بررسی خصوصیات فیزیولوژیک، فعالیت آنزیمی و کیفیت نعناع‌فلفلی تحت تاثیر اسید سالیسیلیک، سولفات روی و تنش آبی

مقدمه

نعناع ­فلفلی (Mentha piperita L.) از خانواده نعنائیان (Lamiaceae) با نام رایج پپرمینت[1]، یکی از گیاهان مهم دارویی است. این گیاه بومی اروپا است و کشت آن در سرتاسر جهان گسترش پیدا کرده است و به عنوان طعم دهنده در آدامس سازی، صنایع آرایشی،  دارویی و غیره استفاده می­شود (Çoban & Baydar, 2016; De Sousa Guedes et al., 2016). این گونه، دورگه طبیعی بین گونه های M. aquticaو
M. spicata می­باشد و تعداد کروموزوم آن با 2n بین 66، 72، 84 و 120 متغیر است (Çoban & Baydar, 2016). نعناع­فلفلی در اکثر نواحی زمین پراکنده است، ولی بیشینه انتشار آن در نواحی مدیترانه‌ای می­باشد. بر اساس مطالعات  انجام شده، ماده موثره اصلی گونه M. piperita، منتول (55-30 درصد) است و از سایر ترکیب‌‌ها می­توان به متیل استات (4/17 درصد) و منتون (7/12 درصد) پلی­گن، منتوفوران، لیمونن و لیمون اشاره کرد. در بین متابولیت­های دومی تولید شده در این گیاه، ترپن­ها سهم عمده­ای را به خود اختصاص داده­اند (Hasani et al., 2015; Çoban & Baydar, 2017). نعناع­فلفلی یکی از گیاهان مهم دارویی است، اما مصرف بالای آب می­تواند یکی از تنگناهای کشت این گیاه برجسته در کشور باشد. با توجه به روند روز افزون کشت نعناع­فلفلی در ایران و حجم بالای مصرف آب، ظاهرا می­توان با کمک روش‌هایی از قبیل مصرف اسید سالیسیلیک و سولفات روی، میزان مصرف آب را کاهش داد.

امروزه با افزایش جمعیت و نیاز به غذا و محدودیت منابع آب، ارزش این ماده بیش از پیش روشن شده است. بیشتر از آن‌چه افزایش عملکرد در واحد سطح مد نظر باشد، افزایش عملکرد در واحد حجم آب مصرفی اهمیت یافته است (Keshavarz, 2020). تنش آبی در گیاهان، باعث تولید گونه­های فعال اکسیژن می­شود. برآورد شده که تقریباً یک درصد از اکسیژن مصرفی در گیاه، صرف تولید ROS در قسمت­های مختلف سلول می­شود (Cruz de Carvalho et al., 2012). سامانه­های آنتی‌اکسیدان در سلول‌های گیاهی، غالباً در مواجه گیاه با تنش‌های محیطی افزایش می‌یابد و از این طریق گیاهان قادرند از خسارت ROS های ایجاد شده بکاهند (Rasool et al., 2013). ازجمله آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان می­توان به سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز و آنزیم‌های چرخه گلوتاتیون‌آسکوربات شامل آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز، دهیدروآسکوربات ردوکتاز، مونو­ دهیدروآسکوربات ردوکتاز و آنزیم‌های گلوتاتیون رداکتاز اشاره کرد که نقش اساسی در متابولیزه کردن ROS و جلوگیری از خسارات ناشی از تنش اکسیداتیو به عهده دارند (Foyer and Noctor, 2013).

رشد و نمو گیاهان، علاوه بر فراهمی عناصر پر مصرف مانند نیتروژن، به فراهمی عناصر کم مصرف نیز بستگی دارد. با توجه به نقش روی در فعالیت آنزیمی گیاه، عرضه این عنصر از طریق محلول‌پاشی می­تواند تأثیر به­سزایی در کیفیت و کمیت تولید محصولات داشته باشد (Rasool et al., 2013). کمبود ریزمغذی­ها در اغلب گیاهان، گسترش جهانی دارد. کشت مداوم، آهکی بودن خاک­ها و عدم مصرف کودهای حاوی عناصر غذایی لازم، از جمله عوامل بروز کمبود روی در اغلب خاک­های ایران می­باشد. روی از جمله عناصر ضروری و کم مصرف برای گیاهان است که به صورت کاتیون دو ظرفیتی (Zn⁺²) جذب می‌شود و در تشکیل اسید ایندول استیک دخالت داشته و رشد گیاه را تنظیم می­کند (Bagheri Kholenjani, 2011). وقتی که کمبود عناصر غذایی به‌وسیله کاربرد عناصر غذایی از طریق خاک امکان­پذیر نباشد، محلول‌پاشی عناصر غذایی، یک انتخاب است (Keshavarz, 2020). یکی از راه­های تامین روی مورد نیاز گیاه، محلول‌پاشی سولفات روی است روی عنصری است که قادر به انتقال مجدد در درون گیاه نیست، بنابراین محلول‌پاشی آن مناسب­تر می‌باشد (Bagheri Kholenjani, 2011).

اسید سالیسیلیک از عوامل موثر بر رشد و نمو گیاهان می­باشد. این ماده نوعی تنظیم کننده­ی رشد درونی و از گروه ترکیبات فنلی طبیعی می­باشد که در تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاه نقش دارد. القای گل­دهی، رشد و نمو، سنتز اتیلین، تأثیر در باز و بسته شدن روزنه­ها و تنفس، از نقش­های مهم اسید سالیسیلیک به‌شمار می­رود. اسیدسالیسیلیک باعث طویل شدن سلول‌ها و همچنین تقسیم سلولی می‌شود که این فرآیند با همکاری سایر تنظیم کننده‌ها از جمله اکسین انجام می­شود (Kabiri, 2011). مقدار زیادی اسید سالیسیلیک در نمونه­های خاک محتوی ریزوسفر گزارش شده است. از جمله کاربردهای مهم اسید سالیسیلیک، کاهش اثر مضر تنش آبی و کم آبی می­باشد (Kabiri, 2011). در خصوص اثر اسید سالیسیلیک بر کاهش اثر منفی تنش آبی و افزایش عملکرد کمی و کیفی، مطالعات متعددی انجام شده است که همگی حاکی از اثر مثبت اسید سالیسیلیک بر کاهش اثر مضر تنش آبی است
 (Dolatabadian et al., 2008; Kabiri, 2011).

هدف از انجام این تحقیق، بررسی اثر اسید سالیسیلیک و روی بر خصوصیات فیتوشیمیایی و عملکرد نعناع­فلفلی در شرایط تنش آبی بود.

مواد و روش­ها

مکان اجرای آزمایش

این آزمایش در مزرعه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، در فاصله هفت کیلومتری شهر ورامین، با مختصات جغرافیایی "40 ˚51 طول شرقی و "17 ˚35 عرض شمالی و ارتفاع حدود 1000 متر از سطح دریا، در سال 1397 انجام شد. شکل‌ 1 میانگین بارندگی و دمای شهرستان ورامین در سال‌های آزمایش رانشان می‌دهد. در مرداد، میزان بارش در کمترین حد خود قرار داشت که میانگین آن صفر میلی‌متر بود و بیشترین میزان بارش در دی ماه رخ داد. با دمای میانگین 5/29 درجه سانتی­گراد، تیر ماه گرم ترین ماه سال بود. دی ماه با 3/3 درجه سانتی­گراد، کمترین میانگین دما را در تمام سال داشت.

شکل 1- نمودار بلند مدت دما و بارندگی شهرستان ورامین.

Figure 1. Long term temperature and rainfall diagram in Varamin.

طرح آزمایش

آزمایش بصورت اسپلت فاکتوریل در قالب بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. این آزمایش دارای سه فاکتور، شامل 50، 70 و 90 میلی‌متر تبخیر از تشتک کلاس A در کرت­های اصلی و محلول‌پاشی  اسید سالیسیلیک در دو سطح صفر و یک میلی مولار و محلول‌پاشی سولفات روی با مقادیر صفر، دو و چهار گرم در لیتر قرار  در کرت‌های فرعی بود.

عملیات زراعی

پیش از کشت، عملیات آماده سازی زمین شامل شخم، دیسک و تسطیح انجام شد. سپس از عمق 30 سانتیمتری خاک محل اجرای آزمایش، نمونه­گیری مرکب به عمل آمد تا برخی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک و عناصر غذایی آن اندازه­گیری شود. پس از در آوردن شیارها، نقشه آزمایش بر روی زمین پیاده شد. فاصله بوته­ها روی خطوط 30 سانتی متر و بین ردیف­های کاشت 40 سانتی­متر بود. طول هر خط کاشت، چهار متر و هر کرت دارای چهار خط کاشت بود و فاصله بین دو تکرار دو متر بود. نشاءها از مرکز تحقیقات کشاورزی شهرستان کرج (استان البرز) تهیه شدند. تنش آبی بر اساس تشتک­های تبخیر نصب شده در زمین، سه هفته پس از کاشت نشاءها اعمال شد و تا پایان فصل رشد ادامه یافت.

صفات مورد ارزیابی

صفات مورد ارزیابی در این پژوهش در مزرعه و در آزمایشگاه، با استفاده از ابزارهای مورد نظر اندازه­گیری شدند. اندازه‎گیری محتوای نسبی آب برگ (RWC) به روش Richie et al. (1990) انجام شد و اندازه­گیری منتول در عصاره هیدروالکلی نعناع­فلفلی انجام گرفت. برای اندازه­گیری پارامترهای رشد، در شروع گلدهی، گیاهان کف بر شدند و وزن اندم هوایی آن‌ها با ترازوی دیجیتالی با دقت یک هزارم اندازه‌‌گیری شد. برای اندازه‌گیری وزن خشک، نمونه‌‌ها در آون 90 درجه به مدت 24 ساعت قرار گرفتند و سپس وزن خشک آن‌ها تعیین شد. در مرحله گلدهی کامل، با استفاده از یک کوادرات یک متر مربعی، بوته‌های وسط هر کرت مشخص، از سطح خاک کف بر و در سایه خشک شدند. بعد از اندازه‌گیری وزن، عملکرد زیستی به کیلوگرم در هکتار تعمیم داده شد. اندازه‌‌گیری آسکوربات کل، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز نیز با روش­های آزمایشگاهی انجام شد.

استخراج فعالیت‌های آنزیمی با استفاده از روش Mishra & Kar (1976) صورت گرفت. مقدار 05/0 گرم بافت در هاون چینی سرد با دو میلی‌لیتر بافر فسفات مونوسدیک 1/0 مولار با اسیدیته 8/6 هموژن شد. هموژن حاصل به مدت 15 دقیقه با شتاب g16000 در دمای چهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. از روشناور (سوپرناتانت) به‌دست آمده برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌ها و همچنین مقدار پروتئین‌های محلول استفاده شد. میزان پروتئین محلول به روش Bradford (1976) اندازه‌گیری شد.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نیز اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش به حجم نهایی دو میلی‌لیتر شامل‌بافر فسفات مونو‌سدیک 250 میلی مولار، اسید آسکوربیک 5/0 میلی‌مولار، EDTA 1/0میلی‌مولار، آب اکسیژنه 2/1 میلی‌مولار و 200 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. محلول بلانک، فاقد آب اکسیژنه بود و کاهش جذب نور ناشی از پراکسیداسیون اسید آسکوربیک در طول موج290 نانومتر، به مدت سه دقیقه ثبت شد. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی معادل با
 mM^-1 cm^-1 2/8 مربوط به آسکوربات محاسبه شد (Asada and Nakano, 1981).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز با استفاده از روش Maehly & Chance  (1954) و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پلی‌فنل‌اکسیداز بر اساس روش Maehly & Chance  (1954) همراه با تغییراتی انجام شد. مخلوط واکنش آنزیم کاتالاز، به حجم نهایی سه میلی‌لیتر شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، آب اکسیژنه 15 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود‌. با اضافه کردن عصاره آنزیمی به مخلوط واکنش، تجزیه H₂O₂ شروع شد. ضریب خاموشی برای H₂O₂ در طول موج 240 نانومتر mM^-1.cm^-140 بود که از آن برای محاسبه فعالیت آنزیم استفاده شد.

مخلوط واکنش آنزیم گایاکول پراکسیداز، به حجم نهایی سه میلی‌لیتر شامل بافر فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، گایاکول 20 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 40 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. ضریب خاموشی تتراگایاکول در طول موج 470 نانومتر  mM^-1.cm^-16/26 بود که از آن برای محاسبه فعالیت آنزیم استفاده شد. مخلوط واکنش آنزیم پلی‌فنل‌اکسیداز به حجم نهایی سه میلی‌لیتر، شامل بافر ‌فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، پیروگالل 10 میلی‌مولار و200 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. فعالیت

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) اثر تنش کم آبی، سولفات روی و اسید سالیسیلیک بر صفات مختلف نعناع­فلفلی.

Table 1. Variance analysis (mean squares) of water deficit stress, zinc sulfate and salicylic acid effects on various traits of peppermint.

Relative Water Content 

Superoxide dismutase-peroxidase

Catalase

Ascorbate peroxidase

Total ascorbate 

Menthol

Biological yield

Maturity

Maturity

*،** و ns: به‌ترتیب معنی‌دار در سطح پنج و یک درصد و عدم تفاوت معنی‌دار.

*, ** and ns: significant at 5% and 1% of probability levels and non significant, respectively. 

آنزیم در طول موج 420 نانومتر اندازه‌گیری شد و ضریب خاموشی برای پورپوروگالین تولید شده mM^-1.cm^-1 2/47 بود که برای برآورد فعالیت آنزیم به‌کار رفت (Resende et al., 2002).

برای اندازه‌گیری منتول در عصاره هیدروالکلی نعناع­فلفلی، ابتدا 200 سی سی عصاره تقطیر شد و 100 سی سی فاز الکلی به‌دست آمده را جدا شد و دوباره تقطیر ادامه یافت تا حدود 70 سی سی آب موجود در عصاره تا جایی که ممکن بود تقطیر شود. کل فاز آبی در طی سه مرحله و هر مرحله با 20 سی سی نرمال پنتان استخراج شد و فاز آلی را جدا کرد و در نهایت فازهای آلی با هم مخلوط شدند (حدود 600 سی سی). فاز آلی زیر گاز هلیم با دمای 60 درجه سانتیگراد  تبخیر شد تا حجم آن به 100 سی­سی برسد. در آخر، 10 سی­سی باقیمانده با 100 سی­سی فاز الکلی به‌دست آمده در مراحل اول، به‌خوب ترکیب شد و حدود دو سی­سی از آن­ از فیلتر سر سرنگی و بعد از سدیم سولفات عبور داده شد و به ویال­های دو سی­سی انتقال یافت و محلول صاف شد. هنگام صاف کردن، مقداری سدیم سولفات روی کاغذ صافی ریخته شد تا محلول صاف و آب‌گیری شود. بعد از آن، حدود دو سی سی از آن با فیلتر سرسرنگی به داخل ویال دو سی سی و یک میکرولیتر از آن­ به GC  تزریق شد (Resende et al., 2002).

تجزیه و تحلیل داده‏ها

جهت مرتب کردن داده­ها از Excel و برای تجزیه و تحلیل آمار داده­های حاصل از نمونه برداری، از برنامه آماری SAS استفاده شد. مقایسه میانگین صفات مورد نظر با آزمون چند دامنه­ای دانکن انجام شد.

نتایج و بحث

سوپر اکسید دیسموتاز- پراکسیداز

نتایج نشان داد که اثر اصلی تنش آبی و اسید سالیسیلیک بر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز- پراکسیداز معنی‌دار بود، ولی سایر تیمارها تاثیری بر سوپر اکسید دیسموتاز- پراکسیداز نداشتند (جدول 1). تنش آبی 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر با فعالیت سوپراکسید دیسموتاز-پراکسیداز 29/28 میلی­مول بر میلی­گرم پروتئین، موجب افزایش 27 درصدی این صفت نسبت به تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر شد (جدول 2). با مصرف اسید سالیسیلیک، سوپر اکسید دیسموتاز- پراکسیداز به میزان 17/27 میلی­مول بر میلی­گرم پروتئین به‌دست آمد که 15 درصد بیشتر از حالت عدم مصرف بود (جدول 2).

جدول 2- مقایسه میانگین صفات اندازه­گیری شده تحت تأثیر اثرات اصلی تنش­کم­آبی، محلول­پاش سالیسیلیک اسید و سولفات روی.

Table 2. Mean comparison of the effects of water deficit stress and foliar application of zinc sulfate and salicylic acid treatment on various traits of peppermint.

Treatment

Dosage 

water stress (mm evaporation from evaporation pan)

Zinc sulfate (g L

)

Salicylic acid (mM)

در هر ستون و برای هر یک از فاکتورهای آزمایش،  میانگین‌های دارای حداقل یک حرف مشترک، از لحاظ آماری بر اساس آزمون دانکن، اختلاف معنی‌داری در سطح پنج درصد ندارند.

Means with the same letters in the same column are not significantly different based on Duncan test at 5% of probability level.

کاتالاز

نتایج نشان داد که اثر اصلی و برهمکنش تمامی تیمارها غیر از برهمکنش تنش آبی در اسید سالیسیلیک، بر کاتالاز معنی‌دار بود (جدول 1). نتایج نشان داد که بیشترین فعالیت کاتالاز در تیمار مصرف چهار گرم روی در لیتر به همراه مصرف اسید سالیسیلیک و در تیمار تنش 50 میلی‌متر تبخیر از تشتک تبخیر به مقدار 24/1 میلی­مول بر میلی­گرم پروتیئن حاصل شد. کمترین مقدار نیز در تیمار عدم مصرف روی و اسید سالیسیلیک و در حالت تنش 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر به مقدار 64/0 میلی­مول بر میلی­گرم پروتیئن به‌دست آمد که نسبت به حداکثر میزان کاتالاز، 48 درصد کاهش نشان داد. در تمامی سطوح تنش آبی، مصرف اسید سالیسیلیک و سولفات روی، موجب افزایش مقدار کاتالاز شد (شکل 2).

آسکوربات پراکسیداز  

نتایج نشان داد که اثر اصلی و متقابل تمامی تیمارها غیر از اثر متقابل تنش آبی در اسید سالیسیلیک، بر آسکوربات پراکسیداز  معنی‌دار بود (جدول 1). نتایج نشان داد که بیشترین مقدار آسکوربات پراکسیداز، از تیمار چهار گرم روی در لیتر به همراه مصرف اسید سالیسیلیک و در تیمار تنش 90 میلی‌‌متر تبخیر از تشتک تبخیر به مقدار 63/1 مولار به دست آمد و کمترین آن نیز در تیمار عدم مصرف روی و اسید سالیسیلیک و در حالت تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر به مقدار 53/0 واحد بر میلی‌گرم پروتئین تولید شد که نسبت به حداکثر میزان، 65 درصد کاهش نشان داد. در تمامی سطوح تنش آبی، مصرف اسید سالیسیلیک و سولفات روی، موجب افزایش میزان آسکوربات پراکسیداز  شد (شکل 3).

شکل 2- اثر متقابل تنش آبی، اسید سالیسیلیک و سولفات روی بر میزان کاتالاز  نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 2. Interaction effects of water stress, salicylic acid and zinc sulfate on peppermint catalase (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

شکل 3- اثر متقابل تنش آبی، اسید سالیسیلیک و سولفات روی بر آسکوربات پراکسیداز نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 3. Interaction effects of water stress, salicylic acid and zinc sulfate on Peppermint ascorbate peroxidase (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

آسکوربات کل

نتایج این بررسی نشان داد که اثر اصلی سولفات روی بر فعالیت پراکسیداز  معنی‌دار بود (جدول 1). با مصرف چهار گرم سولفات روی در لیتر، آسکوربات کل به 95/1 میلی­مول بر میلی­گرم پروتیئن رسید که 18 درصد بیشتر از حالت عدم مصرف بود.

منتول

نتایج این بررسی نشان داد که اثر اصلی تنش آبی، اثرات اصلی سولفات روی و اسید سالیسیلیک و اثر متقابل روی در اسید سالیسیلیک بر قندهای محلول معنی‌دار بود ولی سایر تیمارها، تاثیری بر منتول نداشتند (جدول 1). در خصوص اثر متقابل تنش و سالیسیلیک، نتایج نشان داد که 9/15 درصد منتول در شرایط مصرف اسید سالیسیلیک و تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر تولید شد که بیشترین مقدار بود و کمترین مقدار نیز در تیمار تنش 90 میلیمتر و عدم مصرف اسید سالیسیلیک حاصل شد که نسبت به حداکثر آن، 25 درصد کاهش نشان داد. در تمامی سطوح تنش، همواره مصرف اسید سالیسیلیک موجب افزایش منتول شد (شکل 4).

شکل 4- اثر متقابل تنش آبی و اسید سالیسیلیک بر منتول نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 4. Interaction effects of drought stress and salicylic acid on peppermint menthol (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

عملکرد زیستی

نتایج این بررسی نشان داد که اثرات اصلی تنش آبی، سولفات روی و اسید سالیسیلیک و اثر متقابل تنش آبی در سولفات روی و  روی در اسید سالیسیلیک بر عملکرد زیستی معنی‌دار بود ولی سایر تیمارها تاثیری بر عملکرد زیستی نداشتند (جدول 1). نتایج نشان داد که عملکرد زیستی در تیمار مصرف چهار گرم روی در لیتر و تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر بیشترین (8/973  کیلوگرم در هکتار) بود اما در تیمار عدم مصرف روی و تنش 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر، کمترین بود که نسبت به حداکثر میزان عملکرد زیستی، 31 درصد کاهش نشان داد. در تمامی سطوح تنش، همواره مصرف سولفات روی موجب افزایش عملکرد زیستی شد (شکل 5).

محتوی نسبی آب در مرحله ساقه رفتن

نتایج این بررسی نشان داد که اثر اصلی تنش آبی، سولفات روی و اسید سالیسیلیک بر محتوی نسبی آب در مرحله ساقه رفتن معنی‌دار بود، ولی سایر تیمارها تاثیری بر محتوی نسبی آب در مرحله ساقه رفتن نداشتند (جدول 1).  تنش آبی 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر با مقدار محتوی نسبی آب در مرحله ساقه رفتن، 2/40 درصد بود که موجب کاهش 25 درصدی این صفت نسبت به تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر شد (جدول 2). بیشترین محتوی نسبی آب در مرحله ساقه رفتن، در تیمار چهار گرم سولفات روی در لیتر به مقدار 4/47 درصد بود. با مصرف اسید سالیسیلیک، محتوی نسبی آب در مرحله ساقه رفتن، 4/46 درصد بود که نه درصد بیشتر از حالت عدم مصرف بود (جدول 2).

محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی

اثر اصلی تنش آبی، سولفات روی و اسید سالیسیلیک و اثر متقابل تنش آبی در اسید سالیسیلیک و سولفات در تنش آبی بر محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی معنی‌دار بود (جدول 1).  محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی در تیمار مصرف دو گرم روی در لیتر و تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر، 38/61 بود که بیشترین میزان را داشت. کمترین مقدار نیز در تیمار عدم مصرف روی و تنش 90 میلی‌متر تبخیر از تشتک تبخیر به‌دست آمد. در تمامی سطوح تنش، همواره مصرف سولفات روی، موجب افزایش محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی شد (شکل 6). محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی در تیمار مصرف یک میلی مولار اسید سالسیلیک و تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر، 4/54 درصد بود که بیشترین مقدار را داشت. کمترین مقدار نیز در تیمار عدم مصرف و تنش 90 میلی‌متر تبخیر از تشتک تبخیر حاصل شد که نسبت به حداکثر میزان، 37 درصد کاهش نشان داد (شکل 7).

شکل 5- اثر متقابل تنش آبی و سولفات روی بر عملکرد زیستی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 5. Interaction effects of drought stress and zinc sulfate on peppermint biological yield (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

شکل 6- اثر متقابل تنش آبی و سولفات روی بر محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 6. Interaction effects of drought stress and zinc sulfate on peppermint water content at flowering stage (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

شکل 7-اثر متقابل تنش آبی و اسید سالیسیلیک بر محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 7. Interaction effects of drought stress and salicylic acid on peppermint water content at flowering stage (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

محتوی نسبی آب در مرحله رسیدگی

اصلی تنش آبی، سولفات روی و اسید سالیسیلیک و اثر متقابل سولفات روی و تنش آبی بر محتوی نسبی آب در مرحله رسیدگی معنی‌دار بود ولی سایر تیمارها تاثیری بر محتوی نسبی آب در مرحله گلدهی نداشتند (جدول 1). بیشترین نسبی آب در مرحله رسیدگی، در تیمار مصرف چهار گرم روی در لیتر و تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر، به میزان 3/72 درصد به‌دست آمد و کمترین مقدار نیز در تیمار عدم مصرف روی و تنش 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر مشاهده  شد که نسبت به میزان حداکثر، 35 درصد کاهش نشان داد. در تمامی سطوح تنش، همواره مصرف سولفات روی موجب افزایش محتوی نسبی آب در مرحله رسیدگی شد (شکل 8).

شکل 8-  اثر متقابل تنش آبی و سولفات روی بر محتوی نسبی آب در مرحله رسیدگی نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 8. Interaction effects of drought stress and zinc sulfate on peppermint water content at flowering stage (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

ماده خشک در مرحله ساقه رفتن

اثر اصلی و متقابل تمامی تیمارها بر ماده خشک در مرحله ساقه رفتن معنی‌دار بود (جدول 1). بیشترین میزان ماده خشک (3/173 کیلوگرم در هکتار) در مرحله ساقه رفتن در تیمار چهار گرم روی به همراه مصرف اسید سالیسیلیک و در تیمار تنش 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر مشاهده شد. کمترین میزان (4/57 کیلوگرم در هکتار) نیز از تیمار عدم مصرف روی و اسید سالیسیلیک و در حالت تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر به‌دست آمد که نسبت به میزان حداکثر، 37 درصد کاهش نشان داد. در تمامی سطوح تنش آبی، مصرف اسید سالیسیلیک و روی، موجب افزایش مقدار ماده خشک در مرحله ساقه رفتن شد (شکل 9).

شکل 9- اثر متقابل تنش آبی، اسید سالیسیلیک و سولفات روی بر آسکوربات پراکسیداز در نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 9. Interaction effects of drought stress, salicylic acid and zinc sulfate on peppermint ascorbate peroxidase (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

ماده خشک در مرحله گلدهی

اصلی سولفات روی و اسید سالیسیلیک بر ماده خشک در مرحله گلدهی معنی‌‌دار بود ولی سایر تیمارها تاثیری بر ماده خشک در مرحله گلدهی نداشتند (جدول 1). با مصرف اسید سالیسیلیک، 3/435 کیلوگرم در هکتار ماده خشک در مرحله گلدهی  به دست آمد که 21 درصد کمتر از حالت عدم مصرف بود (جدول 2). با مصرف سولفات روی به میزان دو گرم در لیتر، 7/448 کیلوگرم ماده خشک در هکتار در مرحله گلدهی به دست آمد که 24 درصد کمتر از حالت عدم مصرف بود (جدول 2).

ماده خشک در مرحله رسیدگی

اثر اصلی تنش، سولفات روی و اسید سالیسیلیک و اثر متقابل تنش آبی در سولفات روی و سولفات روی در اسید سالیسیلیک بر ماده خشک در مرحله رسیدگی معنی‌دار بود ولی سایر تیمارها، تاثیری بر ماده خشک در مرحله رسیدگی نداشتند (جدول 1). ماده خشک در مرحله رسیدگی در تیمار دو گرم روی در لیتر و تنش 50 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر بیشترین (4/976 کیلوگرم در هکتار) و در تیمار عدم مصرف روی و تنش 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر، کمترین بود. در تمامی سطوح تنش، همواره مصرف سولفات روی موجب افزایش ماده خشک در مرحله رسیدگی شد (شکل 10). ماده خشک در مرحله رسیدگی در تیمار مصرف یک میلی مولار و دو گرم روی در لیتر به بیشترین میزان (3/823 کیلوگرم در هکتار) رسید و کمترین مقدار نیز در تیمار عدم مصرف و تنش 90 میلیمتر تبخیر از تشتک تبخیر مشاهده شد (شکل 11).

تنش رطوبتی با کاستن از جذب عناصر غذایی و آب، بر رشد و نمو تأثیر دارد و برگ­ها را کوچک می‌کند، ارتفاع بوته‌­ها و عملکرد محصول را کاهش می‌دهد. محققین دلیل کاهش وزن خشک اندام های هوایی در شرایط تنش خشکی را کاهش سطح برگ دانستند که باعث کاهش دریافت نور و میزان فتوسنتز می­شود. همچنین کاهش میزان فتوسنتز به علت بسته شدن روزنه­ها تحت شرایط تنش خشکی را به عنوان یکی از عوامل مهم کاهش میزان تولید ماده خشک در گیاهان مطرح کرده اند (Bahamin et al., 2019). پیش تیمار کردن بذر با هورمون­های رشد گیاهی، نه تنها جوانه‌زنی و سرعت سبز شدن، بلکه رشد و عملکرد نهایی گیاه را تحت شرایط معمولی و تنش افزایش می­دهد. Dolatabadian et al. (2008) بیان کردند که سالیسیلیک اسید می­تواند نقش مهمی در ایجاد مقاومت به تنش­های محیطی ایفا کند.

شکل 10- اثر متقابل تنش آبی و سولفات روی ماده خشک نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 10. Interaction effects of drought stress and and zinc sulfate on peppermint water content at flowering dry matter (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

شکل 11- اثر متقابل اسید سالیسیلیک و سولفات روی بر محتوی نسبی آب در مرحله رسیدگی نعناع­فلفلی (ستون­های دارای حروف مشترک، اختلاف آماری معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح پنج درصد ندارند).

Figure 11. Interaction effects of drought stress and and zinc sulfate on relative water content of peppermint at flowering stage (columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at the 5% of probability level).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی نشان داد که در اثر بروز تنش خشکی، فعالیت این آنزیم­ها افزایش یافته است. افزایش این آنزیم­ها در تیمار تنش، به خاطر نقش مهم آن‌ها در مقابله با رادیکال‌های آزاد تشکیل شده در اثر تنش خشکی است. ROS ها به برخی از ترکیبات سلولی نظیر لیپیدها، کربوهیدرات­ها و پروتئین­ها آسیب می­رسانند که در نهایت به مرگ سلول منتج خواهد شد. آنزیم‌های آنتی اکسیدان، یکی از اجزای مهم در سازوکار دفاعی گیاهان در نظر گرفته می­شود. به­غیر از کاتالاز، در بقیه موارد، فعالیت آنزیم­ها با مصرف سلنیوم نیز بیشتر شده است. از لحاظ مقدار، GPX بالاترین مقدار آنزیم را به‌خود اختصاص داده‌اند. در شرایط استفاده از سلنیوم و تنش آبی، بالاترین فعالیت آنزیم GPX را داشتند. همچنین نتایج Yazdan Panah (2015) نشان داد که تنش خشکی، سبب افزایش فعالیت آنزیم­های سوپر اکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز می­شود.

نتایج در خصوص میزان فعالیت آنزیم کاتالاز با نتایج Yazdan Panah (2015) مطابقت دارد. محققان میزان فعالیت دو آنزیم کاتالاز و سوپر اکسید را در دو گونه خزه مقاوم و حساس به خشکی در شرایط تنش خشکی بررسی کردند. نتایج این آزمایش نشان داد که افزایش تنش خشکی در گونه مقاوم به خشکی خزه، سبب کاهش پراکسیداسیون چربی ها و برعکس، افزایش فعالیت دو آنزیم گفته شده می‌شود و درست عکس نتایج در مورد خزه حساس به خشکی صادق است. تنش آبی موجب کاهش عملکرد تر و خشک و عملکرد اسانس شده است، زیرا وقتی گیاه با تنش آبی رو به رو شود، روزنه­هایش بسته یا نیمه بسته می‌‍شوند و این امر موجب کاهش جذب دی‌اکسیدکربن می‌شود. از طرفی، گیاه مقدار زیادی انرژی برای جذب آب هزینه می­کند و از سویی دیگر برای کاهش تبخیر و تعرق، سطح برگ را هم کاهش می­دهد و این خود منجر به کاهش تولید مواد فتوسنتزی می­شود (Sirousmehr et al., 2014). تمام این اتفاقات که در اثر تنش رطوبتی در گیاه رخ می‌دهند، موجب کاهش عملکرد می­شوند (Farooq et al., 2009). تنش آبی از طرفی، موجب افزایش درصد اسانس بوته و درصد اسانس برگ شده است، زیرا شرایط تنش، تولید و نگهداری مواد ثانویه در گیاه را افزایش می­دهد. این مواد چون از اکسیداسیون درونی سلول­ها جلوگیری می­کنند، در شرایط تنش افزایش می‌‌یابند (Fathi & Tari, 2016). تنش آبی بر متابولیسم گیاه اثر می­گذارد؛ از جمله این‌که تولید پروتئین­ها و آنزیم­ها دچار اختلال می­شوند. در این شرایط، در اثر افزایش تجزیه کربوهیدرات­ها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک، تولید آلکالوئیدها، اسانس­ها و مواد معطر گیاهان افزایش می­یابد (Sirousmehr et al., 2014). افزایش درصد اسانس در بوته و برگ، موجب افزایش عملکرد اسانس نمی‌شود، چرا که کاهش عملکرد خشک گیاه بر اثر تنش، از افزایش عملکرد اسانس جلوگیری می‌کند. افزایش درصد اسانس بر اثر تنش آبی، در برگ ها از بوته‌ها مشهودتر است. با توجه به این‌که عمده اسانس موجود در گیاه نعناع­فلفلی در گل‌هاست (چهار تا شش درصد) و ساقه حاوی اسانس نمی­باشد و به دلیل این‌که اثر تحلیلی تنش، ابتدا روی گل­ها و سپس روی برگ­ها و پس ازآن روی ساقه بروز می­کند، حداقل اثر کاهش وزن خشک در بین بخش­های گیاه، در ساقه بروز می­کند که عمده وزن خشک بوته را در هر شرایطی تشکیل می­دهد، بنابراین در شرایط تنش، افزایش درصد اسانس در بوته، کمتر از برگ­ها است. بدین معنی که چون اثر تحلیل دهندگی تنش آبی روی رشد زایشی بیشتر از رشد رویشی است، نسبت گل­ها به ساقه در شرایط تنش کاهش می­یابد و بنابراین میزان افزایش درصد اسانس در شرایط تنش در بوته کمتر از برگ‌­ها است (Rahimi et al., 2017).

نتیجه‌گیری کلی

نتایج نشان داد که تنش آبی، منجر به کاهش عملکرد گیاه نعناع­فلفلی شد اما سولفات روی و اسید سالیسیلیک، سبب کاهش اثر مضر تنش آبی شدند. با توجه به نتایج به‌دست آمده خصوصا در مورد منتول و ماده خشک تولیدی به عنوان مهم‌ترین صفات در هر سه سطح تنش خشکی، استفاده همزمان از سالیسیلیک اسید یک میلی مولار و چهار گرم سولفات روی در هکتار توصیه می­شود. به‌طورکلی نتایج نشان داد که مصرف سولفات روی و اسید سالیسیلیک می­تواند در افزایش فعالیت آنزیم­ها و نیز افزایش مقدار منتول در گیاه نعناع­فلفلی موثر باشد که منتول در صنایع داروسازی کاربرد مهمی دارد.