سامانه پشتیبانی خدمات اطلاعات

  اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات158
تعداد شماره‌ها6,225
تعداد مقالات67,685
تعداد مشاهده مقاله114,983,974
تعداد دریافت فایل اصل مقاله89,655,800
عارف پژوهی, رضا, زهرائی صالحی, تقی, مصوری, نادر, صالحی نجف آبادی, زهرا, یحیی رعیت, رامک. (1400). کلون و بیان پروتئین حدت CFP-10 مایکوباکتریوم بویس سویه AN5. , 76(1), 124-132. doi: 10.22059/jvr.2019.281406.2932
رضا عارف پژوهی; تقی زهرائی صالحی; نادر مصوری; زهرا صالحی نجف آبادی; رامک یحیی رعیت. "کلون و بیان پروتئین حدت CFP-10 مایکوباکتریوم بویس سویه AN5". , 76, 1, 1400, 124-132. doi: 10.22059/jvr.2019.281406.2932
عارف پژوهی, رضا, زهرائی صالحی, تقی, مصوری, نادر, صالحی نجف آبادی, زهرا, یحیی رعیت, رامک. (1400). 'کلون و بیان پروتئین حدت CFP-10 مایکوباکتریوم بویس سویه AN5', , 76(1), pp. 124-132. doi: 10.22059/jvr.2019.281406.2932
عارف پژوهی, رضا, زهرائی صالحی, تقی, مصوری, نادر, صالحی نجف آبادی, زهرا, یحیی رعیت, رامک. کلون و بیان پروتئین حدت CFP-10 مایکوباکتریوم بویس سویه AN5. , 1400; 76(1): 124-132. doi: 10.22059/jvr.2019.281406.2932

کلون و بیان پروتئین حدت CFP-10 مایکوباکتریوم بویس سویه AN5

مجله تحقیقات دامپزشکی (Journal of Veterinary Research)
دوره 76، شماره 1، فروردین 1400، صفحه 124-132    اصل مقاله (1.28 M)
نوع مقاله: میکروبشناسی و ایمنی شناسی
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22059/jvr.2019.281406.2932
نویسندگان
رضا عارف پژوهی1؛ تقی زهرائی صالحی* 1؛ نادر مصوری2؛ زهرا صالحی نجف آبادی3؛ رامک یحیی رعیت1
1گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
2بخش تحقیق و تولید توبرکولین و مالئین، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
3بخش بیوتکنولوژی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
چکیده
زمینۀ مطالعه:سل گاوی به وسیله گونه مایکوباکتریوم بویس ایجاد می‌شود و اثرات مهمی در بهداشت عمومی و اقتصادی از جمله تجارت حیوانات و تولید دارد. برنامه کنترل مرسوم براساس آزمایش پوستی و کشتار گاوهای آلوده به سل است. علی‌رغم اعتماد به این آزمایش، واکنش‌های مثبت کاذب از معایب آن به شمار می‌رود که جهت رفع آن استفاده از پروتئین‌هایی با ویژگی بالاتر توصیه می‌گردد.
هدف: مطالعه حاضر به منظور کلون، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب CFP-10 به عنوان آنتی‌ژن مایکوباکتریوم بویس صورت گرفت.
روش‎کار: ژن پروتئین CFP-10 با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره پلی‌مراز تکثیر شد. محصول واکنش پس از هضم توسط دو آنزیم EcoRI و HindIII در وکتور pET23a(+) کلون شد و بعد از ترانسفورماسیون در سلول DH5α E. coli تکثیر گردید. پس از الحاق و تعیین توالی، وکتور کلون شده در سلول بیانی BL21 E. coli ترانسفورم شد. جهت القاء، از ایزپروپیل-دی-بتا-تیوگالاکتوپیرانوزید استفاده گردید. جهت انحلال اجسام توده‌ای در پلت سلولی از اوره 8 مولار استفاده شد. پس از تخلیص پروتئین نوترکیب با رزین نیکل، حذف اوره با گرادیان کاهنده انجام گرفت.
نتایج: صحت کلون ژن CFP-10 با تعیین توالی اثبات گردید. بیان پروتئین CFP-10 با استفاده از مونوکلونال آنتی‌بادی اختصاصی با وسترن بلاتینگ اثبات شد. نتایج تعیین توالی ژن در کنار وسترن بلاتینگ، حاکی از آن بود که پروتئین نوترکیب بدست آمده در وزن مولکولی حدود 10 کیلو دالتون به خوبی بیان و تخلیص گردیده است.
نتیجه­گیری نهایی: نتایج نشان داد که ژنcfp-10  به خوبی در سیستم پروکاریوتی کلون، بیان گردید و پروتئین CFP-10 می‌تواند جهت مطالعات بیشتر در تولید کیت‌های تشخیصی علیه سل گاوی مورد استفاده قرار گیرد.
کلیدواژه‌ها
CFP-10؛ مایکوباکتریوم بویس؛ پروتئین نوترکیب؛ کلون؛ بیان
عنوان مقاله [English]
Cloning and Expression of Virulent Protein CFP-10 from Mycobacterium bovis Strain AN5
نویسندگان [English]
Reza Arefpajoohi1؛ Taghi Zahraei Salehi1؛ Nader Mosavari2؛ Zahra Salehi Najafabadi3؛ Ramak Yahya Raeyat1
1Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Iran
2Department of Research and Production of Tuberculin and Mallein, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization, Karaj, Iran
3Department of Biotechnology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization, Karaj, Iran
چکیده [English]
BACKGROUND: Bovine tuberculosis caused by Mycobacterium bovis is an important disease that has negative effects on public health and entails economic loss. Traditional controlling programs for cattle  focus on test and slaughter strategy, and false positive is one of the disadvantages associated with tuberculin skin test. To overcome this limitation, proteins with high specificity have to be utilized.
OBJECTIVES: The objective of this study was to clone and express virulent protein CFP-10 from Mycobacterium bovis AN5.
METHODS: Full-length genes of cfp-10 were amplified by PCR technique. In parallel, pET23a(+) and PCR products were double digested by EcoRI and HindIII. Ligation was performed at 16˚C followed by transformation into competence E. coli DH5α. After being identified with sequencing, the cloned vector was transformed into E. coli BL21. Induction was performed by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Urea 8M was used to dissolve the expressed protein in the inclusion body form. Recombinant protein was purified by Nickle-Resin, and urea was eliminated by decreasing the gradient.
RESULTS: The CFP-10 gene clone was proved by sequencing method. The CFP-10, as a 10 KDa protein, was confirmed by Western blotting using monoclonal antibodies. Based on the results, the recombinant protein was successfully cloned and expressed.
CONCLUSIONS: The results showed that cfp-10 gene was successfully cloned and expressed in prokaryotic system, indicating that this recombinant protein could be utilized in diagnostic kits against bovine tuberculosis in the future.
کلیدواژه‌ها [English]
CFP-10, Mycobacterium bovis, Recombinant protein, Clone, Expression
اصل مقاله

مقدمه

 

سل گاوی که عامل آن مایکوباکتریوم بویس می‌باشد گونه‌ای است که بالاترین توانایی ایجاد بیماری سل را در طیف وسیعی از میزبان‌ها و عمدتاً گاو دارد. پیامد‌های ابتلاء به سل گاوی شامل کاهش تولید، مرگ زودرس گاوهای مبتلا و خسارات اقتصادی شدید در گله‌های آلوده می‌باشد. استراتژی عمده در کنترل و پیشگیری این بیماری، مبتنی بر سیاست آزمایش پوستی توبرکولین و کشتار گاوهای واکنش مثبت گله است (12).

در ایران سال‌ها تست توبرکولین مقایسه‌ای با استفاده ازPPD  (Protein Purified Derivative) تهیه شده در موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، به عنوان آزمایش غربال‌گری قابل اعتماد در تشخیص گاوهای آلوده به طور موفقیت آمیزی استفاده شده است. با پیشرفت برنامه‌های ریشه‌کنی، تعداد واکنش‌های مثبت کاذب نیز افزایش می‌یابد. وجود آنتی‌ژن‌های مشترک فراوان بین گونه‌های مختلف مایکوباکتریایی مانند مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه آویوم، مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس و مایکوباکتریوم‌های محیطی که منجر به مداخله در تفسیر آزمایش می‌گردد و از معضلات عمده در شناسایی دام‌های آلوده در گله به شمار می‌رود، یکی از دلایل عمده ایجاد نتایج مثبت کاذب محسوب می‌شود. از سوی دیگر استفاده از حرارت و مواد شیمیایی در هنگام تولید توبرکلوپروتئین باعث تغییراتی در آنتی ژنیسیتی و ساختار  PPDاز جمله واسرشت شدن و از بین رفتن گروهی از پروتئین‌های ترشحی سبک وزن با ویژگی بالا می‌گردد که این پروتئین‌ها نقش مهمی در رابطه با پاسخ ایمنی سلولی ایفا می‌کنند (5).

با توجه به ضعف‌های اشاره شده در بالا و به منظور کاهش ضررهای اقتصادی و اطمینان خاطر دامدار در برنامه‌های کنترلی، نیاز به آزمایش مجدد درگاوهای راکتور مثبت با تست‌های تکمیلی و یا انجام تست با پروتئین‌هایی که واجد حساسیت و ویژگی بالاتری هستند، ضروری به نظر می‌رسد.

پروتئین (The 10 KDa Culture Filtrate Protein) CFP-10، پروتئین ایمونوژن ترشحی در سویه مایکوباکتریوم بویس می‌باشد که نقش آن از نظر حدت و آنتی‌ژن محافظتی نشان داده شده است. این ژن به طور مجزا توسط مناطق ژنی esxB (cfp-10 کد کننده پروتئین CFP-10) کد می‌گردد و در ناحیه RD1 (Region of Differentiation1) مایکوباکتریوم بویس قرار دارند. ناحیه مذکور در مایکوباکتریوم بویس وحشی وجود دارد ولی درBCG  (Bacillus Calmette–Guérin) و اکثر مایکوباکتریوم‌های محیطی وجود ندارد که از این خصوصیت می‌توان جهت تمایز دام‌های عفونی به مایکوباکتریوم‌های محیطی و یا گله آلوده از گله واکسینه شده با یون بهره برد (17). نتایج حاصل از این مطالعه می‌تواند به عنوان پایه‌ای جهت مطالعات بیشتر در تولید کیت‌های تشخیصی الایزا علیه سل گاوی مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش‌کار

سویه‌های باکتریایی، آنزیم‌ها و کیت‌های مصرفی: از سویه AN5 مایکوباکتریوم بویس موجود در بخش تحقیق و تولید توبرکولین و مالئین موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی جهت استخراج  DNA استفاده گردید. سلول‌های DH5α و BL21 از بخش تولید واکسن تب برفکی و پلاسمید  pET23a(+) از بخش بیوتکنولوژی تأمین گردید. سنتز پرایمرها و همچنین تعیین توالی ژن‌های کلون شده، توسط شرکت Macrogen کره‌جنوبی صورت گرفت. آنزیم‌های محدود کننده EcoRI و  HindIIIهمچنین رزین Ni-NTA از شرکت Thermo Fisher Scientific تهیه شد. برای استخراج پلاسمید، از دو کیت ساخت شرکت Roche و MBST استفاده شد. دیگر مواد مولکولی مصرفی از دو شرکت Sinaclone و Sigma تأمین گردید.

کشت باکتری و استخراج DNA ژنومی: باکتری مایکوباکتریوم بویس سویه AN5در محیط اختصاصی لوانشتاین جانسون پیروات دار کشت داده شد و به مدت 6 هفته در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید. تحت شرایط ایمن از پرگنه‌های باکتری به میزان یک لوپ کامل برداشته شد و پس از غیر فعال‌سازی باکتری به مدت 30 دقیقه در بن‌ماری با دمای 80 درجه سانتی‌گراد، عملیات استخراج DNA با استفاده از روش Van Soolingen و همکاران در سال 2001 انجام گرفت (16).

طراحی پرایمرهای اختصاصی حاوی مناطق برش خورده و انجام عملیات PCR: توالی ثبت شده ژن cfp-10 از پایگاه  Bovilistانستیتو پاستور اخذ گردید. برای پرایمرهای بالادست و پائین دست، جایگاه برش آنزیم‌های EcoRI و HindIII در نظر گرفته شد. طراحی پرایمرها توسط نرم افزارVector NTI Advance 11 صورت پذیرفت و توسط شرکت Macrogen کره جنوبی سنتز گردید. توالی پرایمرهای ژن cfp-10 که 303 جفت باز را تکثیر می‌نماید، عبارت است از:

5' AGCTAGAATTCATGGCAGAGATGAAGACC3' (EcoRI)

5' CAGGAGCGTTTACCCGAAGTTCGAATTAT 3' (HindIII)

ترکیب اجزای تشکیل دهنده PCR با حجم نهایی 100 میکرولیتر به شرح ذیل صورت گرفت:

 بافر PCR X10 به میزان 10 میکرولیتر، dNTP 10 میلی‌مولار به مقدار 2 میکرولیتر، DMSO (Dimethyl Sulfoxide) با حجم 5 میکرولیتر، پرایمر بالادست و پائین دست هر کدام 5 میکرولیتر، DNA الگو با مقدار 1 میکرولیتر، pfu پلی‌مراز با حجم 7/0 میکرولیتر، آب مقطر با مقدار 3/71 میکرولیتر.

برنامه دمایی و زمان در دستگاه Eppendorf Gradiant به شرح زیر اجرا شد:

واسرشت‌سازی اولیه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه یک چرخه، واسرشت‌‌‌‌سازی 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال 62 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، بسط زنجیره 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و تکرار 35 چرخه و در نهایت بسط نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه یک چرخه انجام گرفت. ژن تکثیر یافته cfp-10 در آگارز 1 درصد در ولتاژ 90 به مدت 1 ساعت الکتروفورز گردید. محصول PCR بدست آمده منطبق با دستورالعمل کیتPCR Product Purification  ساخت شرکت Roche تخلیص شد.

کلونینگ وبیان ژن cfp-10 در وکتور pET23a(+): به منظور کلون نمودن ژن cfp-10 در وکتور pET23a(+)، هضم آنزیمی مضاعف محصول PCR با دو آنزیم محدود کننده Hind III و EcoRI در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت یک شبانه روز صورت گرفت. هم‌زمان عملیات هضم آنزیمی مضاعف بر روی وکتور pET23a(+) نیز انجام شد. پلاسمید خطی شده پس از برش از روی ژل آگاروز، مطابق با دستور العمل کیتPCR Product Purification  ساخت شرکت Roche تخلیص شد. پس از ارزیابی کمی و کیفی صورت گرفته بر روی پلاسمید و محصول PCR هضم شده، با استفاده از نرم افزار NEB Ligation Calculator بهترین غلظت جهت عملیات الحاق محاسبه گردید. الحاق با استفاده از آنزیمT4  لیگاز در دستگاه ترموسایکلر در دمای 16 درجه سانتی‌گراد به مدت یک شبانه روز انجام گرفت. به منظور تکثیر، عملیات ترانسفورماسیون وکتور کلون شده در سلول مستعد DH5α E. coliبا روش کلرید کلسیم سرد شده، صورت گرفت و سلول به محیط لوریا برتانی (LB Broth) حاوی غلظت مناسب آمپی‌سیلین (100 میکروگرم/ میلی‌لیتر) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تلقیح شد. عملیات استخراج پلاسمید از سلول با روش لیز قلیایی انجام گرفت. غربال‌گری پلاسمیدهای این مطالعه با انجام کلونی PCR تأیید شد. جهت تأیید نهایی، تعیین توالی به صورت خوانش دو طرفه با پرایمرهای یونیورسال صورت گرفت. برای آنالیز توالی‌ها از نرم افزار Chromas Version 2.6.4 استفاده شد.

به منظور بیان پروتئین، پلاسمید‌های کلون شده در سلول بیانیBL21  E. coliمستعد شده ترانسفورم شد و بذر کاری به ارلن محتوی 50 میلی‌لیتر محیط  LB Brothحاوی آمپی‌سیلین افزوده شد. عمل هوادهی ارلن‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با سرعت 144 آرپی‌ام انجام گرفت. به محض رسیدن جذب نوری به 6/0 در طول موج 600 نانومتر، قبل از افزودن ایزپروپیل-دی-بتا-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)، 1 میلی‌لیتر نمونه زمان صفر برداشت گردید. جهت القاء بیان پروتئین از IPTG استفاده شد. به منظور بهینه‌سازی، غلظت‌های 1/0، 2/0، 5/0 و 1 میلی‌مولار از IPTG در حجم نهایی محیط LB Broth محاسبه شد و فالکون‌ها در دمای 37 و 22 درجه سانتی‌گراد انکوبه و هوادهی شدند. از هر یک از فالکون‌ها در فواصل زمانی 60، 120، 180 و 240 دقیقه به میزان 1 میلی‌لیتر نمونه برداری شد. مایع رویی و پلت باکتریایی هر یک از نمونه‌ها از نظر بیان پروتئین با ژل SDS-PAGE (4-12 درصد) با ولتاژ 100 ولت به مدت 2 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفتند (5).

استحصال پروتئین His-Tagged به فرم اجسام توده‌ای با روش مکانیکی سونیکاسیون: با توجه به بیان پروتئین به شکل اجسام توده‌ای (Inclusion Body) در پلت سلولی، عملیات متلاشی نمودن سلول پس از شستشو با بافر نمکی در حضور PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) با امواج فراصوت (دامنه 80، با فواصل زمانی 1 دقیقه ضربان و 1 دقیقه استراحت به مدت 5 بار) صورت پذیرفت. برای محلول ساختن پروتئین غیر محلول از اوره 8 مولار استفاده شد.

تخلیص: به منظور جداسازی پروتئین‌های نوترکیب با توالی His از رزین Ni-NTA استفاده گردید. تحت شرایط استریل‌ 100 میکرولیتر رزین به دو میکروتیوپ 5/1 میلی‌لیتری افزوده شد و دو برابر حجم رزین از بافر متعادل کننده (بافر PBS 1X، همراه با ایمیدازول 10 میلی‌مولار و اوره 8 مولار با pH برابر 4/7) به رزین افزوده شد. پس از سانتریفیوژ، حجم مساوی از عصاره پروتئینی سونیکه شده با بافر متعادل کننده مخلوط شد و به مدت 1 ساعت در دمای آزمایشگاه به خوبی هم زده شد. میکروتیوب‌ها مجدداً سانتریفیوژ گردیدند. پس از جدا‌سازی مایع رویی به رزین، 1 میلی‌لیتر از بافر شستشو (بافر PBS 1X، همراه با ایمیدازول 25 میلی‌مولار و اوره 8 مولار با pH برابر 4/7) افزوده شد و پس از سانتریفیوژ، عملیات شستشو دو بار تکرار گردید. در نهایت به حجم رزین اولیه، 100 میکرولیتر محلول بافر شستشو 250 میلی‌مولار (بافر PBS 1X، همراه با ایمیدازول 250 و 400 میلی‌مولار و اوره 8 مولار با pH برابر 4/7) افزوده شد و پس از سانتریفیوژ، مایع رویی جمع‌آوری شد و همین عملیات مجدداً با بافر شستشو 400 میلی‌مولار تکرار شد. حذف اوره با استفاده از گرادیان کاهشی 8، 6، 4، 2، 1 و 0 مولار اوره صورت گرفت. پروتئین‌های استحصالی با روش Lowry ارزیابی شدند (9). آنالیز پروتئین‌ها با تکنیک SDS-PAGE (4-12 درصد) صورت گرفت. ژل با کوماسی بلو G-250 رنگ آمیزی گردید.

وسترن بلاتینگ: به منظور تأیید بیان پروتئین CFP-10 از روش ایمونوبلاتینگ استفاده شد (13). به‌طور خلاصه، پس از الکتروفورز پروتئین نوترکیب تخلیص شده به روی ژل SDS-PAGE، ژل و کاغذهای واتمن و غشاء پلی وینیلدین فلوراید (PVDF) در کاست مخصوص قرار داده شدند. مجموعه به تانک محتوی ترانسفر بافر انتقال یافت. جریان با شدت 400 میلی‌آمپر به مدت 1 ساعت برقرار گردید. بلاک نمودن کاغذ PVDF با غوطه‌ور سازی کاغذ در محلول سرم آلبومین گاوی 3 درصد به مدت 1 ساعت انجام شد. پس از شستشوی کاغذ PVDF با بافر تریس نمکی (TBST)، آنتی‌بادی آنتی His tag ساخت شرکت Abcam با رقت 1:5000 به مدت 1 ساعت روی غشاء افزوده شد. کاغذ با بافر TBST شستشو گردید. سپس آنتی‌بادی ثانویه goat anti-Rabbit کنژوگه با HRP ساخت شرکت Abcam با غلظت 1:5000 به غشاء افزوده شد و کاغذ به مدت 1 ساعت در دمای آزمایشگاه شیک گردید. غشاء پس از شستشو در مجاورت DAB یک درصد به همراه آب اکسیژنه 30 درصد و PBS1X به مدت 3 دقیقه قرار گرفت.

نتایج

تکثیر ژن پروتئینی cfp-10: محصولات PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز گردید. نتایج، تکثیر ژن cfp-10 با اندازه 303 جفت باز را به خوبی نشان داد. به منظور پاک‌سازی محصول PCR از باقیمانده مواد، عملیات تخلیص با استفاده از کیت PCR Product Purification ساخت شرکت  Roche انجام شد (تصویر 1).

هضم آنزیمی مضاعف پلاسمیدpET23a(+) : به منظور خطی شدن پلاسمیدهای استخراج شده، هضم با استفاده از آنزیم‌های برشی HindIII و EcoRI انجام شد و محصول هضم

oRI و HindIII.

 

شده بر روی ژل آگارز 8/0 درصد الکتروفورز گردید. نتایج حضور پلاسمید خطی شده با حدود 4000 جفت‌ باز با خلوص و غلظت بالا را نشان داد. پس از برش ژل محتوی وکتور، پلاسمید از داخل ژل تخلیص گردید (تصویر 2).

الحاق و تعیین توالی: تعیین توالی و آنالیز نرم افزاری پس از عملیات الحاق بین ژنcfp-10 با وکتور pET23a(+) حاکی از آن بود که هیچ‌گونه جهشی در ژن‌های کلون شده وجود ندارد و کلونینگ با موفقیت صورت گرفته است (تصویر 3).

بیان پروتئین نوترکیب CFP-10: بهترین بیان پروتئین نوترکیب CFP-10،در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با غلظت 5/0 میلی مولار طی 4 ساعت بدست آمد. آنالیز  SDS-PAGEبیان موفقیت آمیز پروتئین نوترکیب فوق را با اندازه مولکولی حدود 10 کیلو‌دالتون در پلت سلولی به خوبی نشان داد (تصویر 4).

به منظور تأیید بیان پروتئینCFP-10 ، وسترن بلات ظهور باند مورد نظر و بیان پروتئین در محدوده 10 کیلودالتون را تأیید کرد (تصویر 5).

بحث

مایکوباکتریوم بویس باکتری ایجاد کننده سل گاوی است که تقریباً 50 میلیون راس گاو را در سراسر جهان مبتلا کرده است و علاوه بر خسارات اقتصادی به دامدار و به مخاطره انداختن تجارت دام، به جهت زئونوز بودن در بهداشت عمومی اهمیت فراوانی دارد. علی‌رغم اینکه اکثریت دام‌های مبتلا به این بیماری در کشورهای توسعه نیافته زندگی می‌کنند، با این

وجود این بیماری در کشورهای توسعه یافته هنوز هم وجود دارد (12).

استراتژی اصلی و فراگیر مراقبت از بیماری مبتنی بر سیاست آزمایش و کشتار است (4)، اما تست پوستی خیلی حساس نیست و تنها 3/1 حیوانات آلوده ضایعات گرانولوماتوز را نشان می‌دهند، ضمناً گرانولومای کوچک ممکن است زمانی قابل مشاهده باشد که در غدد لنفی برش‌های نازک زده شوند. علاوه بر این در برخی حیوانات واکنش مثبت، ضایعه قابل مشاهده‌ای در بررسی کشتارگاهی مشاهده نمی‌شود و گزارش کشت عقده لنفی آن‌ها از نظر مایکوباکتریوم بویس در اکثر موارد منفی است. با پیشرفت برنامه‌های کنترل سل گاوی و ریشه‌کنی آن، تعداد گاوهای راکتور مثبت افزایش می‌یابد که از چالش‌های اصلی در کنترل و ریشه‌کنی برنامه‌های کشوری است (12). لذا بهره‌گیری از تست‌های تکمیلی یا پپتیدهایی با ویژگی بالاتر در تست توبرکولین، میزان راکتور مثبت کاذب را کاهش خواهد داد. با پیشرفت علم ژنتیک و شناسایی ژنوم مایکوباکتریوم‌های بیماریزا، استفاده از آنتی‌ژن‌های پروتئینی در تشخیص و تولید واکسیناسیون تحت واحدی بیشتر و کامل‌تر شده است (10). هدف از این مطالعه، کلون و بیان پروتئین نوترکیب CFP-10 مایکوباکتریوم بویس جهت بهبود ویژگی تست غربال‌گری است.

از نظر متابولیکی در فاز فعال یا اولیه عفونت، مایکوباکتریوم‌های فعال، پروتئین‌هایی با وزن مولکولی کم و ایمنی‌زایی بالا، مانند CFP-10 ترشح می‌کنند که در محیط کشت فیلتر شده مایکوباکتریوم بویس شناسایی می‌شوند. این آنتی‌ژن‌ها باعث تحریک پاسخ اینترفرون گاما در حیوانات واکنش مثبت و مسلولین و نه در افراد واکسن خورده با BCG می‌گردد. دو پروتئین اخیر تقریباً برای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس اختصاصی است و ژن آن‌ها در تمام سویه‎های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بویس حاد وجود دارد، ولی در تمام سویه‌های  BCGو بسیاری از گونه‌های محیطی مایکوباکتریومی حذف شده است. بنابراین CFP-10 می‌تواند به عنوان نامزد بالقوه در تشخیص زود هنگام، در کیت‌های تشخیصی مورد استفاده قرار گیرد (18).

در مطالعه صورت گرفته به منظور بیان این پروتئین از سیستم پروکاریوتیک استفاده گردید. علت استفاده از این سیستم از یک سو کسب حداکثر میزان بازده و از طرفی دیگر، عدم نیاز تغییرات پس از ترجمه پروتئین می‌باشد. در این مطالعه از وکتور pET23a(+) استفاده شد، به دلیل اینکه این وکتور ارزان و در دسترس می‌باشد. وکتور pET23a(+) دارای 3666 جفت باز است و مکان‌های برش آنزیمی متعددی در منطقه MCS (Multiple Cloning Site) خود از جمله HindIII و EcoRI دارد. انتخاب این دو آنزیم از این جهت صورت گرفت که ضمن در دسترس بودن، این دو آنزیم فاصله مناسبی را از جهت برش نسبت به یکدیگر دارند. همچنین وکتور دارای ساختار  His-Tagبا توالی CATCATCACCACCACCAT در -Cترمینال می‌باشد. توجه به این مساله حائز اهمیت است، چرا که در برخی موارد تولیدات ژنی خاص از قبیل پروتئین‌های نوترکیب بلند ممکن است در معرض خاتمه بیان پیش از بلوغ قرار گیرند که وجود ساختاری واجد توالی His در انتهای C باعث اطمینان یافتن از بیان کامل پروتئین می‌باشد (5،14). بکارگیری ساختارهای واجد توالی His در مهندسی ژنتیک اشریشیاکلی بسیار متداول است و عموماً آسان‌ترین راه برای بیان ژن محسوب می‌شود. از ویژگی‌های مهم این توالی عدم تأثیر بر روی ساختار و عملکرد پروتئین نوترکیب بیان شده، خنثی  بودن آن در pH فیزیولوژی و ضعیف بودن خاصیت ایمونوژنیک آن می‌باشد که در نهایت وجود آن در کنار پروتئین بیان شده تأثیری در نتایج و ارزیابی‌های ایمنی حاصل نخواهد داشت. همچنین این Tag‌ها باعث عدم تحرک پروتئین بر روی سطوح شلات کننده فلزی مثل Ni می‌شوند که در تخلیص پروتئین کاربرد فراوان دارد (5).

به منظور بهینه سازی بیان، آنالیز نمونه‌ها در دوره‌های زمانی انجام شد. نتایج حاکی از آن بود که القاء با غلظت 5/0 میلی‌مولار از IPTG طی 4 ساعت بهترین میزان بیان را نشان داد. اندازه‌گیری جذب نوری سلول کلون شده در طول موج 600 نانومتر نشان داد که با گذشت زمان از سرعت رشد سلول‌های میزبان کاسته می‌شود که این امر می‌تواند به دلیل افزایش تقاضای متابولیکی سلول میزبان به واسطه نسخه برداری بالا در جهت ترجمه پروتئین‌های نوترکیب باشد (13).

نتایج وسترن بلات با آنتی‌بادی مونوکلونال موید تعیین توالی صحیح ژن کلون شده و از سوی دیگر تأیید کننده بیان قابل قبول پروتئین‌ها در میزبان پروکاریوت بود و از این جهت می‌توان نتیجه گرفت که روش بکار رفته مطلوب می‌باشد و ساختار پپتیدی تا حد بسیاری حفظ شده است.

Asadi و همکاران در سال 2009، کلون و بیان ژن esat-6 مربوط به ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را مورد بررسی قرار دادند. نتایج این تحقیق نشان داد که ژن فوق در پلاسمید pQE30 به خوبی کلون گردید و بیان آن در سلول M15 با موفقیت همراه بود که این موضوع نشان می‌دهد، استفاده از پلاسمید و سلول بیانی متفاوت نیز می‌تواند به شکل موفقیت آمیزی برای کلون و بیان ژن‌های مشابه مورد استفاده قرار گیرد که این امر با مطالعه حاضر نیز هم‌خوانی دارد (1).

Buddle و همکاران در سال 2003، تعدادی از آنتی‌ژن‌های مایکوباکتریال شامل MPB59، MPB64، MPB70،MPB83 ،ESAT-6  وCFP-10  در تست گاما اینترفرون بر روی حیوانات غیر آلوده، حیوانات واکسینه شده با یون و راکتور مثبت با PPD را مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که استفاده از دو ترکیب آنتی‌ژنی ESAT-6 و CFP-10، میزان راکتور‌های مثبت کاذب را به طور معنی‌داری در میان گاوهای آلوده کاهش دادند که این نتایج در مقایسه با سایر آنتی‌ژن‌ها، فراوانی بالاتری از تشخیص گاوهای آلوده را در بر می‌گرفت (3).

Jones و همکاران در سال 2012، مطالعه‌ای به منظور بهبود تست پوستی در تشخیص افتراقی گاوهای آلوده به مایکوباکتریوم بویس و واکسینه با BCG انجام دادند. در این مطالعه ابتدا کوکتل پروتئینی ESAT-6،CFP-10  و Rv3615c تزریق شد که نتیجه آن ایجاد پاسخ‌های قابل تشخیص در 12 حیوان از 16 راس بود (6).

در تحقیق Ting و همکاران در 2013، ترکیب پپتید‌هایESAT-6 ، CFP-10 و TB10.4 در تست پوستی در گاوهای آلوده به مایکوباکتریوم بویس مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج حاکی از آن بود که این ترکیب توانایی تمایز بین مایکوباکتریوم بویس از مایکوباکتریوم آویوم را دارد و نتایج آن همبستگی بالایی با تست توبرکولین و گاما اینترفرون داشت (19).

در مطالعه Tashakkori و همکاران در سال 2016، پروتئین‌های نوترکیب ESAT-6 و MPT-64 مایکوباکتریوم بویس، به منظور ارزیابی تشخیصی در دام‌های آلوده به روش الایزا مورد استفاده قرار گرفتند. بر همین اساس حساسیت و ویژگی کسب شده در رقت 1:10 از نمونه‌های سرمی به ترتیب برای  ESAT6 15/92 و 24/89 درصد و برای MPT-64 به ترتیب 11/94 و 40/91 درصد محاسبه گردید. نتایج حاکی از آن بود که دو پروتئین فوق با دقت نسبتاً قابل قبولی توانستند نمونه‌های سرمی دام‌های بیمار را از سرم دام‌های سالم تمیز دهند (15).

با توجه به نتایج امیدبخشی که اخیراً با استفاده از این پروتئین نوترکیب در آزمایشات بالینی داوطلبین انسانی جهت تشخیص بیماری سل مورد استفاده قرار گرفته است (8،14)، می‌توان به استفاده از CFP-10 در بهبود تشخیص سل دامی با هدف افزایش ویژگی امیدوار بود.

سپاسگزاری

بدین‌وسیله مراتب قدردانی و تشکر خود را از جناب آقای دکتر اسماعیل‌‌زاد که کمک شایان و قابل توجهی را بابت در اختیار گذاشتن تجهیزات و مواد آزمایشگاهی در طول پروژه داشتند، اعلام می‌نمایم. این مقاله بخشی از پایان نامه دکترای تخصصی باکتری‌شناسی است و با حمایت مالی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی انجام گرفته است.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

مراجع

References

 

  1. Asli, E., Taghizadeh, M., Rezaei Mokaram, A., Ebrahimi, S.M., Zavaran Hoseini, A., Tebianian, M. (2009). Cloning and expression of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 in prokaryotic system. Arch Razi inst. 64(1), 1-7. https://doi. org/10.22092/ARI.2009.103800
  2. Bpriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. (2015). Purification of His-tagged proteins, Methods Enzymol, 559, 1-15. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2014.11.003 PMID: 26096499
  3. Buddle, B.M., McCarthy, A.R., Ryan, T.J., Pollock, J.M., Vordermeier, H.M., Hewinson, R.G., Andersen, P., de Lisle, G.W. (2003). Use of mycobacterial peptides and recombinant proteins for the diagnosis of bovine tuberculosis in skin test-positive cattle. Vet Rec, 15, 615-620. PMID: 14653340
  4. Esmaeili, H., Tajik, P., Ekhtiyarzadeh, H., Bolourchi, M., Hamedi, M., Khalaj, M., Amiri, K. (2012). Control and eradication program for bovine brucellosis in Iran: An epidemiological survey. J Vet Res, 67(3), 211-221. https://doi.org/10.22059/JVR.2012.28498
  5. Gopal, G.J., Kumar, A. (2013). Strategies for the production of recombinant protein in Escherichia coli. Protein J, 32(6), 419-425. https://doi.org/10.1007/s10930-013-9502-5 PMID: 23897421
  6. Jones, G.J., Whelan, A., Clifford, D., Coad, M., Vordermeier, H.M., (2012). Improved skin test for differential diagnosis of bovine tuberculosis by the addition of Rv3020c-derived peptides. Clin Vaccine Immunol, 19(4), 620-622. https://doi.org/10.1128/CVI.00024-12 PMID: 22301696
  7. Larankena, K., Jacobs, L., van Dijk, T., Good, M., Duignan, A., de Jong, M.C.M. (2018). A new model to calibrate a reference standard for bovine tuberculin purified protein derivative in the target species. Front Vet Sci, 5(232), 1-7. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00232
  8. Li, F., Xu, M., Zhou, L., Xiong, Y., Xia, L., Fan, X., Gu, J., Pu, J., Lu, S., Wang, G. (2016). Safety of recombinant fusion protein ESAT6-CFP10 as a skin test reagent for tuberculosis diagnosis: an open-label, randomized, single-center phase I clinical trial. Clin Vaccine Immunol, 23(9), 767-773. https://doi.org/10.1128/CVI.00154-16
  9. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 193, 265-275. PMID: 14907713
  10. Li, H., Liu, L., Zhang, W., Zhang, X., Zheng, J., Li, L., Zhu, X., Yang, Q., Zhang, M., Liu, H., Chen X., Jin, Q. (2019). Analysis of the antigenic properties of membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis. Sci Rep, 9, 1-8. https://doi.org/ 10.1038/s41598-019-39402-z
  11. Mohammadi Tashakkori, M., Tabatabaei, M., Tebianian, M., Mosavari, N. (2017). Production of MPT-64 recombinant protein from virulent strain of Mycobacterium bovis. IJVR. 19(2), 108-112. https://doi.org/10.22099/IJVR.2018.4854
  12. NanderWaal, K., Enns, E.A., Picasso, C., Alvarez, J., Perez, A., Fernandez, F., Gil, A., Craft, M., Wells, S. (2017). Optimal surveillance strategies for bovine tuberculosis in a low-prevalence country. Sci Rep, 23;7(1), 1-9. https://doi. org/10.1038/s41598-017-04466-2
  13. Lessard, J.C. (2013). Molecular cloning. Methods Enzymol, 529, 85-98. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-418687-3.00007-0
  14. Shang, C., Song, X., Zhao, Y., Zhang, H., Zhao, S., Mao, F., Bai, B., Wu, S., Shi, C. (2015). Mycobacterium tuberculosis secreted proteins as potential biomarkers for the diagnosis of active tuberculosis and latent tuberculosis infection. J Clin Lab Anal, 29, 375-382. https://doi.org/10.1002/jcla.21782 PMID: 25131423
  15. Tashakkori, M.M., Tebianian, M., Tabatabaei, M., Mosavari, N. (2016). Cloning, expression, and purification of recombinant protein MPT-64 from a virulent strain of Mycobacterium bovis in a prokaryotic system. Int J Mycobacteriol, 5(1), 249-250. https://doi.org/10.1016/j. ijmyco.2016.10.027 PMID: 28043587
  16. Van Soolingen, D., De Hass, E.W.P., Kremer, K. (2001). Restriction fragment length polymorphism (RFLP) typing of Mycobacteria. Methods Mol Med, 54, 165-203. https://doi.org/10.1385/1-59259-147-7:165 PMID: 21341076
  17. Vncinas, M., Marfil, M.J., Garbaccio, S., Barandiaran, S., Huertas, P., Morsella, C., Macías, A., Magnano, G., Zapata, L., Bigi, F., Cataldi, A., Paolicchi, F., Zumárraga, M., Eirin, M.E. (2018). Mycobacterium bovis ESAT-6, CFP-10 and EspC antigens show high conservation among field isolates. Tuberculosis (Edinb), 111, 143-146. https://doi.org/10. 1016/j.tube.2018.06.007 PMID: 30029900
  18. Xerrano, M., Elguezabal, N., Sevilla, I.A., Geijo, M.V., Molina E., Arrazuria, R., Urkitza, A., Jones, G.J., Vordermeier, M., Garrido, J.M., Juste, R.A. (2017). Tuberculosis detection in paratuberculosis vaccinated calves: new alternatives against interference. PLoS ONE, 12(1), 1-4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.016973
  19. Xin, T., Jia, H., Ding, J., Li, P., Yang, H., Hou, S., Yuan, W., Guo, X., Wang, H., Liang, Q., Li, M., Wang, B., Zhu, H. (2013). Assessment of a protein cocktail-based skin test for bovine tuberculosis in a double-blind field test in cattle. Clin Vaccine Immunol, 20(4), 482-490. https://doi.org/10.1128/CVI.00592-12
آمار
تعداد مشاهده مقاله: 725
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 233


سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب