بین جمعیت (G_ST) به‌طور متوسط برابر با 341/0 محاسبه شد که آغازگرهای P₂ و P₁₂ به‌ترتیب با 489/0 و 204/0، بیشترین و کمترین مقدار این شاخص را نشان دادند. آماره G_ST نسبت تنوع بین جمعیتی به تنوع کل را نشان می­‌دهد. بر اساس نتایج،1/34 درصد از تنوع مشاهده شده در کل جمعیت­‌ها، تنوع بین جمعیت­‌ها بود و 9/66 درصد تنوع کل، به تنوع دورن جمعیت­‌ها تعلق داشت. مقدار جریان ژنی (Nm) برای تمامی آغازگرها برابر با 963/0 محاسبه شد که این مقدار، متأثر از ضریب تمایز ژنی بین جمعیت­‌ها بود و همبستگی منفی با آن داشت. در میان آغازگرهای مورد بررسی نیز بیشترین جریان ژنی در میان جمعیت­‌ها، برای آغازگر P₆ و کمترین آن برای آغازگر  P₂مشاهده شد. تشابه ژنتیکی بالا می‌­تواند ناشی از ادغام و همپوشانی زیاد جمعیت­‌ها باشد که از جریان ژنی بین جمعیت­‌ها حاصل شده است.

جدول 3- ویژگی­های  نشانگرهای حاصل از ده آغازگر  ISSR مورد بررسی در ژنوتیپ­های آویشن.

Table 3- ISSR primer characteristics in thyme species accessions.

N: تعداد باند، Na: تعداد آلل مشاهده شده، Ne: تعداد آلل موثر، I: شاخص اطلاعاتی شانون، H_T: تنوع ژنتیکی کل، Hs: تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی،  Gst: ضریب تمایز ژنی و Nm: جریان ژنی.

N: Number of bands, Na: Number of observed alleles, Ne: Number of effective alleles, I: Shannon information index, H_T: Total genetic diversity, Hs: Intra- population genetic diversity, Gst: Genetic differentiation coefficient and Nm: Gene flow.

به منظور بررسی تنوع ژنتیکی درون جمعیت­‌ها، میانگین شاخص‌های درون جمعیتی شامل آلل­‌های مشاهده شده (Na)، تعداد آلل‌های موثر (Ne)، تنوع ژنی نی (H) و شاخص شانون (I) برای جمعیت‌های مورد بررسی محاسبه شد (جدول 4). از نظر تعداد آلل­‌های مشاهده شده، جمعیت یک با متوسط 77/1/بیشترین مقدار را نشان داد. میانگین تعداد آلل­‌های موثر در کل جمعیت­های مورد بررسی، 34/1 بود و بیشترین تعداد آلل موثر در جمعیت شماره 14با میانگین 74/1 مشاهده شد.

از نظر تنوع ژنی نی (H) و شانون (I) نیز جمعیت یک به ترتیب با متوسط 29/0 و43/0 بیشترین مقدار را داشت و جمعیت 14 با مقادیر 1/0 و 172/0 کمترین مقدار این دو شاخص تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص داد. از نظر تعداد باند‌های چندشکل نیز جمعیت‌های یک و دو به‌ترتیب با 18/70 و 67/66، بیشترین درصد و جمعیت 14 با 09/35، کمترین مقدار پلی‌مورفیسم را به خود اختصاص دادند.

جدول 4- شاخص‌های تنوع ژنتیکی در جمعیت‌های آویشن مورد بررسی.

Table 4. Genetic diversity indices in thyme populations.

اعضای جمعیت 14، مربوط به گونه اصلاح شده ولگار هستند و همان‌گونه که انتظار می­رفت، درصد پلی‌مورفیسم زیادی در آن مشاهده نشد. بر اساس نظر شرکت پاکان بذر، بذرهای تهیه شده از این جمعیت، مربوط به نسل F₂ بودند و با در نظر گرفتن درصد بالای دگرگشنی در این گیاه، می‌توان پلی مورفیسم موجود در این جمعیت را توجیه کرد. به‌طورکلی، در بین جمعیت­های مورد بررسی، تنوع زیادی وجود داشت، اما تنوع درون جمعیتی بیشتر بود که این موضوع سبب ممانعت از بروز کامل تنوع بین جمعیتی شد.

تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که واریانس درون جمعیت‌ها نسبت به واریانس بین جمعیتی بیشتر بود، به‌طوری‌که گیاهان درون جمعیت‌ها تنوع بالایی داشتند و جمعیت‌ها ناهمگن بودند. واریانس بین  و درون جمعیت­ها جمعیت­ها، به‌ترتیب 27 و 73 درصد بود (جدول 5). به‌طورکلی در مورد جمعیت­های وحشی، فاصله جغرافیایی و جریان ژنی بین جمعیت­ها تعیین کننده فاصله ژنتیکی می‌باشد. در گونه­های دگرگشن، به‌علت جریان ژنی بالا، فاصله ژنتیکی جمعیت­ها کم  و در عوض تنوع ژنتیکی در درون جمعیت­ها پراکنده است. در مورد این گونه­ها، در صورتی‌که جریان ژنی بین رویشگاه­ها، تحت تاثیر عوامل غیرطبیعی چون تخریب رویشگاه­ها در اثر چرای بی­رویه، چرای مفرط و سایر عوامل قطع شود، فاصله ژنتیکی جمعیت­های منقطع افزایش می­یابد و به علت افزایش هموژنی و افتراق بین جمعیت­ها، فرسایش ژنتیکی رخ خواهد داد (Hamrick & Godt, 1989). در مطالعه بر روی 70 ژنوتیپ از هفت جمعیت آویشن کرمانی با استفاده از 12 آغازگر ISSR گزارش شد که تنوع ژنتیکی درون جمعیتی، حدود 67 درصد و تنوع بین جمعیتی، حدود 33 بود (Bigdello et al., 2011).

جدول 5- تجزیه واریانس مولکولی AMOVA)) تنوع بین و درون جمعیت‌های آویشن.

Table 5. Analysis of molecular variance between and within the populations of thyme.

مقدار ارزش  phipT(27/0)، نشان ­دهنده تمایز بین جمعیت‌ها است که با توجه به این‌که جمعیت 14 آویشن ولگار، نسل ₂F بوده است و بذر جمعیت شماره هشت هم از دانشگاه شهید بهشتی فراهم شده بود که چند نسل انتخاب بر روی آن صورت گرفته بود، می‌توان گفت که این دو جمعیت تا حدودی تثبیت شده­اند. در واقع نشان دهنده این است که این جمعیت­ها تنوع خود را از دست داده­اند و به یکنواختی رسیده­اند. علاوه بر این، بذر سایر جمعیت­ها که از مرکز تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور تهیه شده بود نیز ممکن است متعلق به یک بوته و یا چند بوته مجاور هم بوده است که این موضوع هم می­تواند در متمایز شدن جمعیت­ها نقش داشته باشد (جدول 5).

به‌منظور بررسی تنوع ژنتیکی درون هر گونه، جمعیت­های مختلف مربوط به هر گونه به عنوان یک جمعیت در نظر گرفته شدند و میانگین شاخص‌های درون جمعیتی شامل آلل‌های مشاهده شده (Na)، تعداد آلل‌های موثر (Ne)، تنوع ژنی نی (H) و شاخص شانون (I) برای جمعیت‌های مورد بررسی محاسبه شد (جدول 6). از نظر تعداد آلل‌­های مشاهده شده، گونه دنایی با متوسط 96/1 بیشترین و گونه ولگار با متوسط 71/0 کمترین مقدار را نشان داد. میانگین تعداد آلل­‌های موثر در کل جمعیت­های مورد بررسی، برابر با 38/1 بود و بیشترین تعداد آلل موثر در گونه­های دنایی و T. Lancifolius با میانگین 45/1 مشاهده شد. از نظر تنوع ژنی نی (H) و شانون (I) نیز گونه دنایی به ترتیب با متوسط 28/0 و 44/0 بیشترین مقدار را داشتند و گونه ولگار با مقادیر 112/0 و 172/0 کمترین مقدار این دو شاخص تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص دادند. از نظر تعداد باند­‌های چندشکل نیز گونه­­‌های دنایی و  T. lancifolius به‌ترتیب با درصد پلی‌مورفیسم 25/98 و 44/75 بیشترین و گونه ولگار با درصد پلی‌مورفیسم 09/35، کمترین مقدار را از لحاظ این صفت به خود اختصاص دادند (جدول 6).

جدول 6- شاخص‌های تنوع ژنتیکی در گونه‌های آویشن مورد بررسی.

Table 6. Genetic diversity indices in thyme species.

N: تعداد باند، Na: تعداد آلل مشاهده شده، Ne: تعداد آلل موثر، I: شاخص اطلاعاتی شانون، H_T: تنوع ژنتیکی کل، Hs: تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی،  Gst: ضریب تمایز ژنی و Nm: جریان ژنی.

N: Number of bands, Na: Number of observed alleles, Ne: Number of effective alleles, I: Shannon information index, H_T: Total genetic diversity, Hs: Intra- population genetic diversity, Gst: Genetic differentiation coefficient and Nm: Gene flow.

تجزیه واریانس داده­های ملکولی مربوط به گونه­ها نشان داد که در بین گونه­ها، تفاوت چندانی وجود نداشت و بیشتر تفاوت در درون گونه­ها بود، به‌گونه­ای که واریانس درون و بین گونه، به‌ترتیب 90 و 10 درصد بود (جدول 7).

جدول 7 - تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) برای تنوع بین و درون گونه­های مختلف آویشن.

Table 7. Analysis of molecular variance between and within the species of thyme.

نتایج حاصل از تجزیه کلاستر، جمعیت­های مورد بررسی  را به دو کلاستر اصلی تقسیم بندی نمود که کلاستر اول به دو زیرمجموعه و کلاستر دوم به سه زیرمجموعه تقسیم شد. کلاستر اول بیشتر شامل جمعیت­های متعلق به گونه­های دنایی و برخی از جمعیت­های مربوط بهT. lancifolius  بود. از آن‌جا که گفته می­شود این گونه از زیرگونه­های آویشن دنایی است، این نکته قابل توجیه می‎باشد. زیر مجموعه­های یک و دو گروه دوم را هم بیشتر جمعیت­­های متعلق به آویشن دنایی تشکیل دادهند. زیر مجموعه سوم از گروه دوم را نیز بیشترجمعیت­های متعلق به گونه­های   T. kotschyanus و T. pubescence تشکیل دادند (شکل 3) .

نتایج تجزیه کلاستر حاصل با پراکندگی جغرافیایی جمعیت­ها نیز همخوانی دارد؛ مثلاً جمعیت­های شش (نمونه­های 26، 27، 28، 29 و30) و هشت (36، 37، 38، 39 و 40)که هر دو متعلق به استان اصفهان هستند، در فاصله نزدیکی نسبت به هم قرار گرفتند. همچنین جمعیت­های مربوط به اصفهان و ارومیه (هشت و 15) که از لحاظ جغرافیایی در حدود 1074 کلیومتر با یکدیگر فاصله دارند، از لحاظ ژنتیکی هم در فاصله نسبتاً زیادی از یکدیگر قرار گرفتند که این خود نشان دهنده مناسب بودن نشانگر ملکولی ISSR در تفکیک جمعیت­های مورد بررسی است. به‌طورکلی، برخی از ژنوتیپ‌ها به‌طور کامل به گروه­های مشخص مطابق با جمعیت‌های مختلف تقسیم نشدند و این ژنوتیپ‌ها به‌طور مساوی در طول دندروگرام توزیع شدند که توزیع ژنوتیپ‌ها به این صورت، وجود تنوع ژنتیکی زیاد درون توده­ای را تایید کرد (شکل 3).

به‌منظور تعیین ارتباط و فاصله بین گونه­ها، تجزیه کلاستر مربوط به گونه­ها نیز انجام (شکل 4) و مشاهده شد که گونه­های مورد بررسی، در دو کلاس کلی قرار گرفتند، به‌شکلی که گونه دو که گونه ولگار بود، در یک کلاستر و گونه­های آویشن بومی ایران در یک کلاستر دیگر قرار گرفتند. با توجه به این‌که منشا این گونه کشور آلمان و دارای ماهیت ژنتیکی متفاوتی با آویشن­های بومی ایران می­باشد، این امر می­تواند گواهی بر مناسب بودن نشانگرISSR  در تفکیک گونه­های مورد بررسی باشد. در بین گونه­های بومی ایران نیز گونه سه که آویشن  T. pubescence است، به‌طور کامل از سایر گونه­ها جدا شد و در یک زیر کلاستر جداگانه قرار گرفت که شاید بتوان عامل جغرافیایی را دلیل مهم این تمایز دانست، به‌طوری که اکثر جمعیت­های مربوط به سایر گونه­ها، متعلق به استان های مرکزی و غربی کشور مثل استآن‌های اصفهان، مرکزی و خرم آباد و... هستند، درحالی‌که جمعیت­های مربوط به گونه  T. pubescence متعلق به مناطق ارومیه، سقز و آذربایجان شرقی هستند که این بعد مسافت، سبب رانش ژنتیکی جمعیت­های مربوط به این گونه و در نهایت متمایز شدن این گونه نسبت به سایر گونه­ها شده است (شکل3).

نتیجه گیری کلی

به‌طور‌کلی نتایج مربوط به تجزیه داده­های ملکولی نشان داد که بیشترین مقدار PIC مربوط به آغازگر ₉P با 92/0 بود. میانگین PIC در کل آغازگرهای مورد بررسی،  68/0 بود که نشان دهنده کارایی مناسب آغازگرهای به‌کار برده شده است. علاوه بر این، بیشترین مقدار پلی‌مورفیسم در جمعیت­های یک و دو، با درصد پلی‌مورفیسم 18/77 و 67/66 درصد مشاهده شد. بر اساس نتایج تجزیه واریانس ملکولی، درصد واریانس ملکولی بین جمعیت­ها برابر با 27 درصد و واریانس ملکولی درون جمعیتی 73 درصد بود که نشان دهنده تنوع بسیار بالا در درون جمعیت­های مختلف مورد بررسی است. در بین گونه‏های مورد بررسی نیز گونه دنایی و T. lancifolius با 25/98 و 44/75 بیشترین درصد پلی‌مورفیسم و گونه ولگار با درصد 09/35 کمترین درصد پلی‌مورفیسم را داشتند و تنوع درون و بین گونه­ها، به‌ترتیب 90 و 10 درصد بود.