تأثیر تیمارهای اسید جیبرلیک، دمای جوانه‌زنی و سرمادهی بر شکست خواب بذر و جوانه‌زنی بذر آوندول (Smyrnium cordifolium)

مقدمه

در میان جنس­های متفاوت تیره چتریان، جنس Smyrnium تنها یک گونه­ بـا نام علمی
 Smyrnium cordifolium Bioss. در ایران دارد (Rechinger,1982) که با نام­های انحصاری و بومی آوندول و پنومه معرفی شده است
(Mozaffarian, 2012). این گیاه دوساله، پراکنش گسترده­ای در پهنه جغرافیایی زاگرس در مناطق غرب و جنوب غرب ایران و به‌خصوص در مراتع استان کهگیلویه و بویراحمد دارد (Rechinger,1982). از استفاده­های این گیاه در طب سنتی می‌توان به درمان ورم اندام­های داخلی بدن، به‌خصوص ورم مثانه و کلیه (Tabaraki & Ghidiri, 2013)، دفع سنگ کلیه و همچنین اثرات مدر و مقوی آن اشاره کرد که حاوی ترکیبات ارزشمند شیمیایی نظیر کوروزرن، کوروزرنون و ژرماسرن دی (Amiri et al., 2007) با اثرات آنتی‌باکتریال می­باشد (Amiri, 2007).

خواب بذر در واقع پدیده‌ای است که بسیاری از گیاهان دارویی و خودرو با آن مواجه هستند و به بذر این امکان را می­دهد که در شرایط نامساعد محیطی زنده بماند. اگرچه این پدیده فیزیولوژیکی برای بذرها مزیت اکولوژیکی محسوب می‌شود و بذر را تا آماده شدن شرایط لازم جهت استقرار و جوانه‌زنی، در مقابل شرایط سخت محیطی حفظ می‌کند، ولی به دلیل درصد جوانه‌زنی پایین، از مشکلات عمده حفاظت منابع طبیعی به‌شمار می­رود. از سوی دیگر، متخصصان فناوری بذر، هنگام آزمون قوه نامیه بذر این دسته از گیاهان با مشکلاتی روبرو می‌شوند
(Shamsi et al., 2015). سازوکارهای کلی خواب به پنج گروه فیزیکی، فیزیولوژیکی، مورفولوژیکی، مورفوفیزیولوژیکی و ترکیبی تقسیم بندی شده است (Baskin & Baskin, 2004). گزارش­های مختلف نشان داده­اند که بذرهای برداشت شده از گیاهان تیره چتریان، دارای درجات مختلفی از خواب فیزیولوژیکی (Vnadelook et al., 2007b)، مورفولوژیکی
(Baskin & Baskin, 1990) و مورفوفیزیولوژیکی (Vnadelook et al., 2007a) می‌باشند که متداولترین خواب در این تیره، خواب فیزیولوژیک
(Kretshmer, 1999) است. وجود درجات مختلفی از خواب در بذرهای این تیره، به‌دلیل وجود نوعی سازوکار فیزیولوژیکی بازدارنده جنین است که از خروج ریشه‌چه جلوگیری می‌کند (Sharifi et al., 2015). با توجه به تنوع وسیع گونه‌های تیره چتریان و همچنین تنوع نوع و عمق خواب، تیمارهای گوناگونی جهت شکستن خواب و تحریک جوانه‌زنی بذر گیاهان این تیره پیشنهاد شده است که از مهم‌ترین این تیمارها می­توان به سرمادهی مرطوب (Sharifi et al., 2016) و اسید جیبرلیک (Najafi et al., 2006) اشاره کرد.

در آزمایشی، تأثیر تیمارهای مختلف شکست خواب روی بذر گیاه باریجه نتایج نشان داد که هم کاربرد اسید جیبرلیک خارجی و هم سرمادهی مرطوب همراه با شستشو، موجب شکست خواب بذر و افزایش درصد جوانه­زنی در آن شده است (Nadjafi et al., 2006). تحقیقات روی بذرهای گیاه جاشیر
(Prangos ferulaceae) نشان داد که سرمادهی در دمای پنج و 12 درجه سانتی‌گراد، به‌ترتیب 35 و 26 درصد جوانه­زنی را افزایش داد
(Razavi & Hajiboland, 2009). نتایج آزمایشی روی دو جمعیت بذر آنغوزه (Ferula assafoetida L.) نشان داد که در هر دو جمعیت مورد بررسی،  حداکثر درصد جوانه­زنی در بذرهای تیمار شده بـا غلظت‌های کمتر GA₃ در ماه‌های دوم و سوم مشاهده شد
 (Rajabian et al., 2007). تأثیر تیمارهای مختلف بر شکست خواب بذرهای بیلهر ((Dorema aucheri نشان داد که تیمار سرمادهی به مدت چهار هفته به همراه شستشو و ppm١٥٠٠ اسید جیبرلیک، بیشترین تاثیر را بر شکست خواب فیزیولوژیک موجود در بذرهای این گونه داشته است (.(Salehi et al., 2015 در تحقیقی روی جوانه­زنی بذر گیاه جاشیر گزارش شد که تیمار سرمادهی به مدت شش ماه (67%)، موجب تفاوت معنی­دار جوانه‌زنی بذرهای جاشیر نسبت به شاهد شد (Safaian & Azarnivand, 2010).

برای گیاهانی که در اقلیم­های سرد می­رویند، معمولاً دمای پنج درجه سانتی‌گراد یا اندکی کمتر، بیشترین تأثیر را در شکستن خواب بذر دارد
(koornef et al, 2002). تیمار دمای پایین، سبب کاهش تراز هورمون­های بازدارنده و افزایش تراز هورمون‌های محرک رشد و درنتیجه موجب افزایش پتانسیل جوانه­زنی بذر می­شود؛ این رویدادها به­طور هم­زمان رخ می­دهد یعنی جوانه‌‌زنی در بذر، نتیجه توازن هورمون­ها است (Tipirdamaz & Gomurgen, 2000). Mellati et al(2010) با بررسی دمای جوانه‌زنی سه گونه کندل، باریجه و آنغوزه نشان دادند که در این سه گونه، بیشترین درصد جوانه­زنی در دمای چهار درجه سانتی­گراد و کمترین آن در دمای 20 درجه سانتی­گراد بوده است.

برخی از آنزیم­ها و هورمون­ها در حذف خواب و جوانه­زنی نقش اساسی دارند (Xie et al., 2007). آلفا آمیلاز یک آنزیم حیاتی است که در تخریب گرانول­های نشاسته به مولکول‌های آلی کوچک نقش دارد و انرژی و مواد غذایی را برای جوانه‌زنی بذر تهیه می‌کند
(Liu et al., 2018). در گزارشی روی بذرهای خفته (بدون سرمادهی) و غیرخفته (سرمادهی شده) جاشیر نشان داده شد که فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز با پیشرفت رسیدگی بذر افزایش پیدا کرد (Moradi et al., 2017). همچنین در بذر مرزنگوش (Origanum vulgare) فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز در بذرهایی که خواب آن‌ها شکسته شده بود، به‌طور معنی داری از بذرهای دارای خواب بیشتر بود (Dehghanpour Farashah et al., 2011).

اثر تحریک کننده پراکسیدهیدروژن بر جوانه­زنی و قدرت گیاهچه­ها در تعدادی از گونه­ها مشاهده شده است. این ماده به‌صورت یک عامل تحریک کننده تنفسی و تسریع کننده تجزیه مواد ذخیره­ای عمل می­کند که باعث تولید انرژی برای سنتز در نقاط رشد می‌شود (Gupat, 2003).  Debska et al (2013)، تاثیر تیمار سرمادهی روی محتوی پراکسیدهیدروژن در طی روند شکست خواب در بذر سیب را مورد بررسی قرار دادند. نتایج این تحقیق نشان داد که محتوی پراکسید هیدروژن پس از یک هفته قرار گرفتن بذرها در دمای پنج درجه سانتی‌گراد، به‌طور معنی‌داری در جنین افزایش یافت و پس از طی دو ماه سرمادهی، غلظت آن در جنین به حداکثر رسید.

گیاه آوندول به‌دلیل برداشت بی­رویه جهت مصارف دارویی و تغذیه دام، از جمله گیاهانی است که در معرض خطر انقراض قرار دارد؛ بنابراین حفظ این گونه گیاهی ضروری است. این گیاه به روش جنسی تولید مثل می‌کند و به‌دلیل تولید کم بذر و همچنین داشتن بذرهایی با خواب بالا، دارای تراکم و پراکندگی پایینی است؛ از این رو تکثیر گیاه آوندول در طبیعت به کندی صورت می‌گیرد که این امر خود سبب می‌شود که احیا و اهلی­سازی آن با مشکل مواجه شود. یکی از راهکارهای مفید برای تکثیر این گیاه، تیمار هورمونی و دمایی مناسبی است که شکست خواب بذر را تسهیل کند و در کوتاه‌ترین زمان، بیشترین درصد جوانه‌زنی را فراهم نماید. طبق بررسی منابع موجود، تاکنون اطلاعات مدون و جامعی درباره شکست خواب بذر گیاه آوندول ارائه نشده است. بنابراین این پژوهش با هدف بررسی پاسخ خواب بذر گیاه آوندول به تیمارهای شکست خواب هورمونی و دمایی اجرا شد.

مواد و روش­ها

آزمایش اول

برای انجام این پژوهش، بذرهای گیاه آوندول در تیرماه سال 1396 از رویشگاه‌های طبیعی آن در منطقه چنارستان استان کهگیلویه و بویراحمد، پس از جمع‌آوری به آزمایشگاه دانشکده کشاورزی منتقل شدند. به‌منظور بررسی اثر اسید جیبرلیک و سرمادهی بر شکست خواب بذر آوندول، آزمایشی به صورت فاکتوریل سه عاملی و در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار انجام شد. عامل اول شامل دماهای جوانه‌زنی (پنج، 10 و 15 درجه سانتی‌گراد) و عامل دوم شامل طول دوره سرمادهی (چهار، هشت و 12 هفته) و عامل سوم شامل پیش‌تیمار با غظت‌های صفر، 500، 1000 و 1500 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک در زمآن‌های مختلف 48 و 72 ساعت (GA0-48h، GA500ppm-48h، GA1000ppm-48h، GA1500ppm-48h، GA500ppm-72h، GA1000ppm-72h و GA1500ppm-72h) بود.  هر واحد آزمایش شامل 20 بذر کاملاً سالم بود که قبل از اعمال تیمارها، سه بار و هر بار به مدت ده دقیقه با استفاده از آب دو بار تقطیر و چند قطره مایع ظرف‌شویی، شستشوی سطحی شدند. پس از شستشوی سطحی، بذرها در زیر هود لامینار نیز ابتدا به مدت یک دقیقه در اتانول 70 درصد غوطه­ور شدند و سپس به مدت پنج دقیقه در هیپوکلریت سدیم دو درصد به همراه چند قطره توئین 20 قرار گرفتند. پس از اتمام این زمان، سه بار با آب دو بار تقطیر ضد عفونی شدند و هر بار به مدت ده دقیقه شسته شدند. بذرها پس از 48 و 72 ساعت پیش تیمار با اسید جیبرلیک و سپس شستشو با آب مقطر، به پتری‌دیش دیگری با کاغذ صافی منتقل شدند. جهت تأمین رطوبت، پنج میلی­لیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به‌منظور جلوگیری از تبخیر ،دور پتری­دیش­ها با پارافیلم بسته شد و به یخچالی با دمای چهار درجه سانتی­گراد و به مدت زمان چهار، هشت و 12 هفته منتقل شدند. بعد از طی زمان سرمادهی، بذرها به پتری­دیش‌هایی­­ با بستر کشت ماسه بادی، حاوی 10 میلی لیتر آب مقطر استریل شده منتقل شدند و پس از بستن دور پتری­دیش با پارافیلم، درون اتاقک‌ جوانه­زنی با دمای پنج، 10 و 15 درجه سانتی­گراد و شرایط نوری 12 ساعت روشنایی 12 ساعت تاریکی به مدت پنج هفته قرار گرفتند. پتری­دیش­ها روزانه بررسی شدند و تغییرات جوانه­زنی در آن‌ها یاداشت‌برداری شد. بذری جوانه­زده در نظر گرفته شد که نوک ریشه­چه به اندازه دو میلی متر از پوسته بذر خارج شده بود. در پایان دوره جوانه‌زنی، طول ریشه‌چه و ساقه‌چه نیز ثبت شدند.

در پایان درصد جوانه‌زنی (GP) از رابطه Fang et al.  و همکاران (2006) به‌دست آمد (رابطه 1): 

      GP (%)=          رابطه1                                                                               

در این رابطه،n : تعداد بذر‌های جوانه زده و N: کل بذر در هر تکرار می‌باشد.

شاخص بنیه گیاهچه (VI) نیز از حاصلضرب مجموع طول ریشه­ چه (RL) و طول ساقه­چه (SL) در درصد جوانه ­زنی (GP) به‌دست آمد (Abdul-Baki & Anderson, 1973) (رابطه 2): 

                VI=(RL+SL)×GP              رابطه 2

آزمایش دوم

به‌منظور اندازه­ گیری میزان فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز و محتوی پراکسیدهیدروژن، از بذرهای تیمار شده با آب مقطر و غلظت‌های مختلف اسید جیبرلیک (500، 1000 و 1500 میلی­گرم در لیتر) در زمان­های مختلف سرمادهی استفاده شد (صفر، دو، چهار، شش، هشت، 10 و 12 هفته). فعالیت پراکسیدهیدروژن در بذر، به روش Velikova & Loreto (2001) و با استفاده از 35/0 گرم بذر اندازه­گیری شد و برای استخراج، از محلول تری‌کلرواستیک‌اسید ((TCA 1% استفاده شد و جذب آن در طول موج390 نانومتر خوانده شد. محتوی پراکسیدهیدروژن به‌صورت واحد میلی مول بر گرم وزن تر بذر محاسبه شد.

برای استخراج عصاره بذری جهت اندازه­گیری فعالیت آلفا آمیلاز، از روش Makkar et al. (2007) استفاده شد. بدین منظور، از 5/0 گرم بذر و پنج میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 2/0 مولار سرد با 7pH= استفاده شد. فعالیت آلفا آمیلاز در عصاره بذرها با روش Baker, (1991) و Bernfeld (1995) با اندکی تغییر تعیین شد و جذب نمونه­ها در طول موج 540 نانومتر ثبت. مقدار فعالیت آنزیم به‌صورت واحد میلی­گرم مالتوز بر گرم وزن تر بذر (mg maltos/g seed)  گزارش شد.

تجزیه و تحلیل داده­ها با نرم افزار آماری SAS نسخه 4/9 و رسم نمودار با استفاده از نرم افزار Excel انجام شد. با معنی­دار شدن برهمکنش‌ها، برش‌دهی اثر ترکیب سطوح مختلف اسید جیبرلیک و طول دوره سرمادهی برای هر دمای جوانه­زنی، با استفاده از رویه L.S. Means و مقایسه میانگین اثرات ساده فاکتورها، با آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.

نتایج و بحث

شاخص­ های بیوشیمیایی

نتایج تجزیه واریانس (جدول1) نشان داد که اثر ساده اسید جیبرلیک، سرمادهی و برهم کنش آن‌ها بر فعالیت آلفا آمیلاز و پراکسیدهیدروژن در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود. نتایج جدول برش‌دهی نیز نشان داد که تأثیر غلظت­های مختلف اسید جیبرلیک برای فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز و محتوای پراکسید هیدروژن در طول دوره‌های سرمادهی مورد مطالعه‌ در سطح احتمال یک درصد معنی­دار شد (جدول2).

پس از خیساندن بذرها در آب مقطر و پیش­تیمار آن‌ها با اسید جیبرلیک در دمای چهار درجه سانتی‌گراد مشاهده شد که در تیمار بدون سرمادهی، بذرهای تیمار نشده با هورمون، محتوی پراکسید هیدروژن بیشتری داشتند.

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر غلظت­های مختلف اسیدجیبرلیک و زمان‌های مختلف سرمادهی بر برخی شاخص های بیوشیمیایی بذر آوندول.

Table 1. Variance analysis of the effect of gibberellic acid concentrations and stratification periods on some biochemical indices of Smyrnium cordifolium Bioss seeds.

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد.

**: Significant at 1% of probability level.

جدول2- نتایج برش­دهی تأثیر اسید جیبرلیک بر فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز و پراکسیدهیدروژن اندازه‌گیری شده بذر آوندول در زمان­های مختلف سرمادهی.

Table 2. Slicing analysis of variance (mean squares) of gibberellic acid effects on α-amylase and hydrogenperoxide activity of Smyrnium cordifolium Bioss. seeds at different stratification periods.

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد.

**: Significant at 1% of probability level.

در زمان سرمادهی دو هفته، تیمار GA1500-48 با 408/0 میلی­مول بر گرم بیشترین و در مدت زمان سرمادهی چهار و 12 هفته، پیش­تیمار GA500-48، بیشترین مقدار را دارا بودند (جدول 3). پیش­تیمار GA500-72 بیشترین مقدار پراکسیدهیدروژن را برای مدت زمان سرمادهی شش هفته نشان داد. در هشت و 10 هفته سرمادهی، بیشترین مقدار پراکسیدهیدروژن به تیمار GA1500-72 تعلق داشت؛ هرچند که در 10 هفته سرمادهی، دو تیمار GA1500-72 و GA500-48 با یکدیگر اختلاف معنی­داری نشان ندادند. همچنین قرار دادن بذرها در معرض هورمون، بجز در تیمار بدون سرما، باعث افزایش مقدار پراکسیدهیدروژن در تمام تیمارهای سرمادهی شد. در پژوهشی بر روی بذر گیاه  Ferula ovinaنشان داده شد که با افزایش مدت زمان سرمادهی، محتوی پراکسیدهیدروژن افزایش یافت؛ به­طوری­که در هفته آخر، بیشترین مقدار خود را نشان داد (Afshari, 2017 Fasih & Tavakkol ). گونه­های فعال اکسیژن مانند پراکسیدهیدروژن، باعث تجزیه ذخائر بذر در طی سرمادهی می‌شوند. هیدروژن سیانید (HCN)، به شدت بر روی کاتابولیسم ذخائر اثر می‌گذارد و باعث رشد جنین در طی سرمادهی می­شود (Lewak, 2011). نشان داده شده است که در طی شکست خواب بذر، هیدروژن سیانید تحت کنترل گونه­های فعال اکسیژن است (Oracz et al., 2009). علاوه بر این، ترکیبات فعال اکسیژن با سست کردن دیواره سلولی، به طویل شدن دیواره آن کمک می­کنند (Muller et al., 2009). توانایی اسید جیبرلیک برای کاهش خواب، توسط اکسید نیتریک کنترل می‌شود و افزایش ترکیبات گونه­های فعال اکسیژن مانند پراکسیدهیدروژن می‌تواند تولید اکسید نیتریک را در جنین تحریک کند
( El-Maarouf-Bouteau & Bailly,  2008). به‌علاوه گونه­های فعال اکسیژن، رشد جنین را تحریک می‌کنند و باعث شکست خواب مورفولوژیک می­شوند.

جدول 3- مقایسه میانگین تأثیر غلظت­های مخلف اسید جیبرلیک در زمان­های مختلف پیش­تیمار بر محتوی پراکسیدهیدروژن (میلی­مول بر گرم وزن تر بذر) در بذر آوندول در هر سطح از سرمادهی

Table 3. Mean comparison the effect of GA₃ concentrations in different pretreatment durations at stratification levels on Smyrnium Cordifolium Bioss seed hydrogen peroxide Content (mM/gr).

حروف مشابه در هر ستون، نشان دهنده عدم اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد است.

The same letters in the same column indicate no significant difference based on the Duncan test at 5% of probability level.

در بذرهای تیمار شده با اسید جیبرلیک و آب مقطر بدون سرمادهی، بیشترین مقدار فعالیت آلفا آمیلاز در تیمار بدون سرمادهی و شش هفته سرمادهی، به تیمار GA1000-72 تعلق داشت (جدول 4). در دو، چهار، هشت، 10 و 12 هفته سرمادهی، بیشترین میزان فعالیت آنزیمی در تیمار GA500-72 مشاهده شد که دارای بیشترین درصد جوانه­زنی در بین تیمارهای شکست خواب بود. در پیش­تیمار 48 و 72 ساعت با اسید جیبرلیک، با افزایش غلظت هورمون، مقدار فعالیت آلفا آمیلاز در چهار، هشت، 10 و 12 هفته سرمادهی کاهش یافت. همچنین مدت زمان بیشتر قرارگیری بذرها در محلول اسیدجیبرلیک، باعث افزایش فعالیت این آنزیم شد. بذور تیمار شده با اسید جیبرلیک نیز نسبت به تیمار سرمادهی بدون هورمون، مقدار فعالیت آنزیمی بیشتری نشان دادند. بیشترین فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز در تیمار GA500-72 که حداکثر درصد جوانه­زنی را در بین تیمارهای شکست خواب دارا بود مشاهده شد. اعمال تیمارهای هورمونی و سرمادهی بر روی جوانه­زنی بذر سرخ­دار نشان داد که فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز پس از اعمال سرمادهی افزایش پیدا کرد (Zhang & Gao, 2012 ). پیش‌تیمار بذر با اسید جیبرلیک، سبب تسریع فرآیندهای بیوشیمیایی و هیدرولیز قندها  فعال نمودن ژن‌های کدکننده آنزیم‌های دخیل در جوانه‌زنی بذر به‌ویژه Aا آمیلاز می‌شود و بذر را برای جوانه‌زنی آماده‌تر می‌کند
 (Tavili et al., 2008).

جدول 4-  مقایسه میانگین تأثیر غلظت­های مختلف اسید جیبرلیک در زمان­های مختلف پیش­تیمار بر فعالیت آلفا آمیلاز (میلی­گرم بر گرم وزن تر بذر) در بذر آوندول در هر سطح از سرمادهی.

Table 4. Mean comparison of the effect of GA₃ concentrations in different pre-treatment durations at stratification levels on seed α-amylase Activity (mM/gr).

حروف مشابه در هر ستون، نشان دهنده عدم اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد است.

The same letters in the same column indicate no significant difference based on the Duncan test at 5% of probability level.

شاخص­ های جوانه‌زنی

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات ساده اسید جیبرلیک و طول دوره سرمادهی، دماهای جوانه­زنی و برهم­کنش آن‌ها بر صفات درصد جوانه­زنی، طول ریشه­چه و ساقه­چه و بنیه گیاهچه، در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد (جدول5). نتایج جدول تجزیه واریانس برش­دهی نیز نشان داد که برهم­کنش اسید جیبرلیک، طول دوره سرمادهی و دماهای جوانه­زنی بر تمام صفات جوانه­زنی و گیاهچه­ای در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد (جدول 6).

جدول 5- تجزیه واریانس اثر دمای جوانه ­زنی، طول دوره سرمادهی و هورمون اسید جیبرلیک بر شاخص‌های جوانه زنی و گیاهچه­ای بذر آوندول.

Table 5. Variance analysis of the effects of germination temperatures, stratification periods and gibberellic acid hormone on Smyrnium cordifolium Bioss seed germination and seedling

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد.

**: Significant at 1% of probability level.

جدول 6- تجزیه واریانس برش­دهی اسید جیبرلیک و طول دوره سرمادهی برخی صفات جوانه­زنی و گیاهچه­ای اندازه‌گیری شده بذر آوندول در دماهای مختلف جوانه­زنی.

Table 6. Slicing analysis of variance of gibberellic acid and the of stratification periods on some germination and seedling traits of Smyrnium cordifolium Bioss. seeds at different germination temperatures.

**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد.

**: Significant at 1% of probability level.

نتایج مقایسه میانگین برهم­کنش اسید جیبرلیک و طول دوره سرمادهی در دمای پنج درجه سانتی­گراد نشان داد که بذرهای تیمار شده با اسید­جیبرلیک در غلظت 500 میلی‌گرم در لیتر به مدت 72 ساعت (GA500ppm-72h) و 12 هفته سرمادهی، دارای بیشترین درصد جوانه­زنی (55 درصد) بودند که با تیمار 12 هفته سرمادهی بدون هورمون (GA0-48h) اختلاف معنی­داری از لحاظ آماری نشان نداشتند (شکل1). در دمای 10 درجه سانتی­گراد، بیشترین درصد جوانه­زنی در تیمار 12 هفته سرمادهی و بدون هورمون (75/43) و در دمای 15 درجه سانتی­گراد، فقط تیمارهایی با 12 هفته سرمادهی جوانه­زنی داشتند که بیشترین آن در پیش تیمار 48 ساعت با 500 میلی‌گرم در لیتر اسید جیبرلیک (25/26) مشاهده شد. افزایش درصد جوانه­زنی تحت تأثیر اسید جیبرلیک و سرمادهی بر شکست خواب بذرهای آنغوزه، باریجه (Ferula gummosa) و کرفس کوهی (Kelussia odoratissma) (Farhoodi & Makizadeh Tafti, 2015; Sharifi et al, 2016)، کما
(Ferula ovina) (Amoo Aghaie, 2007) ، جاشیر، آنغوزه (Keshtkar et al., 2009)، ریواس
(Rheum ribes L.) (Nabaei et al., 2011) و مریم گلی بنفش (Salvia verticillata L.)
(Khakpoor et al., 2015) نیز گزارش شده است. دلایل متعددی پیرامون تأثیر مثبت سرمادهی بر شکستن خواب و بهبود ویژگی‌های جوانه­زنی بذر گیاهان گفته شده است که از این میان می­توان به تحریک رشد جنین (Baskin & Baskin, 2014)، تحریک تولید اسید جیبرلیک در بذر و نفوذپذیر شدن سلول‌های بذر به اسید جیبرلیک (Fang et al., 2006)، کاهش مقدار اسید آبسیزیک در بذر (Kucera et al., 2005) و ایجاد یک تعادل هورمونی بین اسید جیبرلیک و اسید آبسیزیک در بذر اشاره کرد. مجموع این فرآیندها، زمینه را برای شکستن خواب و شروع فرآیند جوانه­زنی در بذر مهیا می­کنند. سرمادهی بذر آرابیدوبسیس، سبب افزایش رونویسی از ژن­های دخیل در فعالیت اسید جیبرلیک شد و دلیل آن، نقش سرما در شکستن خواب بذر گیاهانی است که غلظت درونی اسید جیبرلیک در بذر آن‌ها برای آغاز فرایند جوانه­زنی کم است
(Yamauchi et al., 2004).

 شکل1- مقایسه میانگین اثر برهم­کنش طول دوره سرمادهی و غلظت­های اسید جیبرلیک در دماهای مختلف جوانه­زنی بر صفت درصد جوانه‌زنی­کل در بذر آوندول. در هر دما، میانگین­های دارای حرف مشابه، در سطح احتمال پنج درصد بر اساس آزمون دانکن با یکدیگر اختلاف معنی­داری ندارند. کدهای تیماری بالای نمودار به‌ترتیب از چپ به راست نشان دهنده غلظت اسید جیبرلیک و زمان پیش­تیمار با اسید جیبرلیک است.

Figure 1. Mean comparison of the interaction effects of the stratification periods and gibberellic acid concentrations at different temperatures on Smyrnium Cordifolium Bioss. seeds germination percentage. In each temperature, means with the same letter are not significantly different at 5% of probability level based on test. The treatments codes above the diagram show gibberellic acid concentration and the pre-treatment duration from left to right.

طبق نتایج مقایسه میانگین (شکل2 A) اثرات برهم­کنش طول دوره سرمادهی و اسید جیبرلیک در دمای 15 درجه سانتی­گراد، بیشترین طول ساقه­چه مربوط به تیمار 12 هفته سرمادهی بدون هورمون با 65/4 میلی­متر بود. در دمای 10 درجه سانتی‌گراد، بیشترین طول ساقه­چه در تیمار GA500ppm-72h با 12 هفته سرمادهی (85/2) مشاهده شد. در دمای پنج درجه سانتی­گراد، تیمار GA1000ppm-48h با 12 هفته سرمادهی بیشترین مقدار طول ساقه­چه را دارا بود که از لحاظ آماری با تیمار 12 هفته سرمادهی اختلاف معنی‌داری نشان نداد. می‌توان گفت که در هر دما، با افزایش طول دوره سرمادهی از هشت هفته به 12 هفته، طول ساقه­چه افزایش یافت. در بررسی اثر برخی تیمارهای پیش‌رویشی برای شکست خواب دو توده زیره سیاه نشان داده شد که با افزایش زمان سرمادهی، طول ساقه­چه افزایش معنی‌داری پیدا کرد
(Nikkhah & Solimani, 2012). تلفیق تیمار اسید جیبرلیک در غلظت­های پایین و سرمادهی مرطوب بر روی بذر سوسن پرویی (Alstroemeria ligtu hybrid) نیز نقش مهمی بر افزایش طول ساقه­چه این گیاه داشت (Nasri et al., 2013). هورمون جیبرلین، تقسیم سلولی را به‌صورت طولی و به‌سرعت افزایش می­دهد و از تنظیم کننده‌های اصلی گسترش دیواره سلولی و در نتیجه رشد می­باشد. این هورمون با افزایش تقسیم سلولی و تحریک طویل شدن سلولی، موجبات رشد گیاه را فراهم می­آورد (Zafariyan & Hoshmand, 2013). همچنین کاربرد اسیدجیبرلیک سبب افزایش طول میان‌گره­ها و در نتیجه افزایش طول ساقه­چه می­شود
(Taylor & Wearing, 1979). سرمادهی نیز تولید مواد تحریک‌کننده رشد نظیر جیبرلین را زیاد می­کند و موجب رسیدن جیبرلین به محل فعالیت­شان می‌شود (Soltanipoor et al., 2010).

شکل2- مقایسه میانگین اثر برهم­کنش طول دوره سرمادهی و غلظت­های اسید جیبرلیک در دماهای مختلف جوانه­زنی بر طول ساقه­چه شکل (A). و  ریشه­چه. شکل (B) در بذر آوندول. در هر دما، میانگین­های دارای مشابه در سطح احتمال پنج درصد بر اساس آزمون دانکن با یکدیگر اختلاف معنی­داری ندارند. کدهای تیماری بالای نمودار به‌ترتیب از چپ به راست، نشان دهنده غلظت اسید جیبرلیک و زمان پیش­تیمار با اسید جیبرلیک است.

Figure 2 Mean comparison of the interaction effects of the stratification periods and gibberellic acid concentrations at different temperatureson plumule (A) and radicle length (B) in Smyrnium cordifolium Bioss. . In each temperature, means with the same letter are not significantly different in 5% of probability level based on Duncan multiple test. The treatments codes above the diagram show the gibberellic acid concentration and pre-treatment duration, from left to right.

بیشترین طول ریشه­چه به‌ترتیب در دمای 15 درجه سانتی­گراد و در تیمار GA500-48 با 12 هفته سرمادهی (57/2 میلی‌متر)، دمای 10 درجه سانتی­گرادو  تیمار GA1500-72 با هشت هفته سرمادهی و در دمای پنج درجه سانتی­گراد و تیمار GA1000-48 با 12 هفته سرمادهی (91/1) مشاهده شد (شکل2 ب). در هر سه دما، 12 هفته سرمادهی، بیشترین اثر را روی طول ریشه­چه‌ نشان داد. در گیاه ازگیل ژاپنی مشاهده شد که سرمادهی مرطوب، خصوصیات رشدی گیاهچه از جمله طول ساقه­چه و ریشه­چه و وزن خشک را به طور معنی­داری افزایش داد (Amoo Aghaie, 2010). در مطالعه­ای بر روی درخت انار مشخص شد که تیمار همزمان سرمادهی و اسید جیبرلیک، سبب افزایش طول و وزن تر ریشه شد (Rawat et al., 2010). سرما و هورمون، دو عامل موثر در جوانه­زنی هستند که باعث جوانه­زنی سریع­تر بذرها و در نتیجه تکمیل سریع‌تر رشد رویشی گیاه می­شوند. در واقع می­توان گفت که بخشی از افزایش این شاخص‌ها، به جوانه­زنی زودهنگام در این تیمارها مربوط است و بخشی دیگر، احتمالاً به دلیل تعدیلات هورمونی ایجاد شده در جهت جوانه­زنی در اثر تیمار پیش سرما می­باشد. اسید جیبرلیک با افزایش کشش دیواره سلولی یعنی انبساط دیواره از طریق هیدرولیز نشاسته به قند که کاهش پتانسیل آب سلول را به دنبال دارد، باعث ورود آب به درون سلول و طویل شدن سلول می­شود (Stuart & Jones, 1977).

در دمای پنج و 10 درجه سانتی‌گراد، بیشترین مقدار بنیه گیاهچه در 12 هفته سرمادهی بدون هورمون مشاهده شد (شکل3). در دمای 15 درجه سانتی­گراد نیز تیمار GA500-72 با 12 هفته سرمادهی، اثر بیشتری بر شاخص بنیه نشان داد. با افزایش زمان سرمادهی در همه دماها، میزان بنیه گیاهچه در همه تیمارهای اعمال شده افزایش پیدا کرد. بعد از تیمار سرمادهی، به­نظر می­رسد با این‌که بعضی از تیمارهای هورمونی، اختلاف معنی‌داری از لحاظ غلظت باهم در زمان پیش تیمار و سرمادهی مربوط به خود ندارند، ولی با افزایش غلظت هورمون از 500 به 1000 و 1500 میلی­گرم در لیتر، صفت بنیه کاهش یافت. گیاهچه­هایی که از بذرهای تیمار شده گیاه نمدار
 ((Tilia platyphyllus Scop، با اسید جیبرلیک و سرما تولید  می­شوند، رشد اولیه بیشتری دارند. تسریع و افزایش در رشد گیاهچه، باعث تسریع در سبز شدن و در نتیجه استقرار بهتر گیاهچه می‌شود (Nasiri, 2006).

تلفیق تیمار اسید جیبرلیک و سرما با یکدیگر، سبب افزایش سرعت جوانه‌زنی، طول گیاهچه و شاخص­ بنیه در گیاه Satureja sahendica  شد (Alizadeh, et al., 2012). اثر تیمارهای مختلف رفع خواب جهت القاء رویش روی چهار گیاه دارویی جنس مرزه (Satureja spp.) مشخص نمود که شاخص بنیه، وزن تر و خشک گیاهچه در دو جمعیت قزوین و لرستان در تیمارهای پس‌رسی و سرمادهی، بیش از سایر تیمارها بهبود یافت (Alizadeh, et al., 2016). تیمار سرمادهی با افزایش تقسیم سلولی و دیگر فعالیت­های متابولیکی، باعث افزایش طول ساقه‌چه و ریشه‌چه می‌شود که خود از دلایل افزایش بنیه گیاهچه است. سرمادهی بر فعالیت­های فیزیولوژیکی بذر مؤثر است و از طرفی اسید جیبرلیک، باعث افزایش درصد جوانه­زنی و طول گیاهچه و در نهایت بنیه گیاهچه می­شود (Golmohamdzadeh et al., 2015).

نتیجه­گیری کلی

نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که در همه دماها، با افزایش زمان سرمادهی، شاخص­های جوانه­زنی اندازه­گیری شده افزایش یافتند. همچنین پیش تیمار بذر با اسید جیبرلیک، باعث افزایش فعالیت آلفا آمیلاز در همه زمان­های سرمادهی شد. پیش­تیمار بذر با هورمون در زمان­های سرمادهی دو، چهار، شش و هشت هفته در مقایسه با تیمار بدون سرمادهی، سبب بهبود محتوی پراکسیدهیدروژن بذر شد. به‌طورکلی نتایج این آزمایش نشان داد که پیش­تیمار بذر به مدت 72 ساعت با 500 میلی­گرم اسید جیبرلیک در لیتر و 12 هفته سرمادهی و دمای پنج درجه سانتی­گراد، باعث افزایش درصد جوانه­زنی بذر آوندول می­شود.