مقدمه

بسیاری از داروها و پیش­سازهای دارویی از جمله خانواده آلکالوئیدها و ایندول آلکالوئیدها از منابع گیاهی تأمین می­شوند. آلکالوئیدهای خشخاش (به­‌غیر از Cryptopine ، Protopineو  (Thebaineبسیار منحصربه­فرد هستند، چراکه در هیچ ­یک از جنس­های گیاهی به­جز Papaver تولید نمی­شوند. بنابراین، لزوم توجه به گیاه خشخاش به‌عنوان تنها منبع تأمین‌کننده آلکالوئیدهای گروه مورفین (مورفین، تبائین، کدئین... ) و متابولیت­های ثانویه خشخاش و مسیرهای بیوسنتزی آن‌ها از اهمیت ویژه­ای برخوردار است (Leonard et al., 2009). جداسازی توالی کامل cDNA، یک مرحله­ی کلیدی در تحقیقات مرتبط با بیان ژن، شناخت عملکرد، ساختار و برهمکنش­های پروتئین با پروتئین محسوب می­شود (Hirano, 2004)؛ از این رو ، کسب اطلاعات در زمینه توالی‌های ژنتیکی آنزیم­های دخیل در این مسیرهای بیوسنتزی ضروری به­نظر می­رسد.

 آلکالوئیدهای خشخاش از طریق مسیرهای متفاوتی تولید می­شوند. در مسیر اول، ابتدا  -Lتریپتوفان ((L-Tryptophan با حضور تریپتوفان دکربوکسیلاز ((Tryptophan decarboxylase به تریپتامین تبدیل می‌شود؛ سپس تریپتامین با سکولوگانین (Secologanin) ترکیب می‌شود و اولین حدواسط منبع نیتروژن در تولید مولکول‌های آلکالوئیدی استریکتوزیدین (Strictosidine) را تولید می­کند (Facchini et al., 2000). در مسیر دوم، آنزیم تیروزین/ دوپا دکربوکسیلاز منجر به تولید اولین حدواسط حاصل از تیروزین در مسیر بیوسنتز آلکالوئیدهایی با منشأ تیروزین می‌شود (Facchini et al., 2000). آلکالوئیدهایی با منشأ تیروزین، جزو متنوع­ترین انواع آلکالوئیدها از لحاظ دارویی و ساختاری محسوب می­شوند و در درمان بسیاری از بیماری­ها از جمله سرطان (,Vinblastine Camptothecin و نیز نوسکاپین)، مالاریا (Quinine)، فشارخون بالا (Raubasine و Reserpine)، شیزوفرنی (Reserpine با دوز بالا) و اختلالات تپش قلب (Ajmaline) موثر هستند (Ma et al., 2006).

پروتئین استریکتوزیدین (با نام اختصاری STR) یکی از آنزیم‌های کلیدی دخیل در مسیر بیوسنتز آلکالوئیدهای گیاهی است که با ترکیب دو بلوک ساختاری اولیه یعنی تریپتامین (Tryptamine) و سکولوگانین (Secologanin)، باعث تولید استریکتوزیدین می­شود. آنزیم استریکتوزیدین، اولین مرحله از این مسیر بیوسنتزی را با هدف تولید تمام اعضای خانواده مونوترپنوئید ایندول آلکالوئیدها کاتالیز می­کند که در حقیقت به‌عنوان یک نمونه‌ی استثنایی از واکنش­های دخیل در مسیر بیوسنتز محصولات طبیعی شناخته می‌شود (Ma et al., 2006). داَستیل ایزوآیپوکساید سنتاز[1]، داَستیل آیپوکساید سنتاز[2] و نورکوکلایورین سینتاز[3]، تنها آنزیم­های شناخته‌ شده­ وابسته به استریکتوزیدین هستند. داَستیل ایزوآیپوکساید سنتاز و داَستیل آیپوکساید سنتاز، در ترکیب با تریپتامین و سکولوگانین، واکنش را به سمت تولید آلکالوئیدهای مونوترپنوئید تتراهیدروایزوکوئینولین هدایت می‌کنند (Ma et al., 2006) و نورکوکلایورین سینتاز در با ترکیب با دوپامین 4-Hydroxyphenylacetaldehyde، شروع بیوسنتز آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین[4] (از قبیل مورفین، سنگواینارین یا بربرین) را تحریک می­کند (Samanani et al., 2004). بنابراین استریکتوزیدین و آنزیم‌های ساختاری مربوط به آن، جزو آنزیم‌های کلیدی در مسیر بیوسنتز 50 درصد از تمام انواع آلکالوئیدها محسوب می­شوند و در حال حاضر، مکانیسم واکنش و یا آمینواسیدهای ضروری برای فعالیت آنزیمی آن‌ها به­درستی مشخص نشده است (Ma et al., 2006). توالی نوکلئوتیدی استریکتوزیدین برای اولین بار از سوسپانسیون سلولیCatharanthus roseus  و سپس Rauvolfia serpentine جداسازی شد (Ma et al., 2006). آنزیم استریکتوزیدین حاصل از R. serpentine، پروتئینی مونومر با 344 آمینواسید می­باشد (Kutchan, 1993) که به­ترتیب با آنزیم­های جدا شده از  Catharanthus roseus و Ophiorrhiza، 79 و 58 درصد شباهت دارد (Ma et al., 2006).

توجه به گیاه خشخاش و نیز مسیرهای متابولیکی و ژنتیکی وابسته به آن به­خصوص ژن استریکتوزیدین می­تواند در تولید آلکالوئیدهای مهم این مسیر بیوسنتزی در حال و آینده موثر باشد. تاکنون اطلاعاتی درباره توالی ژن استریکتوزیدین در پایگاه‌های اطلاعاتی مختلف برای این گیاه ثبت نشده است. بنابراین این تحقیق با هدف جداسازی توالی کامل ژن استریکتوزیدین به­عنوان عاملی کلیدی در سنتز ایندول آلکالوئیدها، بررسی ویژگی­های پروتئین شناختی آن و ارزیابی میزان بیان نسبی این ژن در بافت‌های ریشه، ساقه، برگ و غوزه  گیاهان خشخاش (Papaver somniferum) و شقایق کبیر (Papaver bracteatum L.) انجام شد.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی

بذر P. somniferum در گلدان­های چهار لیتری با ترکیب 40 درصد کوکوپیت، 40 درصد پرلیت و 20 درصد خاک زراعی در گلخانه با شرایط نوری هشت ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی کاشته شد. قوزه­های خشخاش، سه ماه پس از تاریخ کاشت ظاهر شدند و در مرحله بلوغ (دو هفته پس از ریزش گلبرگ­­ها)، نمونه­برداری از اندام­های مختلف گیاه انجام شد. نمونه­های گونه  bracteatum.P به­دلیل چند ساله بودن گیاه مذکور از منطقه پلور (دماوند) جمع­آوری و پس از فریز شدن در محل، به فریزر 80- درجه سانتی­گراد منتقل شدند.

شناسایی توالی توافقی و [5]ORF احتمالی

به­منظور شناسایی توالی توافقی^[6] ناحیه کدکننده[7] ژن استریکتوزیدین، ابتدا توالی­های قطعات بیانی[8] و خوانش­های[9] ژن استریکتوزیدین حاصل از پروژه­های توالی­یابی RNAی خشخاش (با شناسه­های دسترسی SRX039638 و  (SRX096061در پایگاه SRA-NCBI[10] با استفاده از توالی­های ارتولوگ مشابه در سایر گیاهان با کمک برنامه BLAST Offline (v.2.7.0) شناسایی شدند. سپس، مجموع این قطعات، با استفاده از نرم‌افزار Codoncode aligner (Ver. 5.0.1) با یکدیگر سرهم^[11] شدند. در مرحله بعد، چارچوب قرائت ژن استریکتوزیدین با بررسی توالی حاصل در برنامه آنلاین ORF Finder[12] شناسایی شد. به‌منظور تأیید این چارچوب و ORF مورد نظر، از نرم‌افزار BLASTp[13] استفاده شد. همردیفی چندگانه با استفاده از برنامه[14]Clustal Omega و رسم درخت فیلوژنتیکی با استفاده از برنامه[15]MEGA 6 انجام شد. پس از تأیید توالی مورد نظر، دو آغازگر در خارج و داخل ناحیه ORF ناحیه طراحی شدند (جدول 1). ویژگی­ها و برهمکنش­های احتمالی آغازگرها با استفاده از نرم­افزار آنلاین OligoAnalyzer 3.1[16] بررسی شد.

ساخت cDNA ، همسانه­سازی و توالی­یابی ژن استریکتوزیدین خشخاش

استخراج RNA با استفاده از کیت خالص­سازی RNAی گیاه و قارچ شرکت Topaz top (mini-prep) و بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد و جهت حذف آلودگی­های احتمالی DNA، آنزیم DNase I (TIANGEN Biotech (Beijing) Co., Ltd., cat No.: RT411, China) مورد استفاده قرار گرفت.

کیفیت RNA از طریق دستگاه نانودراپ شرکت Epoch BioTek و ژل آگارز یک درصد بررسی شد.  cDNA در حجم µl20 با استفاده از OligodT و آنزیم

جدول ‏1-  اسامی و مشخصات آغازگرهای اختصاصی طراحی شده در بخش­های مختلف این تحقیق

Table 1. Names and characteristics of specific primers designed in different parts of this research

رونوشت­بردار معکوس M-MuLV[17] شرکت SolisBiodyne و با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده ساخته شد. برای تعیین دمای اتصال بهینه آغازگرها، از PCR با شیب دمایی و دمای 51 درجه سانتی­گراد (به­عنوان دمای بهینه اتصال) استفاده شد. سپس PCR با ترکیب­های آغازگری F1+R1، F2+R2، F1+R2 و F2+R1 انجام شد. قطعه تکثیر شده از ORF به‌وسیله کیت PCR product clean up شرکت Sigma از روی ژل تخلیص و در وکتور TA cloning (pTG19-T) شرکت Vivantis همسانه­سازی شد. در ضمن، از باکتری E-Coli سویه DH5α به‌عنوان میزبان استفاده شد. برای شناسایی و تأیید همسانه‌های تراریخت، واکنش PCR با استفاده از آغازگر‌های اختصاصی انجام شد. پس از تأیید و کشت همسانه انتخاب‌ شده، استخراج پلاسمید با استفاده از کیت شرکت Topaz انجام و با هدف توالی­یابی به شرکت سیناکلون ارسال شد. سپس نتایج حاصل از توالی­یابی با توالی مورد توافق، هم‌ردیف و مقایسه شدند. در نهایت، آغازگرهای مورد نظر با هدف تایید توالی ژن هدف و انجام واکنش RT- PCR طراحی شدند.

جداسازی انتهای 3'UTR

به­منظور جداسازی انتهای 3'UTR از روش RACE-PCR[18] استفاده شد. برای ساخت cDNA، از نوعی OligodT تغییریافته حاوی یک توالی 25 نوکلئوتیدی در قسمت انتهایی آن (یعنی بعد از توالی 18 نوکلئوتیدی تیمین) استفاده شد (بنابراین به انتهای '3 تمام cDNAهای سنتز‌شده، یک توالی 25 نوکلئوتیدی اضافه شد). در مرحله بعد با توجه به توالی اضافه‌ شده، دو آغازگر مکمل با طول­های متفاوت (Short-Primer , Long-Primer) (جدول 1) طوری طراحی شدند که بعد از سنتز، دو قطعه همپوشان را تکثیر کنند. غلظت نهایی Buffer، MgCl2، dNTP، هر یک از آغازگرهای رفت و برگشت و Taq Polymerase به ترتیب 1X،  1X، 35/0 میلی مولار، یک پیکومول و 125/0 واحد برمیکرولیتر بود. به‌این ‌ترتیب با استفاده از آغازگرهای آشیانه­ای و نیز دو آغازگر Long و Short وجود ژن مورد نظر تأیید و توالی 3'UTR از ژن استریکتوزیدین جداسازی شد. طی اولین PCR، از cDNA تغییریافته­ و آغازگرهای F2 و Long-Primer و در مرحله بعد، از محصول اولین PCR همراه با آغازگرهای F1 و Short-Primer استفاده شد. سپس قطعه تکثیری با طول مورد انتظار خالص­سازی، همسانه­سازی و توالی­یابی شد.

پیش­بینی مکان درون سلولی و مدل­سازی پروتئین

به‌منظور شناسایی موقعیت اسیدهای آمینه­ موجود در زنجیره‌های ساختار پروتئین، از برنامه آنلاین PORTER[19] و [20]PDB Sum استفاده ‌شد. همچنین از برنامه آنلاین Predict NLS[21] و [22]PSORT جهت پیش‌بینی مکان قرارگیری پروتئین STR و از برنامه آنلاین Signal P[23] به‌منظور پیش‌بینی وجود و عدم وجود Signal peptide و مکان قرارگیری آن­ها استفاده شد. برنامه آنلاینBlastP  با هدف شناسایی شبیه­ترین ساختار احتمالی به توالی پروتئینی حاصله در پایگاه (PDB)[24] مورد استفاده قرار گرفت. با توجه به نتایج حاصل از پایگاه PDB، از ساختار NMR STR1 در Rauvolfia serpentina (شناسه PDB: 2FP8) به­عنوان الگو استفاده شد و با استفاده از نرم­افزار Modeller ver. 9.14، ساختاری کلی برای توالی STR استخراج ‌شده از گیاه خشخاش پیش‌بینی شد.

از بین 1000 مدل ساخته شده توسط نرم افزار Modeller، بهترین مدل­ با کمک دو معادله ارزیابی­کنندة  Dope score وMolpdf  (با کمترین میزان  (Dope score انتخاب شد و برای شبیه ­سازی دینامیکی مورد استفاده قرار گرفت. از برنامهGROMACS 5.0.2  به­منظور بررسی دینامیک مولکولی ساختار پروتئینی پیش­بینی شده و اطمینان از صحت پیش­بینی ساختار استفاده شد. زمان شبیه­سازی 20 نانوثانیه و گام­ها معادل دو فمتو ثانیه درنظر گرفته شد و از مدل آبSPC [25] ویژه Force Field GROMOS96 43a1 در این شبیه­سازی دینامیک مولکولی استفاده شد. برای خنثی­سازی سیستم و ایجاد تعادل بار، دو یون سدیم به جای مولکول­های آب به سیستم اضافه شد. پس از ساخت و تأیید مدل، مدل و زنجیره­های جانبی آن با استفاده از برنامه­ SCWRL (@tome2 V. 2.2) بهینه شدند. جهت ارزیابی مدل­های ساخته‌شده از نرم­افزار آنلاین [26]ProSa-Web استفاده شد. همچنین با استفاده از نرم­افزار آنلاین RAMPAGE[27]، نمودار راماچاندران مدل بهینه شده ترسیم شد.

کمی­سنجی رونوشت­های ژن استریکتوزیدین

در این تحقیق، میزان بیان ژن استریکتوزیدین در دو گونه­ Papaver somniferum و Papaver bractatum با استفاده از روش Quantitative Real time PCR در چهار بافت غوزه، برگ، ساقه و ریشه مورد بررسی قرار گرفت. RNA از تمام بافت­ها با استفاده از کیت شرکت Topaz استخراج و کیفیت و کمیت آن با استفاده از نانوداراپ و ژل آگارز یک درصد تعیین شد. از دو ژن خانه­دارActin  (Gholami et al., 2013) و Elongation factor 1 α (Cutri, 2013) به­عنوان ژن مرجع استفاده شد (جدول 1). از بین این دو ژن، بهترین گزینه با استفاده از نرم‌افزارهای Bestkeeper-1  و geNorm (Pfaffl et al., 2004) انتخاب شد. واکنش­ها qRT-PCR در حجم µl20 و با استفاده از Cybergreen Master mix 2x شرکت Ampliqon در دستگاه BioRad (mini opticum) )با سه تکرار بیولوژیکی) انجام شد. مرحله اولیه واکنش در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 900 ثانیه در نظر گرفته شد. سپس واکنش اصلی در 35 چرخه و با دمای 95 درجه سانتی­گراد (30 ثانیه)، 60 درجه سانتی­گراد (30 ثانیه) و 72 درجه سانتی­گراد (20) ثانیه انجام شد. واکنش کنترل منفی، شامل استفاده از تمامی ترکیبات واکنش به‌جز cDNA جهت بررسی احتمال آلودگی خارجی به­کار گرفته شد. به­منظور تجزیه داده­های qRT-PCR، بیان نسبی هر ژن بر اساس روش منحنی استاندارد نسبی[28] بر پایه فرمول 2^-ΔΔCt  (Livak and Schmittgen, 2001) محاسبه شد.

نتایج و بحث

سرهم کردن قطعات EST و خوانش­ها، تعیین توالی کانتیگ توافقی و ترسیم درخت فیلوژنی

از ESTها به­منظور دست­یابی به توالی توافقی ژن­های فاقد اطلاعات در بانک­های اطلاعاتی استفاده می­شود. از آن‌جا که ESTها مجموعه­ا­ی از قطعات همپوشان هستند که به‌صورت تکرار شونده­ توالی­یابی شده­اند، بنابراین ممکن است توالی­های تکراری در قسمت­های همپوشان با سایر قطعات تا حدودی متفاوت باشند. این ویژگی باعث ایجاد خطا در به­دست آوردن توالی توافقی خواهد شد؛ به­همین دلیل برای دست­یابی به نتایج مطمئن ابتدا باید این توالی­ها را از مجموعه هدف حذف کرد. به این روش اصطلاحا یکپارچه­سازی اطلاق می‌شود. در این پژوهش، در مجموع 200 توالی EST حاصل از همردیفی محلی با کمک برنامه BLAST انتخاب شدند. تعداد توالی­های EST بعد از فرآیند یکپارچه­سازی به 180 عدد کاهش یافتند و در مرحله بعدی با استفاده از برنامه  Codoncode alignerسرهم­بندی شدند. طول توالی توافقی حاصل از سرهم­بندی توالی­های EST 1468نوکلئوتید بود. تعیین چارچوب قرائت مناسب به­وسیله نرم­افزار ORF finder، وجود یک قطعه به طول 1179 باز (از باز 181 الی 1359) را در فریم 2- تایید کرد. پس از همسانه­سازی و توالی­یابی قطعه مورد نظر، توالی آن با شماره دستری KP143741 در پایگاه NCBI ثبت شد. با انجام BLASTp علاوه بر تأیید صحت توالی انتخاب شده، توالی­های ارتولوگ ژن مورد نظر نیز انتخاب و ذخیره شدند. پس از انجام همردیفی چندگانه با استفاده از برنامه CLUSTAL Omega، درخت فیلوژنی بر اساس روش Maximum Likelihood (ML) با تست BootStrap 1000 ترسیم شد (شکل 1).

نتایج حاصل از درخت فیلوژنتیکی نشان می­دهد که خشخاش، دارای بیشترین قرابت از نظر ژن مذکور با گیاهان کاکائو و انگور می­باشد (شکل 1). علاوه بر این، محدوده تقریبی دمین پروتئین استریکتوزیدین پیش­بینی و جهت تایید آن از پایگاه های اطلاعاتی پروتئین InterPro استفاده شد. بر اساس نتایج حاصل، دمین عملکردی پروتئین استریکتوزیدین شامل باقیمانده‏های 181 تا 268 بود (شکل 2).

واکنش PCR آشیانه‏ای

بعد از شناسایی توالی توافقی ژن استریکتوزیدین در خشخاش، از واکنش PCR آشیانه­ای و آغازگرهای مختلف (جدول 1) به­منظور تایید این توالی استفاده شد. با توجه به شکل 3، دو آغازگر طراحی شده از قسمت­های داخلی ژن استریکتوزیدین به­صورت کاملا اختصاصی تکثیر شده­اند؛ بنابراین ناحیه داخلی ORF در یک ناقل مناسب همسانه­سازی شد. با انجام PCR بر روی کلنی­های حاصل (شکل 3)، استخراج ناقل و توالی­یابی به­صورت دوطرفه هویت قطعه تکثیری تایید شد. نتایج حاصل از توالی­یابی وجود یک قطعه تقریبا 1500 جفت نوکلئوتیدی را مطابق با نتایج آنالیزهای بیوانفورماتیکی (همردیفی ESTهای سرهم­بندی شده) تایید کرد.

واکنش RACE-PCR

به­منظور تایید دقیق­تر توالی ژن استریکتوزیدین و نیز پیش­بینی طول 3ˈ UTR این ژن، از روش RACE-PCR استفاده شد. قطعات حاصل از آغازگرهای اختصاصی RACE-PCR (جدول 1)، دارای طولی در حدود 1400-1500نوکلئوتید بودند (شکل 3). از آن‌جا که طول چارچوب قرائت باز در این ژن تقریبا 1200 نوکلئوتید بود، بنابراین طول ناحیه 3ˈ UTR این ژن تقریبا برابر با 200 نوکلئوتید می­باشد (شکل 4). اندازة قطعات تکثیر شده بر اساس توالی مورد توافق با قطعات تکثیر شده بر روی ژل آگارز، بیانگر صحت تکثیر ناحیه 3́  توالی مورد توافق می­باشد.

شکل 1- درخت فیلوژنی حاصل از توالی­های اورتولوگ ژن استریکتوزیدین بر اساس مدل Maximum Likelihood (ML) با استفاده از نرم افزار Mega 5

Figure 1. Phylogenetic tree obtained from orthologous sequences of STR gene based on Maximum Likelihood (ML) model using Mega 5 software) V. vinifera (XP_002278088.1), T. cacao (EOY33230.1), P. trichocarpa (EEE82963.2), R. communis (EEF48687.1), M. truncatula (KEH29729.1), A. thaliana (AEE28296.1), P. mume (XP_008230556.1), C. melo (XP_008453519.1), A. lyrata (EFH50300.1), Z. mays (DAA51393.1), P. massoniana (AGU43759.1), C. arietinum (XP_004493426.1), G. max (XP_003554139.1), S. lycopersicum (XP_004249227.1), S. tuberosum (XP_006351273.1), C. sinensis (XP_006494390.1), F. vesca (XP_004307669.1), R. serpentina (P68175)(.

شکل 2- بخشی از نتایج همردیفی توالی­های ارتولوگ در چهار گونه Vitis vinifera (XP_002278088.1)، Theobroma cacao (EOY33230.1)، Populus trichocarpa (EEE82963.2)، Rauvolfia serpentina (P68175) با توالی ORF خشخاش به منظور شناسایی دمین­های حفاظت شده و جایگاه­های فعال (نواحی خاکستری رنگ شامل دمین عملکردی استریکتوزیدین دارای بیشترین حفاظت شدگی است).

Figure 2. A part of P. somniferum CLUSTAL W2 alignment with four other species Vitis vinifera (XP_002278088.1), Theobroma cacao (EOY33230.1), Populus trichocarpa (EEE82963.2), Rauvolfia serpentina (P68175) to find the STR conserved domain and active site (the highlighted grey amino acids and marked with upside green bars).

مکان­یابی درون سلولی پروتئین استریکتوزیدین

جهت پیش­بینی محل ذخیره و قرارگیری آنزیم استریکتوزیدین، از برنامه PSORT و نرم­افزار Predict NLS استفاده شد. نتایج این پژوهش نشان داد که محل ذخیره و قرارگیری آنزیم استریکتوزیدین در واکوئل است. نتایج پژوهش Deus-Neumann & Zenk,  1984))، سیتوسول را به­عنوان محل قرارگیری و ذخیره این آنزیم پیش­بینی کرد، درحالی­که در سال­های 1991 و 2003 طی دو پژوهش متفاوت، واکوئل به­عنوان محل صحیح قرارگیری و ذخیره تایید شد (Hashimoto & Yamada, 2003; Salim & De Luca, 2013).

شکل 3- محصول واکنش PCR آغازگرهای آشیانه­ای) شکل سمت راست) آغازگرهای F1 و R1، 2) آغازگرهای F1 و R2، 3) آغازگرهای F2 و R1، 4) آغازگرهای F2 و R2.  محصول کلنی PCR ژن  STR(جهت تشخیص همسانه­های حاوی قطعات توالی مورد نظر) ( شکل سمت چپ).

Figure 3. PCR product reaction of nested primers (right figure) F1 and R1 primers, 2) F1 and R2 primers, 3) F2 and R1 primers, 4) F2 and R2 primers. STR gene PCR colony product (to identify clones containing the desired sequence fragments) (left figure).).

شکل 4- الکتروفورز محصولات واکنش­ RACE-PCR بر روی ژل آگارز یک درصد، چاهک یک: ترکیب دو آغازگر F1 و R1، چاهک دو: محصول RACE-PCR دوم، چاهک سه: ترکیب دو آغازگر F2 و R2 و چاهک چهار: محصول RACE-PCR اول.

Figure 4.  Electrophoresis of RACE-PCR reaction products on 1% agarose gel, 1: combination of two primers F1 and R1, 2: RACE-PCR product II, 3: combination of two primers F2 and R2 and 4: product RACE-PCR first.

با توجه به نتایج حاصل از برنامه آنلاین Signal P، پروتئین استریکتوزیدین احتمالا در 19 آمینواسید ابتدایی دارای سیگنال پپتید می­باشد. در حقیقت، احتمال وجود سیگنال پپتید در آمینواسید شماره 19 بیش از 98 درصد پیش­بینی شد. در ضمن نتایج این پژوهش نشان داد که این پروتئین دارای تغییرات پس از ترجمه در شبکه آندوپلاسمی و دستگاه گلژی می­باشد. نتایج پژوهش­های آزمایشگاهی بر روی پروتئین استریکتوزیدین در گیاهان مختلف وجود سیگنال پپتید در قسمت­های ابتدایی توالی (آمینواسیدهای 30-1) و گلیکوزیلاسیون در نواحی 100-90 را تایید کرده­اند (Kutchan et al., 1988; Bracher & Kutchan, 1992; Pasquali et al., 1992).

پیش­بینی ساختمان دوم و سوم پروتئین استریکتوزیدین

پس از تایید توالی نوکلئوتیدی ORF ژن استریکتوزیدین، توالی پروتئینی این ژن با هدف شناسایی ویژگی­های پروتئین شناختی آن بررسی شد. نتایج حاصل از آنالیز ساختمان اول پروتئین استریکتوزیدین نشان داد که این پروتئین با 392 آمینواسید دارای وزن مولکولی 99/43 کیلودالتون است و نقطه ایزوالکتریک آن برابر با 52/7 می­باشد. در این پژوهش موقعیت هر آمینواسید در توالی پروتئین نهایی و جایگاه آن­ها در ساختار سه بعدی پروتئین با استفاده از برنامه PORTER بررسی شد.  نتایج نشان داد که از مجموع 392 آمینواسید تشکیل دهنده پروتئین استریکتوزیدین در گیاه خشخاش، 18/9 درصد در تشکیل پیچ­ها[29]، 40 درصد در تشکیل صفحات و رشته­ها[30] و حدود 76/50 درصد در تشکیل مارپیچ­ها[31] شرکت می­کنند.

در این تحقیق، پیش­بینی ساختمان سوم با استفاده از توالی آمینواسیدی و انتخاب بهترین الگو انجام شد. در حقیقت، الگو شبیه­ترین ساختار احتمالی موجود در پایگاه­های اطلاعاتی می­باشد که از طریق مطالعات آزمایشگاهی به­دست آمده است. در پژوهش حاضر، از ساختار پروتئین Strictosidine synthase در پایگاه PDB متعلق به گیاه Rauvolfia serpentine به­عنوان الگو برای پیش­بینی ساختار سوم با استفاده از برنامه Modeller استفاده شد. در این برنامه، جهت انتخاب بهترین مدل از فاکتوری با عنوان "Dope Score"[32] استفاده می­شود و مقادیر کمتر از این فاکتور بیانگر دقت بیشتر مدل پیش­بینی شده است (Webb & Sali, 2014). بنابراین، در بین مدل­های پیشنهادی توسط نرم­افزار Modeller، مدل با کمترین Dope Score انتخاب شد و در مرحله بعدی، این مدل پیش­بینی شده با استفاده از برنامه SCRWL بهینه شد.

شناخت خطاها در مدل­های تجربی و نظری ساختارهای پروتئینی پیش­بینی شده، یک مشکل عمده در زیست­شناسی ساختاری محسوب می­شود. برنامه آنلاین ProSA-Web، میزان تطابق مدل پیش­بینی شده را با مدل واقعی (نتیجه حاصل از تجزیه و تحلیل­های آزمایشگاهی) مقایسه و برای هر مورد یک امتیاز (Z-Score) را محاسبه می­کند (Sippl, 1993; Wiederstein & Sippl, 2007). در صورتی­که این امتیاز خارج از محدوده مورد نظر برای پروتئین­های شناخته شده باشد، ساختار پیش­بینی شده احتمالا صحیح نخواهد بود. امتیاز قابل قبول برای این برنامه بین 15-2 (قدر مطلق) است (Wiederstein & Sippl, 2007). نتایج Z-Score برای مدل پیش­بینی شده توسط Modeller و نیز مدل بهینه شده (توسط برنامه SCRWL) به­ترتیب برابر با 29/5- و 55/6- بود. از آن‌ جا که امتیازهای مذکور در محدوده قابل قبول قرار داشتند، بنابراین مدل پیش­بینی شده توسط نرم­افزار Modeller و مدل بهینه شده آن دارای کیفیت مناسبی بودند و احتمالا با آن‌چه که در طبیعت می­تواند وجود داشته باشد نیز تطابق دارند (شکل 5).

ارزیابی مدل‏ بر اساس پلات راماچاندران

پس از انتخاب مدل پیش­بینی شده توسط Modeller (V9.14) و بهبود زنجیره های جانبی آن، از برنامه [33]RAMPAGE به­منظور بررسی صحت ساختار سه­­بعدی پروتئین استریکتوزیدین استفاده شد. بر اساس نمودار راماچاندران (شکل 6)، تمام زوایای موجود، در نواحی مجاز واقع شده­اند و مدل پیش­بینی شده از لحاظ نوع و مکان قرارگیری زوایای موجود در آن قابل قبول است.

دینامیک مولکولی

به­منظور مطالعه پایداری ساختار پیش­بینی شده ژن استریکتوزیدین، از برنامه شبیه­ساز دینامیک مولکولیGROMACS 5.0.2  با دو پارامتر RMSD و RMSF[34] استفاده شد. شیب نمودارRMSD ، بیان­کننده پایداری مدل در طول زمان شبیه­سازی (20 نانوثانیه( است. در حقیقت، هر چه این شیب به صفر نزدیکتر باشد، مدل شبیه­سازی شده پایدارتر خواهد بود. از طرفی، چنانچه شیب به تدریج افزایش یابد و یا دارای نوسان زیادی باشد، مدل ناپایدار است. در مورد مدلRSDM، هیچ ناپایداری در طول زمان شبیه­سازی مشاهده نشد (شکل 7). میزان انعطاف­پذیری بخش­های مختلف پروتئین در شکل 8 قابل مشاهده است. باقیمانده­های تشکیل­دهنده جایگاه فعال آنزیم (در محور افقی نمودار با پیکان سبز رنگ مشخص شده­اند)، دارای بیشترین انعطاف­پذیری یعنی بین 5/1 تا 5/2 نانومتر بود، درحالی­که باقیماندهای نواحی ساختارهای ثانویه شامل مارپیچ آلفا و صفحه­های بتا و پیچ­ها، دارای کمترین انعطاف­پذیری بودند. در حقیقت، این نتایج بیانگر تطابق کامل با وظیفه ساختاری این نواحی از پروتئین است (شکل 8)

شکل 5- ساختار سوم پیش­بینی شده و بهینه شده پروتئین استریکتوزیدین در گیاه خشخاش با استفاده از برنامه Modeller و SCRWL

Figure 5. Predicted and optimized structure of Strictosidine synthase protein in Papaver somniferum y using Modeller and SCRWL

شکل 6- نمودار راماچاندران حاصل از برنامه آنلاین RAMPAGE برای مدل بهبود داده شده پروتئین استریکتوزیدین

Figure 6.  Ramachandran diagram derived from RAMPAGE online program for the improved model of STR protein

شکل 7- نمودار RMSD پروتئین استریکتوزیدین در برنامه GROMACS

Figure 7.  RMSD diagram of PsSTR protein in GROMACS program

شکل 8- نمودار RMSF پروتئین استریکتوزیدین در برنامه GROMACS. نمادهای رنگی در پایین نمودار بیانگر مقادیر نوسان در مناطق مختلف ساختار هستند. پیکان­ها، اشکال مارپیچ و خطوط نازک به ترتیب نشان­دهنده α-Helix ، β-Turns و حلقه­ها هستند.

Figure 8. RMSF diagram of PsSTR protein in GROMACS program. The coloured symbols at the bottom of the graph indicate fluctuation values in different regions. The arrow, spiral-like and thin line shapes corresponded to α-Helix, β-Turns and loops respectively.

بیان ژن استریکتوزیدین در گیاه خشخاش و شقایق کبیر

با توجه به این­که دو بافت ریشه و کپسول، به­ترتیب در خشخاش و شقایق کبیر دارای کمترین میزان بیان نسبت به سایر بافت­ها بودند، در نتیجه از آن­ها به­عنوان بافت پایه به­منظور نرمال­سازی استفاد شد. میزان بیان ژن استریکتوزیدین در گیاه خشخاش در بافت برگ، ساقه و غوزه به­ترتیب 12، 09/4 و 3/1 برابر ریشه بود. در گیاه شقایق کبیر، ریشه دارای بیشترین بیان (بیش از  پنج برابر) بود، درحالی­که ساقه (بیش از سه برابر) و برگ (بیش از 5/2 برابر) رتبه­های بعدی را به خود اختصاص دادند ( شکل 9). به‌طورکلی، میزان بیان ژن استریکتوزیدین در گیاه خشخاش به­صورت معنی­داری بیشتر از شقایق کبیر بود. کمترین میزان بیان بین بافت‌های هر دو گیاه مربوط به کپسول P. bracteatum بود و ریشه خشخاش، برگ و ساقه شقایق کبیر، کپسول خشخاش، برگ شقایق کبیر و ساقه و برگ خشخاش رتبه­های بعدی را به خود اختصاص دادند. بین بافت با بیشترین (برگ خشخاش) و کمترین میزان بیان (کپسول شقایق کبیر)، 30 برابر اختلاف مشاهده شد (جدول 2).

تاکنون حضور و بیان ژن استریکتوزیدین در گیاهان مختلفی از قبیل آرابیدوپسیس (Sohani et al., 2009) و Ophiorrhiza japonica (Lu et al., 2009) به اثبات رسیده است. در گیاهانی نظیر درخت زندگی[35] و Ophiorrhiza pumila، بیشترین میزان بیان به­ترتیب در گل­های بالغ، برگ ها، ساقه و ریشه گزارش شده است (Yamazaki et al., 2003b). این مسئله در مورد گیاه پروانش و Ophiorrhiza japonica تا حدودی متفاوت است، چراکه پروفایل بیانی آن‌ها، بیانگر کمترین میزان بیان در ساقه بود (Sibéril et al., 2001; Lu et al., 2009). نتایج پژوهش حاضر نشان داد که در هر دو گونه، بافت غوزه دارای بیان نسبی کمتری نسبت به سایر بافت­ها بود. در شقایق کبیر، ریشه بیشترین و غوزه کمترین میزان بیان را به خود اختصاص دادند. تفاوت بسیار معنی­داری دو رقم فوق (که متعلق به یک گونه نیز می باشند) و نتایج متناقض سایر محققین، احتمالا با پیچیدگی های سیستم بیانی این ژن در گیاهان مختلف مرتبط می­باشد. این موضوع، احتمالا با تکامل واگرای[36] این سیستم و ژن در طول تکامل مرتبط است (Lu et al., 2009). بیان این ژن تحت تاثیر انواع تنش­ها و محرک های محتلف قرار می­گیرد. از  آن‌جا که محرک های غیرزیستی از قبیل متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید به‌طور قابل ملاحظه ایی بیان این ژن و در نتیجه تولید ایندول آلکالوئیدها را در Ophiorrhiza japonica افزایش می­دهند (Lu et al., 2009)، بنابراین افزایش در بیان ژن استریکتوزیدین به‌طور مستقیم باعث افزایش تولید ایندول آلکالوئیدها می­شود. به­طورکلی، وجود موتیف‏های حفاظت شده در توالی‏های بالادستی (از جمله بخش‏های G-box) و راه‏انداز به­منظور پاسخ به محرک‏ها ضروری است. حضور توالی های G-box در نقاط مختلف توالی های راه انداز در پاسخ به محرک های غیرزیستی نقش دارند. همچنین عوامل رونویسی متعددی از قبیل bHLH و MYC که وجود آن‌ها در گیاهانی از قبیل گوجه فرنگی و آرابیدوپسیس به اثبات رسیده است، نیز در پاسخ به این محرک ها دخیل هستند (Yang et al., 2015).

شکل 9-  مقایسه سطح بیان ژن استریکتوزیدین در بافت­های مختلف گیاه (A  خشخاش، (B  شقایق کبیر و (C  تفاوت نسبی بین دو گیاه. 

Figure 9. Comparison of STR gene expression level in different plant tissues A) Papaver somniferum, B) bracteatum Papaver and C) relative difference between two plants

جدول 2- مقایسه سطوح نسبی بیان ژن استریکتوزیدین در بافت‌های متناظر بین دو گونه P. somniferum  و P. bracteatum

Table 2. Comparison of relative levels of STR gene expression in the corresponding tissues between
 P. somniferum and P. bracteatum

تجزیه‌ و تحلیل عملکردی راه‌انداز ژن استریکتوزیدین نشان داده است که توالی‏های تنظیمی سیس[37] نیز در واکنش به محرک‌ها دخیل هستند. این توالی­ها در تعامل با دمین‌های AP2/ERF عوامل رونویسی ORCA2 و ORCA3 عمل می‌کنند (Sibéril et al., 2001). در حقیقت، عوامل رونویسی AP2/ERF با اتصال به نقاط CBF2 در پاسخ به محرک‌های مربوطه تأثیر‌گذار هستند. وجود توالی‌های CBF2 در راه‌انداز ژن‌های TDC و STR به اثبات رسیده است. شدت نور UV خورشید نیز از جمله محرک‌های تأثیرگذار محسوب می­شود (Dutta et al., 2007). اعضای خانواده Papaveraceae گیاهانی روزبلند هستند و به شدت نوری در حدود 16 کیلو لوکس نیاز دارند. در صورت عدم وجود نور کافی، خشخاش کوتاه‌تر و گل­دهی در آن تسریع می‌شود.  وجود نور کامل پس از ظهور اولین غنچه‌ها، باعث افزایش میزان متابولیت های ثانویه به بیشترین میزان خود می شود، البته این مسئله در مورد بافت ها و اندام هایی که در معرض تابش مستقیم نور خورشید هستند، موثرتر است (Bernáth et al., 1988). بنابراین تولید بیشتر mRNA کدکننده استریکتوزیدین در گیاه خشخاش، با توجه به وجود توالی های CBF2 و عوامل رونویسی AP2/ERF در بافت‌های هوایی برگ و ساقه، بیانگر همین موضوع می‌باشد. جست‌وجوی توالی توافقی تنظیمی سیس در راه انداز STR، حضور G-box را در نزدیکی عامل رونویسی ORCA2 به اثبات رسانده است (Sibéril et al., 2001). همچنین وجود G-box مشابه راه‏انداز استریکتوزیدین در راه‏انداز ژن TDC که کدکننده آنزیم Tryptophan decarboxylase می‌باشد نیز به اثبات رسیده است (Ouwerkerk et al., 1999) که این مسئله احتمالا بیانگر تنظیم همزمان این دو ژن می­باشد. شواهدی مبنی بر ‏تنظیم هم­بیانی ژن های TDC و استریکتوزیدین در گیاه Ophiorrhiza pumila تایید شده است (Yamazaki et al., 2003a). 

الگوی بیان حاصل از این پژوهش در هر دو گیاه مورد بررسی ممکن است تحت تاثیر شرایط فیزیولوژیکی و محیطی و بافت‌های مختلف قرار گیرد؛ به­عنوان مثال، در این تحقیق با وجود نور بیشتر در قسمت هوایی شقایق کبیر (ساقه و برگ)، ریشه بیشترین بیان را به خود اختصاص داد. احتمالا این موضوع بیانگر وجود ساختار متفاوت راه‏انداز و یا پیام‏های سلولی ناشناخته­ مختلف در بافت‏های متفاوت است. با توجه به این مسئله، احتمالاً وجود تفاوت بیان و همچنین الگوی بیانی متفاوت بین دو گونه خشخاش و شقایق کبیر در این پژوهش، ممکن است با رخداد­های به وقوع پیوسته در طی تکامل و انشقاق این دو از یکدیگر مرتبط باشد؛ تا آن‌جا که منجر به بروز چنین الگوی بیان متضادی در ریشه (بیشترین بیان در ریشه شقایق کبیر و کمترین بیان در ریشه خشخاش) شده است.

تعداد آمینواسید آنزیم استریکتوزیدین در اغلب گیاهان بسیار مشابه است و محدوده­ای بین 344 (Rauvolfia serpentina) تا 402 (Cucumis melo) را پوشش می­دهد (از این بین عدد 391 بیشترین فراوانی را به خود اختصاص داده است)  (Young et al., 2011; Motamayor et al., 2013). تفاوت معنی­دار در میزان بیان نسبی این ژن و نیز مقایسه آن با شقایق کبیر (تفاوت در میزان بیان و نیز نوع بافت کاملاً معنی­دار بود)، بیانگر میزان تولید بیشتر Strictosidine و احتمالاً تولید بیشتر ایندول آلکالوئیدها در خشخاش بود. درصورتی­که هدف از کشت و کار خشخاش، تولید مقادیر بیشتری آلکالوئیدها باشد، بیان بیشتر ژن این پروتئین علاوه بر اتلاف انرژی بیشتر (که می­تواند صرف تولید لاتکس در گیاه شود) می­تواند به سمت تولید ایندول آلکالوئیدها هدایت شود. در ضمن، یکی از پیش­ماده­های مشترک در تولید لاتکس و ایندول آلکالوئیدها، تریپتامین (Tryptamin) است که در این مورد نیز با تولید لاتکس در این گیاه در رقابت است. اطلاع از پروفایل بیان ژن استریکتوزیدین، امکان محاسبه این اتلاف را فراهم می­آورد.

نتیجه‌گیری کلی

نتایج این پژوهش در بخش همردیفی نشان داد که تغییرات زیادی در طی تکامل در آنزیم استریکتوزیدین رخ داده است. نقاط نزدیک به انتهای پروتئین، به­علت وجود دمین عملکردی، بسیار حفاظت شده است و همین امر باعث ایجاد عملکرد مشابه در گیاهان مختلف می­شود. از طرفی، وجود قسمت­های با حفاظت­شدگی کمتر و نیز طول­های متفاوت (که در گیاهان مختلف مشاهده می­شود)، باعث بروز تغییرات و تفاوت­هایی در شکل و جهت‏گیری فضایی این ژن شده­اند و طبیعتاً این تفاوت­ها و تاثیرات می­تواند بر میزان فعالیت و کارایی آن در گیاهان تأثیرگذار باشند. با در دست داشتن توالی دقیق ژن استریکتوزیدین، امکان دست­ورزی آن با استفاده از مهندسی ژنتیک فراهم می‌شود. همچنین داشتن آگاهی از توالی این ژن برای هر گیاه جهت تخمین میزان کارایی این آنزیم لازم است. علاوه بر این مسئله، در بررسی­های تکاملی، میزان قرابت بین همولوگ­های آن، تنها با داشتن تمام آمینواسیدهای موجود در توالی پروتئینی آن امکان­پذیر خواهد بود.

REFERENCES

1. Bernáth, J., Dános, B., Veres, T., Szantó, J. & Tétényi, P. (1988). Variation in alkaloid production in poppy ecotypes: responses to different environments. Biochemical Systematics and Ecology, 16, 171–178.
2. Bracher, D. & Kutchan, T. M. (1992). Strictosidine synthase from Rauvolfia serpentina: analysis of a gene involved in indole alkaloid biosynthesis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 294, 717–723.
3. Cutri, L. (2013). Oaroma das flores de Passiflora spp na atração de polinizadores: uma abordagem bioquímica e molecular. Ph.D. Thesis. Universidade Estadual de Campinas, Brazil.
4. Deus-Neumann, B. & Zenk, M. H. (1984). A highly selective alkaloid uptake system in vacuoles of higher plants. Planta, 162, 250–260.
5. Dutta, A., Sen, J. & Deswal, R. (2007). Downregulation of terpenoid indole alkaloid biosynthetic pathway by low temperature and cloning of a AP2 type C-repeat binding factor (CBF) from Catharanthus roseus (L). Plant Cell Reports, 26, 1869–1878.
6. Facchini, P. J., Huber-Allanach, K. L. & Tari, L. W. (2000). Plant aromatic L-amino acid decarboxylases: evolution, biochemistry, regulation, and metabolic engineering applications. Phytochemistry, 54, 121–138.
7. Gholami, M., Fakhari, A. & Ghanati, F. (2013). Selective Regulation of Nicotine and Polyamines Biosynthesis in Tobacco Cells by Enantiomers of Ornithine. Chirality, 25, 22–27.
8. Hashimoto, T. & Yamada, Y. (2003). New genes in alkaloid metabolism and transport. Current Opinion in Biotechnology, 14, 163–168.
9. Hirano, M. (2004). RACE Using only a gene-specific primer. Molecular Biotechnology, 27, 179–186.
10. Kutchan, T. M. (1993) Strictosidine: from alkaloid to enzyme to gene. Phytochemistry, 32, 493–506.
11. Kutchan, T. M., Hampp, N., Lottspeich, F. & Zenk, M. H. (1988). The cDNA clone for strictosidine synthase from Rauvolfia and expression in Escherichia coli. FEBS Letters, 237, 40–44.
12. Leonard, E., Runguphan, W., O’Connor, S. & Prather, K. J. (2009). Opportunities in metabolic engineering to facilitate scalable alkaloid production. Nature Chemical Biology, 5, 292–300.
13. Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{− ΔΔCT} Methods, 25(4), 402-408.
14. Lu, Y., Wang, H., Wang, W., Qian, Z., Li, L., Wang, J., Zhou, G. & Kai, G. (2009). Molecular characterization and expression analysis of a new cDNA encoding strictosidine synthase from Ophiorrhiza japonica. Molecular Biology Reports, 36, 1845–1852.
15. Ma, X., Panjikar, S., Koepke, J., Loris, E. & Stöckigt, J. (2006). The structure of Rauvolfia serpentina strictosidine synthase is a novel six-bladed beta-propeller fold in plant proteins. The Plant Cell, 18, 907–920.
16. Motamayor, J. C., Mockaitis, K., Schmutz, J., Haiminen, N., Donald, L., Cornejo, O., Findley, S. D., Zheng, P., Utro, F. & Royaert, S. (2013). The genome sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate genes regulating pod color. Genome Biology, 14, 53- 65.
17. Ouwerkerk, P. B. F., Trimborn, T. O., Hilliou, F. & Memelink, J. (1999). Nuclear factors GT-1 and 3AF1 interact with multiple sequences within the promoter of the Tdc gene from Madagascar periwinkle: GT-1 is involved in UV light-induced expression. Molecular and General Genetics, 261, 610–622.
18. Pasquali, G., Goddijn, O. J. M., de Waal, A., Verpoorte, R., Schilperoort, R. A., Hoge, J. H. C. & Memelink, J. (1992). Coordinated regulation of two indole alkaloid biosynthetic genes from Catharanthus roseus by auxin and elicitors. Plant Molecular Biology, 18, 1121–1131
19. Pfaffl, M. W. Tichopad, A., Prgomet, C. & Neuvians, T. P. (2004). Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters, 26, 509–515.
20. Salim, V. & De Luca, V. (2013). Towards complete elucidation of monoterpene indole alkaloid biosynthesis pathway: Catharanthus roseus as a pioneer system. Advances in Botanical Research, 68, 1–37.
21. Samanani, N., Liscombe, D. K. & Facchini, P. J. (2004). Molecular cloning and characterization of norcoclaurine synthase, an enzyme catalyzing the first committed step in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis. The Plant Journal, 40, 302–313.
22. Sibéril, Y., Benhamron, S., Memelink, J., Giglioli-Guivarc’h, N., Thiersault, M., Boisson, B., Doireau, P. & Gantet, P. (2001). Catharanthus roseus G-box binding factors 1 and 2 act as repressors of strictosidine synthase gene expression in cell cultures. Plant Molecular Biology, 45, 477–488.
23. Sippl, M. J. (1993). Recognition of errors in three‐dimensional structures of proteins. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 17, 355–362.
24. Webb, B. & Sali, A. (2014). Comparative protein structure modeling using Modeller. Current Protocols in Bioinformatics, 54, 5–6.
25. Wiederstein, M. & Sippl, M. J. (2007). ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Research, 35, 407–410.
26. Yamazaki, Y., Urano, A., Sudo, H., Kitajima, M., Takayama, H., Yamazaki, M., Aimi, N. & Saito, K. .(2003a). Metabolite profiling of alkaloids and strictosidine synthase activity in camptothecin producing plants. Phytochemistry, 62, 461–470
27. Yamazaki, Y., Sudo, H., Yamazaki, M., Aimi, N. & Saito, K. (2003b). Camptothecin biosynthetic genes in hairy roots of Ophiorrhiza pumila: cloning, characterization and differential expression in tissues and by stress compounds. Plant and Cell Physiology, 44, 395–403.
28. Yang, K., Rashidi-Monafared, S., Wang, H., Lundgren, A, & Brodelius, P. E. (2015). The activity of the artemisinic aldehyde Δ11 (13) reductase promoter is important for artemisinin yield in different chemotypes of Artemisia annua Plant Molecular Biology, 1–16.
29. Young, N. D., Debellé, F., Oldroyd, G. E. D., Geurts, R., Cannon, S. B., Udvardi, M. K., Benedito, V. A., Mayer, K. F. X., Gouzy, J. & Schoofm, H. (2011). The medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature, 480, 520–524.

[1]- Dastyl isoepoxide synthase

[2]- Dastyl ipoxide synthase

[3]- Neuroclaurin synthase

[4]-Benzyl isoquinoline

[5]- Open Reading Frame

[6]- Consensus

[7]- CDS (Coding DNA Sequence)

[8]- Expressed Sequence Tag (EST)

[9]  Reads

[10]- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra

[11]- Assemble

[12]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

[13]- Search protein database using a protein query

[14]- https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

[15]- http://www.megasoftware.net/mega.php

[16]- https://eu.idtdna.com/calc/analyzer

[17]- Reverse Transcriptase (RT)

[18]- Rapid amplification of cDNA ends

[19]- http://distill.ucd.ie/porter/

[20]- http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=index.html

[21]- https://www.predictprotein.org/

[22]- https://wolfpsort.hgc.jp/

[23]- http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

[24]- https://www.rcsb.org/

[25]- Simple point charge

[26]- https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php

[27]- http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.

[28]- Relative standard curve method

[29]- helix : DSSP's H (alpha helix) + G (3-10 helix) + I (pi-helix) classes

[30]- Strand : DSSP's E (extended strand) + B (beta-bridge) classes

[31]- The rest : DSSP's T (turn) + S (bend) + . (the rest)

[32]- Discrete Optimized Protein Energy

[33]- http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php

[34]- Root mean squared deviation (RMSD) and root mean squared fluctuation (RMSF)

[35]- Camptotheca acuminate

[36]- Divergent

[37]- Cis-regulatory element