پاسخ‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمایی لاین‌های حاصل از تلاقی ارقام گندم نورستار و پیشتاز تحت تنش سرما

مقدمه

گندم (Triticum aestivum L.) به دلیل سازگاری بالا به شرایط مختلف محیطی و اهمیت آن در امنیت غذایی (غذای اصلی 60 درصد از جمعیت جهان)، به‌طور وسیعی در سراسر جهان به‌طورکشت می­شود. تقاضا برای گندم در جهان با افزایش سریع رشد جمعیت در حال افزایش است (Ji et al., 2017: Ghasemi-Mobtaker et al., 2020; Hosseini et al., 2021). پیش­بینی می­شود که جمعیت جهان در سال 2025 از هشت میلیارد نفر بگذرد؛ از این رو میزان تولید این محصول هم از طریق افزایش سطح کشت و هم از طریق افزایش در واحد سطح باید افزایش یابد (Ji et al., 2017). دما یکی از مهم‌ترین عوامل محیطی محدود کننده تولید و توزیع جغرافیایی غلات از جمله گندم است و باعث کاهش چشمگیر عملکرد آن­ می­شود. گیاهان تحت تنش­­ سرما، دچار مجموعه­ای از تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی می­شوند که نهایتا تاثیرات نامطلوبی را بر رشد و تولید آن­ها به جای می­گذارد (Solanke & Sharma, 2008). تنش سرما منجر به حادث شدن تنش اکسیداتیو به دلیل شکل گرفتن گونه­های اکسیژن فعال (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H₂O₂) می­شوند که این ترکیبات باعث اختلال در واکنش­های انتقال الکترون، آسیب رساندن به لیپید­های غشا، پروتئین­ها، اسید­های نوکلئیک و دیگر واکنش­های بیوشیمیایی سلول می­شوند. بنابراین شکل­گیری ROSها منجر به آسیب سلولی و نهایتا مرگ گیاه می­شود. همچنین گیاهان با قرار گرفتن در شرایط دمای پایین، با سایر تنش­های محیطی دیگر نیز روبه رو می­شوند (Janská et al., 2010; Shen et al., 2018; Hosseini & saidi, 2019).

جهت تطابق با تنش سرما، غلات زمستانه از جمله گندم، مکانیسم­های انطباقی که توسط سرما تنظیم می­شود را توسعه داده­اند. پاسخ بهاره­سازی و عادت­دهی به سرما، مهم‌ترین مکانیسم­های بقای زمستانه در غلات است. این دو مکانیسم از طریق برهمکنش­های بیوشیمیایی و فیزیکی که به عوامل ژنتیکی و محیطی وابسته است، تنظیم می­شوند (Bond et al., 2011; Hosseini et al., 2016). پاسخ بهاره­سازی در گندم زمستانه به‌عنوان یک ویژگی انطباقی بحرانی^[1]، انتقال از مرحله رویش به مرحله زایشی را تا زمان قرار گرفتن در معرض یک دوره طولانی دمای پایین، به تاخیر می­اندازد. این مکانیسم به گندم زمستانه این قابلیت را می­دهد که زمستان را به‌صورت گیاهچه سپری کند؛ با این وجود، کاهش یا از بین رفتن تحمل سرما در ارقام گندم نیازمند نیاز بهاره­سازی، اغلب با اشباع نیاز بهاره­سازی در انتهای دوره رویشی شروع می­شود (Janmohammadi et al., 2015). از دیدگاه آناتومیکی، اشباع نیاز بهاره­سازی و شروع فاز زایشی، با شکل­گیری "برجستگی دوگانه" قابل رویت است. در طول سرما، ارقام زمستانه و بینابینی گندم، تعداد برگ نهایی خود را تا نقطه اشباع نیاز بهاره­سازی کاهش می­دهند، درحالی‌که ارقام بهاره، زمانی‌که تحت رژیم روز بلند قرار گیرند، به دلیل عدم نیاز بهاره­سازی به سرعت وارد فاز زایشی می­شوند (Mahfoozi et al., 2006). نیاز بهاره­سازی در گندم معمولی، Triticum aestivum L. (2n=42)، توسط سه ژن اصلی همولوگ شامل Vrn-A1، Vrn-B1 و Vrn-D1 که به‌ترتیب بر روی کروموزوم­های 5A، 5B و 5D قرار دارند، تنظیم می­شود. آلل غالب در یکی از این جایگاه­ها، باعث به‌وجود آمدن تیپ بهاره و حضور آلل­های مغلوب در هر سه جایگاه باعث شکل گرفتن تیپ زمستانه می­شود (Hosseini et al., 2016).

در شرایط مزرعه، بسیاری از گونه­های گیاهی به‌منظور مقابله با صدمات ناشی از سرما، توانایی افزایش تحمل به سرما را در خود افزایش می­دهند. این فرایند که از طریق قرارگیری در دماهای پایین بالای صفر در گیاهان شکل می­گیرد، حاصل القای تغییرات مهم متابولیکی و مولکولی در سلول­های گیاهی است و به‌عنوان عادت­دهی به سرما شناخته شده است. پاسخ عادت­دهی به سرما که در گندم از اهمیت ویژه­ای برخوردار است، منجر به طیف وسیعی از تغییرات در بیان ژن، ترکیب لیپید­های غشایی، اسمولیت­های سازگار، سطوح آنتی­اکسیدانت­های آنزیمی و غیرآنزیمی و صفات نموی می­شود. در طی فرایند عادت­دهی به سرما، گیاهان برای مقابله با تنش­های اکسیداتیو القا شده به‌وسیله سرما، آنتی­اکسیدانت­های آنزیمی از جمله کاتالاز (CAT)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، گایاکول پراکسیداز (GPX)، پلی­فنول اکسیداز (PPO) و آسکوربات پراکسیداز (APX) و آنتی اکسیدانت­های غیر آنزیمی از جمله پرولین را برای پاک­سازی ROSها فعال می­کنند. متابولیسم قندها، یکی دیگر از فرایندهای مرتبط با عادت­دهی به سرما است و نقش فعالی را در تنظیم رشد، فتوسنتز، تقسیم­بندی کربن، متابولیسم لیپید و کربوهیدرات، هموستازی اسمزی، سنتز پروتئین و بیان ژن بازی می­کنند. تجمع ROSها به‌طور مستقیم توسط قندها جهت کاهش آسیب ناشی از تنش­های محیطی تنظیم می­شود (Das & Roychoudhury, 2014; Sami et al., 2016; Czarnocka et al., 2018).

در سال­های، اخیر تغییرات آب و هوا و نوسانات دمایی بر تولید محصولات کشاورزی تاثیر گذاشته و به‌ویژه تنش سرما باعث کاهش سطح تولید گندم شده است. گرم شدن کره زمین و نوسانات دمایی، فرایند رشد و نمو گندم را تسریع کرده و منجر به اختلال در هماهنگ­سازی فصلی تولید مثل شده است؛ در نتیجه تنش سرما حتی در نواحی که کشت گندم انجام می­شود نیز می­تواند خسارت­زا باشد (Ji et al., 2017; Hosseini et al., 2021). بنابراین، درک عمیق تنظیمات نموی و ارتباط آن با تغییرات متابولیکی در طول فرایند عادت­دهی به سرما، مسیرهایی را که ژنوتیپ­های گندم با سرما سازگار می­شوند را مشخص می­کند. در مطالعه حاضر، ارقام بهاره و زمستانه گندم و لاین­های تقریبا ایزوژن و نوترکیب حاصل از تلاقی آن­ها که دارای نیاز بهاره­سازی و میزان تحمل به سرمای متفاوت هستند، جهت مطالعه تاثیر صفات نموی بر میزان تحمل به سرما، میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت، تجمع H₂O₂ و محتوی قند کل بررسی شد.

مواد و روش

شرایط کشت و نمونه­برداری

در این پژوهش، پنج ژنوتیپ گندم نان شامل ارقام پیشتاز (Pishtaz) و نورستار (Norstar)، دو لاین نوترکیب خالص (Recombinant inbred lines (RIL)) نسل هفت حاصل از تلاقی ساده رقم نورستار با پیشتاز با نیاز بهاره­سازی متفاوت از نظر زمان انتقال از مرحله رویشی به زایشی و یک لاین تقریبا ایزوژن Near isogenic line (NIL))) حاصل از چهار بار تلاقی برگشتی نسل F1  با والد بهاره (به‌عنوان پایه مادری) پیشتاز و چهار بار خودگشنی با احتمال 5/97 درصد ریخته ارثی از رقم پیشتاز مورد استفاده قرار گرفت. برنامه اصلاح گندم شامل بهبود تحمل به تنش سرما از طریق معرفی کردن صفات دخیل در سازگاری به ژرم­پلاسم­های تجاری است که چنین صفاتی ممکن است از طریق RILها و NILها شناسایی شوند. همه این ژنوتیپ­ها در شرایط مزرعه در اقلیم معتدل سرد (کرج) به مدت یک سال زراعی به‌صورت فاکتوریل و در قالب بلوک­های کامل تصادفی در سه تکرار ارزیابی شدند. فاکتورهای مورد ارزیابی شامل پنج عدد ژنوتیپ و چهار سطح نمونه­برداری بود. ژنوتیپ­ها در ایستگاه کرج با مشخصات جغرافیایی 51 درجه طول شرقی و  35 درجه عرض جغرافیایی و با ارتفاع 1321متر از سطح دریا در تاریخ اول مهر ماه کشت شدند. هر لاین در هر تکرار به طول سه متر در یک پشته و در سه ردیف به فاصله 20 سانتی­متر از یکدیگر کاشت شدند. میزان بذر مصرفی بر اساس 450 بذر در مترمربع در نظر گرفته شد. نمونه‌برداری در سه مرحله عادت­دهی به سرما شامل آذر ماه (60 روز پس از کشت)، دی ماه (90 روز پس از کشت) و بهمن ماه (120 روز پس از کشت) نمونه‌برداریانجام شد. همچنین همه این ژنوتیپ­ها در دمای 20 درجه سانتی­گراد با نور 200 میکرو مول بر متر مربع  بر ثانیه و 16 ساعت روشنایی به‌عنوان شاهد در شرایط اتاقک رشد کشت شدند و در مرحله چهار برگی از آن­ها نمونه­برداری شد. تمام نمونه‌ها در نیتروژن مایع فریز و سپس در یخچال 80- درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند.

ارزیابی روند تحمل به انجماد (آزمون انجماد)

جهت تعیین قابلیت تحمل به انجماد، از روش Mahfoozi et al., (2001) با تعیین LT₅₀ استفاده شد. از هر تکرار و هر رقم، تعداد پنج بوته از مزرعه جمع‌‌آوری شد و سپس طوقه گیاه (یک سانتیمتری بالا و زیر محل طوقه) برای آزمون انجماد آماده شد. در روش LT₅₀، طوقه گیاهان در داخل ظروف آلومینیومی حاوی ماسه نرم مرطوب در دمای 3- درجه سانتی­گراد به مدت 12 ساعت در فریزر نگهداری شد و سپس دمای فریزر، هر 30 دقیقه یک درجه سانتی­گراد کاهش یافت و این کاهش تا دمای 25- درجه سانتی­گراد ادامه داشت. در موعد هر دمای مشخص، نمونه­های مزبور از فریزر خارج شدند و پس از استقرار 12 ساعته در دمای چ درجه سانتی­گراد جهت ذوب تدریجی بافت یخ­زده، نمونه­ها به شرایط کنترل منتقل شدند و در بستری با بافت سبک کشت شدند. پس از سه هفته، بر اساس ارزیابی سیستم ریشه­ای و هوایی زنده و فعال، تعداد بوته­های مرده و زنده ثبت و بر این اساس، میزان LT₅₀ و تحمل سرما تعیین ­شد (Mahfoozi et al., 2001).

وضعیت توسعه مریستم انتهایی ساقه

جهت ارزیابی وضعیت نمو در مریستم انتهایی، پنج بوته در هر دوره عادت­دهی به سرما در شرایط مزرعه به ازای هر تکرار و ژنوتیپ، انتخاب شد و با تشریح بوته به کمک میکروسکوپ، وضعیت نمو در محل مریستم انتهایی ساقه به دقت مورد ارزیابی قرار گرفت. نکته مهم در این مرحله، تعیین وضعیت رویشی، برجستگی واحد و نیز برجستگی دوگانه به‌عنوان نماد وضعیت فیزیکی انتقال از مرحله رویشی به زایشی بود (Hosseini et al., 2016; Hosseini et al., 2021).

شمارش تعداد برگ روی پنجه اصلی

به‌منظور تعیین FLN در هر دوره عادت­دهی به سرما و شرایط کنترل، شش بوته برای هر تکرار و رقم به محیط اتاقک رشد با شرایط نرمال (دمای 1±19 درجه سانتی­گراد، رطوبت 65 درصد و طول روز 16 ساعت با شدت تشعشع 400 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه) منتقل شدند و تا موعد ظهور برگ پرچم، تعداد برگ روی پنجه اصلی به­‌طور متوالی شمارش  و بر این اساس FLN مشخص شد (Hosseini et al., 2016)

سنجش میزان H₂O₂

میزان H₂O₂ بر اساس روش Loreto & Velikova (2001) اندازه­گیری شد. 35/0 گرم برگ در داخل هاون چینی در ازت مایع به خوبی سائیده و با تری کلرواستیک اسید 1/. درصد هموژن شد. مخلوط هموژن شده با g ×12000 به مدت 15 دقیقه سانتیفوژ شد. 5/0 میلی­لیتر از مایع رویی برداشت شد و به 5/. میلی­لیتر بافر پتاسیم فسفات یک مولار و یک میلی­لیتر پتاسیم یدید یک مولار اضافه شد. میزان جذب مایع رویی در طول موج 390 نانومتر با اسپکتروفتومتر Shimadzu UV-160 اندازه­گیری شد. محتوای H₂O₂ با مقایسه منحنی کالیبراسیون استاندارد که قبلا با غلظت­های مختلف H₂O₂ ساخته شده بود تعیین شد. میزان H₂O₂ بر اساس میکرومول بر گرم وزن تر گزارش شد (Nazari et al., 2012).

استخراج و سنجش میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی

برای استخراج عصاره جهت سنجش آنزیم­ها، نمونه­ها (5/. گرم برگ) در نیتروژن مایع پودر و سپس در بافر استخراج (بافر Tris-HCL، حاوی 10 درصد گلیسرول، pH: 7.8 ) هموژن شد. عصاره­ها با  g×15000 به مدت 15 دقیقه در دمای چهار درجه سانتی­گراد سانتریفوژ شدند. فعالیت آنزیم CAT در دمای 25 درجه سانتی­گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر و به روش Aebi (1984) اندازه­گیری شد. میزان فعالیت آنزیم APX با روش Ranieri et al., (2003) به‌دست آمد. در اثر واکنش بین APX و آسکوربیک اسید و H₂O₂، دهیدروآسکوربات تولید می­شود که در طول موج 290 نانومتر قرائت شد (Ranieri et al., 2003). فعالیت آنزیم GPX نیز همانند آنزیم CAT در دمای 25 درجه سانتی­گراد به روش Chance & Maehly (1955) اندازه­گیری شد. میزان فعالیت آنزیم GPX بر اساس میزان جذب ترکیب نارنجی رنگ تتراگایاکول در میلی­گرم غلظت پروتئین محاسبه شد (Chance & Maehly, 1955). فعالیت PPO با روش Kar & Mishra (1976)  مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان فعالیت آنزیم بر حسب مقادیر اکسید شده پیروگالول در طول موج 420 نانومتر محاسبه شد (Kar & Mishra, 1976). اندازه‌گیری فعالیت SOD طبق روش Dhindsa et al, (1981) انجام شد. میزان فعالیت این آنزیم بر اساس میزان احیای نوری نیتروبلو تترازولیوم و توانایی آنزیم SOD در ممانعت از این واکنش بررسی می‌شود (Dhindsa et al., 1981). جهت استخراج پروتئین کل، تمام روند استخراج در دمای چهار درجه سانتی­گراد انجام شد. محتوای پروتئین محلول کل بر اساس روش برادفورد برآورد شد (Bradford, 1976).

سنجش محتوی قند کل به روش فنل- اسید سولفوریک

جهت سنجش میزان قند کل از روش فنل- اسید سولفوریک استفاده شد. این روش مبتنی بر هیدرولیز اسیدی قندهای محلول و ایجاد ترکیب فورفورال است که با فنل، کمپلکس رنگی تولید می­کند. در این روش، 1/0 گرم نمونه گیاهی با الکل 70 درصد به حجم 15 میلی لیتر رسانده شد و مخلوط حاصل، یک هفته در یخچال نگهداری و هر روز بهم زده شد پس از یک هفته، دو میلی‌لیتر از نمونه با یک میلی‌لیتر فنل پنج درصد به خوبی مخلوط شد سپس پنج میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ به آن افزوده شد و نیم ساعت بعد، جذب محلول­ها در طول موج 485 نانومتر شبت شد (Mecozzi, 2005).

تجزیه داده­ها

داده­های به‌دست آمده به‌‎صورت فاکتوریل و در قالب بلوک­های کاملا تصادفی با سه تکرار تجزیه شدند. داده­ها بر اساس ANOVA، مقایسه میانگین با آزمون دانکن، ضریب همبستگی با نرم افزار SAS و بر اساس روش پیرسون تجزیه شد.

نتایج و بحث

در این تحقیق، رشد فنولوژیکی و انتقال از مرحله رویشی به زایشی ژنوتیپ­ها با تشریح مریستم انتهایی نوک ساقه و FLN مشخص شد. تشکیل حلقه­های مضاعف در مریستم انتهایی ساقه، نشان دهنده گذار از فاز رویشی به زایشی و تکمیل نیاز بهاره‌سازی ژنوتیپ­ها است. همچنین چنانچه ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی در معرض سرما قرار گیرند، تعداد نهایی برگ ­آن­ها تا رسیدن به نقطه اشباع بهاره­سازی کاهش یافته و پس از آن ثابت می­ماند (Mahfoozi et al., 2001). همانطور که در شکل 1 مشخص است، والد نورستار در طول دوره­های عادت­دهی به سرما نمو فنولوژیکی خود را کاهش داد و در طول دوره­های عادت­دهی به سرما، حلقه­های مضاعف قابل رویت نبودند، اما در دوره­های عادت­دهی به سرما، FLN این رقم پس از اولین دوره عادت­دهی به سرما شروع به کاهش کرد و نهایتا پس از دومین دوره عادت­دهی به سرما، نیاز بهاره­سازی خود را تکمیل کرد و وارد فاز زایشی شد ­(شکل 1).

شکل 1- روند شمارش تعداد برگ نهایی (FLN) تحت شرایط کنترل و دوره­های عادت­دهی به سرما در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت و بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) در والد نورستار، پیشتاز، لاین تقریبا­ ایزوژن، لاین­های خالص نوترکیب (4011 و 4015).

Figure 1. Final leaf number (FLN) under controlled environment and during plant cold acclimation in the field (December 20, 60 days after planting), January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting)] in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015.

وضعیت رشد و رویت حلقه­های مضاعف درNIL  و RIL 4011 که دارای تیپ رشد بینابینی هستند، مانند رقم نورستار بود، با این تفاوت که این لاین­ها از نمو فنولوژیکی بالاتری برخوردار بودند. در این تحقیق، این ژنوتیپ­ها (نورستار، NIL و RIL 4011) تا دومین دوره عادت­دهی به سرما تعداد برگ خود را کاهش دادند و پس از آن به تعدادی ثابت رسیدند؛ بنابراین این ژنوتیپ­ها به دلیل عدم ادامه روند کاهش تعداد برگ نهایی در دی ماه، به نقطه اشباع نیاز بهاره­سازی رسیدند (Mahfoozi et al., 2006).

در والد بهاره پیشتاز و RIL4015، نمو فنولوژیکی در طول دوره­های عادت­دهی به سرما به سرعت ادامه یافت (شکل 1). درRIL 4015 در اولین دوره عادت­دهی به سرما (60 روز پس از کشت)، حلقه­های مضاعف قابل مشاهده بود. FLN این ژنوتیپ­ها نیز حاکی از عدم نیاز بهاره­سازی و عدم کاهش تعداد برگ نهایی در طول دوره­های عادت­دهی به سرما بود (شکل 2). والد بهاره پیشتاز نسبت به RIL4015 از نمو فنولوژیکی پایین­تری برخوردار بود و رویت حلقه­های مضاعف در سومین دوره عادت­دهی (حدود 120 روز پس از کشت) به سرما امکان پذیر بود (شکل 1). افزایش در تعداد برگ­ها نیز در RIL 4015 در طول دوره­های عادت­دهی به سرما بیشتر از رقم پیشتاز بود (شکل 2).

نتایج تجزیه واریانس آزمایشات مربوط به  LT₅₀در دوره­های مختلف عادت­دهی به سرما نشان داد که بین ژنوتیپ­ها (لاین­ تقریبا ایزوژن، نوترکیب و ارقام والدینی)، دوره­های عادت­دهی به سرما (زمان­های نمونه­برداری) و اثر متقابل ژنوتیپ و دوره­ عادت­دهی به سرما در سطح یک درصد اختلاف معنی­دار وجود داشت (جدول 1).

جدول 1- تجزیه واریانس داده­های LT₅₀ در دوره­های عادت­دهی به سرما (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت و بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت)  در والد نورستار، پیشتاز، لاین تقریبا­ ایزوژن و لاین­های خالص نوترکیب (4011 و 4015).

Table 1. Variance Analysis (ANOVA) of LT₅₀ under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parent and, NIL and RIL 4011 and 4015.

**: اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد..

**: Significantly different at 1% of probability level.

 در این پژوهش، ژنوتیپ­های بهاره (پیشتاز و RIL 4015) نسبت به ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی، تحمل به سرمای کمی داشتند و در اولین دوره عادت­دهی به سرما، به سرعت به حداکثر تحمل به سرما رسیدند و پس از آن هیچ نوع تحمل سرمایی از خود نشان ندادند، اما ژنوتیپ­ نیازمند بهاره­سازی با آغاز دوره­های عادت­دهی به سرما، تحمل به سرما نشان دادند و تا زمستان این روند ادامه یافت. رقم نورستار که به دلیل نیاز بهاره­سازی طولانی مدت، در زمره ارقام سازگار به مناطق بسیار سرد با زمستان طولانی به شمار می­آید، بیشترین تحمل به سرما (22- درجه سانتی­گراد) را در نقطه اشباع نیاز بهاره­سازی (دی ماه، 90 روز پس از کشت) از خود نشان داد. با توجه به این‌که NIL و RIL 4011 بینابینی هستند، خصوصیات مشابه دو والد را داشتند، اما میزان تحمل به سرمای کمتری از والد نورستار نشان دادند (شکل 3). همه­ این ژنوتیپ­های دارای نیاز بهاره­سازی متفاوت، حداکثر تحمل به سرما خود را در شرایط عادت­دهی به سرما در محدوده تکمیل نیاز بهاره­سازی و به­خصوص در محدوده اشباع بهاره­سازی به‌دست آوردند. نیاز بهاره­سازی که نشانگر انتقال از مرحله رویشی به زایشی است (Mahfoozi et al., 2001; Hosseini et al., 2021) وقتی تکمیل می شود که دمای پایین نتواند FLN را کاهش دهد (شکل 1).

شکل 2- توسعه مریستم انتهایی در طول عادت دهی به سرما در مزرعه:  (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت)  در والد نورستار، پیشتاز، لاین­ تقریبا­ ایزوژن و لاین­های خالص نوترکیب (4011 و 4015).

Figure 2. Shoot apex development during plant acclimation in the field ) December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015.

در تهیه لاین تقریبا ایزوژن، یکی از صفات مربوط به والد دهنده (در اینجا نورستار) به والد زراعی (پیشتاز) انتقال داده ­شده است. در اینجا پس از تلاقی ساده بین دو والد، لاین تقریبا ایزوژن توسط فرایندهای بک کراس با انتخاب برای صفت مورد نظر ایجاد شد. در این تحقیق،  تحمل به سرما صفت مطلوب بود، اما لاین حاصل، ویژگی مشابه با رقم نورستار را خواهد داشت. پس از چندین بک­کراس، افراد انتخاب شده سلف می­شوند تا برای صفت مدنظر هموزیگوس شوند؛ بنابراین نتیجه، یک جفت ژنوتیپ است (یکی والد مکرر و دیگری NIL) که در همه جایگاه­ها یکسان هستند، به‌جز ناحیه­ای که انتخاب برای آن انجام شده است. پس از تکمیل نیاز بهاره­سازی و با پیشرفت نموی به سوی مراحل زایشی پیشرفته، تحمل به سرما در اکثر این ژنوتیپ­ها از بین رفت. این نتایج ضمن تایید بررسی­های انجام شده، نظریه کنترل نموی (Developmental Regulation) کاهش تحمل پس از انتقال از مرحله رویشی به زایشی را تایید می­کند. طبق نظریه کنترل نموی تحمل به سرما، ژن­های نموی نظیر ژن­های فتوپریود، بهاره­سازی و افزایش تعداد برگ، طول مدت بیان ژن­های ساختمانی را تنظیم می­کند، درحالی‌که سطح تحمل به سرما به مدت زمان و شدت بیان ژن­های ساختمانی بستگی دارد. همچنین شواهد علمی متعدد در سطح ملکولی بیانگر نیز آن است که بیان ژن­های ساختاری تحمل به انجماد، با آغاز مرحله زایشی به­شدت کاهش می­یابند (Mahfoozi et al., 2000).

شکل 3- تغییرات LT₅₀ در دوره­های عادت دهی به سرما (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت)  در والد نورستار، پیشتاز، لاین تقریبا­ ایزوژن و لاین­های خالص نوترکیب (4011 و 4015).

Figure 3. Lethal temperatures (LT₅₀) during plant acclimation in the field )December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015.

این مشاهدات همچنین نتایج بدست آمده از شرایط کنترل شده که در آن (Mahfoozi et al., 2001; Fowler & Limin, 2004) انتقال از مرحله رویشی به زایشی، شروع کاهش میزان تحمل را به دنبال دارد را تایید می­کند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس میزان تجمع H₂O₂ و فعالیت آنزیم­های CAT، APX، SOD، GPX، PPO و محتوای قند کل و FLN در دوره­های مختلف عادت­دهی به سرما و شرایط کنترل حاکی از این بود که بین ژنوتیپ­ها و بین دوره­های مختلف عادت­دهی به سرما، اختلاف معنی­دار در سطح یک درصد وجود داشت و اثر متقابل آن­ها نیز معنی­دار بود (جدول 2).

جدول 2- تجزیه واریانس محتوای H₂O₂، FLN، قند کل و میزان فعالیت آنزیم­های CAT، APX، SOD، GPX و PPO در شرایط کنترل و دوره­های مختلف عادت­دهی به سرما (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت و بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) در والد نورستار، پیشتاز، لاین تقریبا­ ایزوژن و لاین­های خالص نوترکیب (4011 و 4015).  

Table 2. Variance analysis (ANOVA) of H₂O₂ and total sugar contents, FLN, activities of SOD, CAT, APX, GPX and PPO under controlled environment and during plant acclimation in the field )December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015.

**: اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد..

**: Significantly different at 1% of probability level.

ارزیابی میزان تجمع H₂O₂ ژنوتیپ­ها در دوره­های عادت­دهی به سرما، نشان از فزونی مقادیر آن در سومین دوره عادت­دهی به سرما مصادف با مرحله زایشی و از دست رفتن تحمل به سرما در ژنوتیپ­های دارای نیاز بهاره­سازی (Norstar، RIL 4011 و NIL) داشت. کمترین و بیشترین میزان H₂O₂ در شرایط کنترل، به‌ترتیب به رقم Norstar و RIL 4015 تعلق داشت. در دوره­های عادت­دهی به سرما، بیشترین میزان تجمع H₂O₂ در RIL 4015 در سومین دوره عادت­دهی به سرما که مصادف با مرحله زایشی پیشرفته این لاین بود، مشاهده شد (شکل 4). پیامد حاصل از تنش سرما همچون بسیاری دیگر از تنش‌ها، بروز اختلال در متابولیسم گیاه و افزایش تولید انواع ROSها از جمله H₂O₂ است (Nazari et al., 2012). در سلول­های گیاهی، انواع ROSها از دو طریق (مسیر اصلی و مسیر قابل القاء) در مقادیر بالا تولید می شوند، اما در شرایط طبیعی، تعادل اکسیداسیون و احیای سلول به‌طور بنیادی عمدتاً از طریق طیف وسیعی از سازوکارهای آنتی­اکسیدانی حفاظت می­شود که در زمینه پالایش ROSها تکامل یافته­اند (Heidarvand & Maali-Amiri, 2010). تنش­های محیطی مختلف، این تعادل اکسیداسیون و احیاء را از طریق افزایش تولید ROSها و یا کاهش فعالیت آنتی­اکسیدانی برهم می­زنند. در همین راستا، دمای پایین به‌ویژه در تلفیق با نور شدید، موجب تولید فزاینده ROSها می‌شود. بر اساس نتایج پژوهش حاضر، با افزایش H₂O₂، تحمل ژنوتیپ­ها به سرما از دست رفت، به­طوری­که در سومین دوره عادت­دهی به سرما در بهمن ماه، میزان اندازه­گیری شده H₂O₂ به بیشترین میزان خود رسید؛ البته این افزایش در ژنوتیپ­های بهاره (Pishtaz و RIL 4015) بسیار بیشتر از ژنوتیپ­های داری نیاز بهاره­سازی بود. نتایج به‌دست آمده از این تحقیق با نتایج با بسیاری از پژوهشگران که بر روی روند تحمل به سرما تحقیق انجام داده بودند، کاملا هم­خوانی دارد (Apostolova et al., 2008; Janda et al., 2007). همبستگی منفی بالا محتوای H₂O₂ و LT₅₀ تایید کننده این واقعیت است که تنش اکسیداتیو القا شده توسط تنش سرما با تحمل به سرما در ژنوتیپ­های گندم مرتبط است (جدول 3).

شکل 4- محتوای H₂O₂ در شرایط کنترل و دوره­های عادت دهی به سرما (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.

Figure 4. The content of H₂O₂ under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

به‌طور کلی، میزان فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی (CAT، APX، GPX، SOD و PPO) در شرایط کنترل پایین بود و با افزایش دوره­های عادت­دهی به سرما، میزان فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ­های دارای نیاز بهاره­سازی (Norstar، RIL 4011 و NIL) به شدت افزایش یافت، به‌طوری‌که در دومین دوره عادت­دهی (محدوده تکمیل نیاز بهاره­سازی) به سرما، بیشترین میزان فعالیت این آنزیم­ها مشاهده شد (شکل­ 5، 6، 7، 8 و 9). با پیشرفت دوره­های عادت­دهی، در سومین دوره عادت­دهی به سرما و با پیشرفت نموی به سوی مراحل زایشی پیشرفته و نیز بعد از تکمیل نیاز بهاره­سازی، میزان فعالیت این آنزیم­ها در ژنوتیپ­های مورد مطالعه کاهش یافت. در ژنوتیپ­های بهاره، میزان تغییرات فعالیت این آنزیم­ها در دوره­های عادت­­دهی به سرما کمتر بود. تحت تنش سرما، افزایش فعالیت آنزیم CAT در گیاهان در مطالعات مختلفی گزارش شده است، به‌طوری‌که ارقام متحمل به سرما در مقایسه با ارقام حساس، میزان فعالیت این آنزیم بیشتر بوده است (Cakmak & Atici, 2009; Javadian et al., 2010). این آنزیم نقش مهمی در حذف H₂O₂ تولید شده در تنش­های محیطی ایفا می­کند (Nazari et al., 2012).

شکل 5- میزان فعالیت آنزیم CAT در شرایط کنترل و عادت دهی به سرما در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.

Figure 5. The activity of CAT under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

آنزیم APX نیز در شرایط مواجه با تنش سرما برای جلوگیری از خسارت­های اکسیداتیو در گندم و دیگر گیاهان ایفای نقش می­کند (Apostolova & Yaneva, 2006). در بوته‌های جو عادت ­داده شده به سرما در مقایسه با گیاهانی که به تنش سرما عادت ندارند، میزان فعالیت این آنزیم بیشتر بوده است (Dai et al., 2009). با توجه به نتایج به‌دست آمده از روند تحمل به سرما در این تحقیق که مشخص کرد بیشترین تحمل را لاین­ها در دومین دوره عادت­دهی به سرما کسب کرده­اند، افزایش فعالیت این آنزیم (شکل 6) می­تواند تایید کننده این مطلب باشد که در این دوره، گیاهان نسبت به سرما سازگار شده­اند و با افزایش دوره عادت­دهی به سرما، به­دلیل ورود ژنوتیپ­ها به فاز زایشی از میزان فعالیت این آنزیم کاسته شده­است. ژنوتیپ­های بهاره بدون نیاز ­بهاره­سازی (Pishtaz و RIL 4015)، به دلیل ورود زود هنگام به مراحل زایشی پیشرفته، از میزان فعالیت آنزیم APX پایین­تری برخوردار بودند.

تحت تنش شدید، رادیکال­های سوپراکسید (O₂^.-) توسط آنزیم SOD به H₂O₂  تبدیل می­شوند. SOD تنها آنزیمی است که قادر به پاکسازی O₂^.- است، درحالی‌که H₂O₂  می­تواند مستقیما توسط CAT یا به کمک احیاگرهای مانند APX، پراکسیدوکسین، GPX و PPO تجزیه شود (Mignolet-Spruyt et al., 2016). با توجه به نتایج این پژوهش (شکل 7) می­توان افزایش ظرفیت فعالیت آنزیم آنتی­اکسیدانی SOD در دومین دوره­ عادت­دهی به سرما را همسو با نتایج دیگر محققین که یکی از دلایل تحمل به دمای پایین را حذف موثر O₂^.- در شرایط تنش سرما عنوان کرده بودند، دانست (Davis & Swanson, 2001; Javadian et al., 2010).

شکل 6- میزان فعالیت آنزیم APX در شرایط کنترل و عادت دهی به سرما در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.

Figure 6. The activity of APX under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

شکل 7- میزان فعالیت آنزیم SOD در شرایط کنترل و عادت دهی به سرما در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.       

Figure 7. The activity of SOD under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

اما از طرف دیگر، افزایش فعالیت SOD باعث تولید H₂O₂ بیشتری می­شود که برای سلول سمی است و سریعاً باید به‌وسیله سیستم دفاع آنتی اکسیدانی به آب و اکسیژن تجزیه شود. برای این منظور، گیاه برای تجزیه H₂O₂ اضافی از سایر آنزیم­های آنتی اکسیدان کمک می­گیرد. بنابراین یکی از دلایل افزایش فعالیت دیگر آنزیم­های آنتی اکسیدانتی از جمله GPX، APX و PPO در دومین دوره­ عادت­دهی به سرما را می­توان افزایش فعالیت SOD دانست (Hosseini et al., 2021).

کاهش و افزایش فعالیت PPO و GPX در شرایط تنش گزارش شده است (Ortega-Garcı ´a & Perago´n, 2009; Javadian et al., 2010). از آن‌جا که این دو آنزیم تمام وظایف پراکسیداز­ها از جمله حفاظت در مقابل تنش­های اکسیداتیو را دارند، یکی از دلایل ایجاد تحمل در نورستار، RIL 4015 و NIL را احتمالا فعالیت بیشتر این دو آنزیم تشکیل می­دهد. افزایش و کاهش فعالیت این دو آنزیم می­تواند به ژنوتیپ گیاه، نوع تنش و کارایی آنزیم در شرایط تنش و عوامل مختلف دیگر بستگی داشته باشد. نتایج به‌دست آمده از این تحقیق نشان داد که ژنوتیپ­های دارای نیاز بهاره­سازی در دومین دوره عادت­دهی به سرما، دارای بیشترین میزان فعالیت این دو آنزیم بودند، درحالی‌که این دو آنزیم در والد Pishtaz و RIL 4015 دارای فعالیت پایین­تری بود (شکل 8، 9). این نتایج با یافته دیگر محققین که افزایش فعالیت این دو آنزیم را به‌عنوان یک وسیله دفاعی گیاه تحت دمای پایین و نقش مهم آن در پیشگیری از اثرات زیانبار تجمع ROSها عنوان کردند، همخوانی کامل نشان می­دهد. نتایج تحقیقات این محققین بالاتر بودن میزان فعالیت این آنزیم را در گیاهان سازگار شده نسبت به گیاهان سازگار نشده گزارش کردند (Ortega-Garcı ´a & Perago´n, 2009) که با یافته‌های تحقیقات حاضر مطابقت داشت. همبستگی منفی و معنی­دار بین میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­کسیدانی و محتوای H₂O₂ نشان می­دهد که ژنوتیپ­های دارای نیاز بهاره­سازی (نورستار، NIL و RIL 4011) نسبت به ژنوتیپ­های بهاره (پیشتاز و RIL 4015) به دلیل توانایی بالا در پاک­سازی ROSها، در طول دوره­های عادت­دهی به سرما کمتر تحت تاثیر تنش اکسیداتیو قرار گرفتند و به دلیل پتانسیل بالای فعالیت آنتی­اکسیدانی، ظرفیت بسیار بالایی در تحمل به دمای پایین داشتند (جدول 3).

شکل 8- میزان فعالیت آنزیم GPX در شرایط کنترل و عادت دهی به سرما  در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.

Figure 8. The activity of GPX under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

به‌طور کلی بیشترین محتوای قند کل در دومین دوره عادت­دهی به سرما (120 روز پس از کشت مصادف با محدوده اشباع نیاز بهاره­سازی و حداکثر تحمل به دمای پایین) در ژنوتیپ­های مورد مطالعه مشاهده شد. در شرایط کنترل، محتوای قند کل پایین بود و با شروع دوره­های عادت­دهی به سرما بر میزان آن افزوده شد. با پیشرفت دوره­های عادت­دهی به سرما، با عبور از مرحله رویشی به مرحله زایشی، محتوای قند کل کاهش یافت. بیشترین میزان قند کل در والد نورستار در دومین دوره و کمترین آن در RIL 4015 در شرایط کنترل مشاهده شد (شکل 10). در ژنوتیپ­های دارد تیپ رشد بهاره با شروع عادت­دهی به سرما بر میزان قند کل افزوده شد، ولی در مقایسه با ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی، این روند افزایشی با شیب کمتری ادامه پیدا کرد. افزایش محتوای قند تحت تنش­های محیطی از جمله سرما، گزارش شده است (Janmohammadi et al., 2012). ساکارز و دیگر قندها، نقش مهمی را به‌عنوان مولکول­های سیگنال دهنده جهت تنظیم رشد و نمو، واکنش­های فیزیولوژیکی و متابولیسمی گیاهان ایفا می­کنند (Arroyo et al., 2003). نقش تنظیمی ساکارز در پروسه عادت­دهی به سرما در آرابیدوپسیس با تاثیر آن بر بیان ژن­ COR78 مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که در طول پروسه عادت­دهی به سرما و با اعمال ساکارز، بیان آن به طور قابل توجهی افزایش پیدا کرد (Rekarte-Cowie et al., 2008). در گیاهان مختلف به‌خصوص غلات، افزایش تحمل به سرما توام با افزایش محتوای قند گزارش شده است و یکی از دلایل احتمالی خو گرفتن به دمای پایین، افزایش محتوای قند است که منجر به بهبود تنظیم اسمزی سلول می­شود (Yuanyuan et al., 2009). همسو با یافته محققین قبلی، ی تحمل ژنوتیپ­ها به دمای پایین در دومین دوره عادت­دهی به سرما را می­توان به افزایش محتوای قند کل در این دوره نسبت داد.

شکل 9- میزان فعالیت آنزیم PPO در شرایط کنترل و عادت دهی به سرما در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.

 Figure 9. The activity of PPO under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

همانطور که در شکل 10 مشاهده می‌شود، میزان تجمع قند کل در والد Norstar، NIL و RIL 4011 نسبت به والد Pishtaz و RIL 4015 در دوره­های عادت­دهی به سرما بیشتر بوده است. یکی از دلایل تفاوت این دو گروه در میزان تحمل به سرما توانایی متفاوت آن­ها در تجمع قند کل است (Galiba et al., 1997; Javadian et al., 2010). بسیاری از محققین به وجود همبستگی مثبت بین محتوای قند و میزان تحمل به تنش­های محیطی در غلات اشاره کردند (Dionne et al., 2001) و محتوای قند بیشتر را شاخصی در تحمل بیشتر گیاهان به دمای پایین بیان نمودند. در پژوهش حاضر، آنالیز همبستگی نشان داد که بین محتوای قند و LT₅₀ همبستگی مثبت و معنی­دار وجود داشت. همسو با این نتایج، دیگر محققین همبستگی بالای محتوای قند با میزان تحمل به سرما را به دلیل نقش حفاظتی کربوهیدرات­ها از دهیدراسیون پروتئین­ها و حفاظت از غشای پلاسمایی در ارقام زمستانه گندم، گزارش کردند (Sasaki et al., 2001; Janmmohamadi et al., 2012).

شکل 10- محتوای قند کل در شرایط کنترل و عادت دهی به سرما در مزرعه (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت، بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت) ستون­های دارای حروف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح یک درصد، با یکدیگر تفاوت معنی­دار دارند.

Figure 10. Total sugar Content under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

جدول 3- ضریب همبستگی پیرسون بین میزان فعالیت آنزیم­های CAT، APX، SOD، GPX، PPO و محتوای قند کل، H₂O₂ و LT₅₀ (علامت LT₅₀ مثبت در نظر گرفته شده است) تحت شرایط کنترل و دوره­های عادت­دهی به سرما (آذر (دسامبر) ماه،60 روز پس از کشت، دی (ژانویه) ماه، 90 روز پس از کشت و بهمن (فوریه) ماه، 120 روز پس از کشت).

Table 3. Pearson’s correlation coefficients among LT₅₀, H₂O₂ and total sugar content, activities of SOD, CAT, APX, GPX and PPO under controlled environment and during plant acclimation in the field (December 20, 60 days after planting, January 19, 90 days after planting and February 18, 120 days after planting) in Norstar and Pishtaz parents and NIL and RIL 4011 and 4015. Columns with different letters are significantly different based on the Duncan test at 1% of probability level.

*  و**: اختلاف معنی­داری در سطح پنج و یک درصد..

* and **: Significantly different at 5% and 1% of probability levels.

نتیجه­گیری کلی

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی در دوره­های عادت­دهی به سرما، نمو فنولوژیکی خود را کاهش دادند و بیشترین میزان تحمل به سرما در نقطه اشباع نیاز بهاره­سازی در دومین دوره عادت­دهی به سرما (120 روز پس از کشت) به‌دست آمد. روند تغییر فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان، محتوای پرولین و قندکل تحت شرایط کنترل و دوره­های عادت­دهی به سرما، روند تقریباً مشابهی داشت. با شروع دوره­های عادت­دهی به سرما در همه ژنوتیپ­های مورد مطالعه، فعالیت آنزیم­های CAT، APX، GPX، PPO و SOD، افزایش یافت و در نقطه اشباع، نیاز بهاره­سازی به حداکثر رسید و با انتقال به مرحله زایشی کاهش یافت (مشاهده حلقه­های مضاعف). روند تغییرات بیان ژن­های کد کننده آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی در همه ژنوتیپ­ها مشابه و در دی ماه نسبت به شرایط کنترل افزایش یافت. والد نورستار، NIL و RIL 4011 نسبت به RIL 4015 و والد پیشتاز (دارای عادت رشد بهاره) دارای میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان بیشتری بودند و در مدت زمان بیشتری آن را حفظ کردند. محتوای قند کل نیز داری روند مشابهی بود، با این تفاوت که با انتقال از مرحله رویشی به مرحله زایشی، به میزان کمتری کاهش یافت. میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی با LT₅₀ همبستگی مثبت و معنی­دار و با محتوای H₂O₂ همبستگی منفی و معنی­داری داشت.

به‌نظر می­رسد که صفات نموی نظیر نیاز بهاره­سازی و تاخیر در نمو فنولوژیکی از طریق تاثیر بر طول دوره رویشی بر مدت زمان تحمل به سرما تأثیر می­گذارند و به ­همراه زمینه ژنتیکی، باعث تغییر میزان تحمل به سرما می‌شوند. تکمیل نیاز بهاره­سازی و انتقال از مرحله رویشی به زایشی، نقطه عطفی در بیان تحمل به سرما است که بعد از تکمیل نیاز بهاره­سازی، باعث کاهش قابل ملاحظه­ای در میزان تحمل به سرما می­شود. تغییرات عمده فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی مهم در طول دوره­های عادت­دهی به سرما، زمینه مناسبی را برای مطالعه متابولیت­های بیوشیمیایی فراهم می­کند و این تغییرات می­تواند در برنامه­های انتخاب رقم برای تحمل به سرما مد نظر قرار گیرد. ژنوتیپ­های حساس و متحمل به سرما با وجود تفاوت بسیار زیاد از نظر میزان تحمل به سرما، مواد محافظت کننده مشابهی در طول دوره­های عادت­دهی به سرما انباشت می­کنند. تفاوت ژنوتیپ­های متحمل با حساس، در میزان و مدت زمان انباشت متابولیت­های بیوشمیایی است، به‌طوری‌که در ژنوتیپ­های متحمل، مدت زمان انباشت مواد محافظت کننده به دلیل تاثیر صفات نموی طولانی­تر است. بر اساس نتایج به‌دست آمده از این پژوهش، در برنامه­های اصلاحی گندم برای اقلیم های سرد و یا سرد معتدل می­توان از تغییرات فنولوژیکی، چرخه رشد و صفات مرتبط با تحمل به سرما از جمله میزان فعالیت آنزیم­های CAT، APX، GPX، SOD، PPO و همچنین محتوای قند کل به‌عنوان شاخص­های بالقوه برای انتخاب بهتر ژنوتیپ­ های متحمل به سرما استفاده کرد.

REFERENCES

1. Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. In Methods in Enzymology,105, 121-126.
2. Apostolova, P., Yaneva, I., Apostolova, P. & Yaneva, I. (2006). Antioxidative defence in winter wheat plants during early cold acclimation. Plant Physiology, 101-108.
3. Apostolova, P., Yordanova, R. & Popova, L. (2008). Response of antioxidative defence system to low temperature stress in two wheat cultivars. General and Applied Plant Physiology, 34, 281-294.
4. Arroyo, A., Bossi, F., Finkelstein R. R. & León, P. (2003). Three genes that affect sugar sensing (abscisic acid insensitive 4, abscisic acid insensitive 5, and constitutive triple response 1) are differentially regulated by glucose in Arabidopsis. Plant Physiology, 133, 231-242.
5. Bond, D. , Dennis, E. S. & Finnegan, E. J. (2011). The low temperature response pathways for cold acclimation and vernalization are independent. Plant, Cell & Environment, 34, 1737-1748.
6. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248–254.
7. Cakmak, T. & Atici, Ö. (2009). Effects of putrescine and low temperature on the apoplastic antioxidant enzymes in the leaves of two wheat cultivars. Plant Soil Environment,55, 320-326.
8. Chance, B. & Maehly, A. C. (1955). [136] Assay of catalases and peroxidases. 2, 764-775.
9. Czarnocka, W. & Karpiński, S. (2018). Friend or foe? Reactive oxygen species production, scavenging and signaling in plant response to environmental stresses. Free Radical Biology and Medicine,122, 4-20.
10. Dai, F., Huang, Y., Zhou, M. & Zhang, G. (2009). The influence of cold acclimation on antioxidative enzymes and antioxidants in sensitive and tolerant barley cultivars. Biologia Plantarum, 53, 257-262.
11. Das, K. & Roychoudhury, A. (2014). Reactive oxygen species (ROS) and response of antioxidants as ROS-scavengers during environmental stress in plants. Frontiers in Environmental Science,2, 2-53.
12. Davis, D. G. &Swanson, H. R. (2001). Activity of stress-related enzymes in the perennial weed leafy spurge (Euphorbia esula L.). Environmental and Experimental Botany, 46, 95-108.
13. Dhindsa, R. S., Plumb-Dhindsa, P. & Thorpe T. A. (1981). Leaf senescence: correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation, and decreased levels of superoxide dismutase and catalase. Journal of Experimental Botany,32, 93-101.
14. Dionne, J., Castonguay, Y., Nadeau, P. & Desjardind, Y. (2001). Freezing tolerance and carbohydrate changes during cold acclimation of green-type annual Bluegrass (PoaannuaL.) ecotypes. Crop Science, 41, 443-451.
15. Fowler, D. B. & Limin, A. E. (2004). Interactions among factors regulating phenological development and acclimation rate determine low-temperature tolerance in wheat. Annals of Botany, 94, 717-724.
16. Galiba, G., Kerepesi, I., Snape, J. W. & Sutka, J. (1997). Location of a gene regulating cold-induced carbohydrate production on chromosome 5A of wheat. Theoretical and Applied Genetics, 95, 265-270.
17. Ghasemi-Mobtaker, H., Kaab, A. & Rafiee, S. (2020). Application of life cycle analysis to assess environmental sustainability of wheat cultivation in the west of Iran. Energy, 193, 116-768.
18. Hosseini, M. & Saidi, A. (2019). Phylogenetic and structural study of plant Polyamine Oxidases. Journal of Crop Biotechnology, 23, 19-36. (In Persian)
19. Hosseini, M., Maali-Amiri, R., Mahfoozi, S., Fowler, D. B. & Mohammadi, R. (2016). Developmental regulation of metabolites and low temperature tolerance in lines of crosses between spring and winter wheat. Acta Physiologiae Plantarum,38, 4-87.
20. Hosseini, M., Saidi, A., Maali-Amiri, R., Abbasi, A. & Khosravi-Nejad, F. (2021). Developmental regulation and metabolic changes of RILs of crosses between spring and winter wheat during low temperature acclimation. Environmental and Experimental Botany, 182,104-299.
21. Janda, T., Szalai, G., Leskó, K., Yordanova, R., Apostol, S. & Popova, L. P. (2007). Factors contributing to enhanced freezing tolerance in wheat during frost hardening in the light. Phytochemistry,68, 1674-1682.
22. Janmohammadi, M., Zolla, L. & Rinalducci, S. (2015). Low temperature tolerance in plants: changes at the protein level. Phytochemistry, 117, 76-89.
23. Janská, A., Maršík, P., Zelenková, S. & Ovesná, J. (2010). Cold stress and acclimation–what is important for metabolic adjustment. Plant Biology,12, 395-405.
24. Javadian, N., Karimzadeh, G., Mahfoozi, S. & Ghanati, F. (2010). Cold-induced changes of enzymes, proline, carbohydrates, and chlorophyll in wheat. Russian Journal of Plant Physiology, 57, 540-547.
25. Ji, H., Xiao, L., Xia, Y., Song, H., Liu, B., Tang, L., Cao, W., Zhu, Y. & Liu, L. (2017). Effects of jointing and booting low temperature stresses on grain yield and yield components in wheat. Agricultural and Forest Meteorology, 243, 33-42.
26. Kar, M. & Mishra, D. (1976). Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiology, 57, 315-319.
27. Loreto, F., Velikova, V. (2001). Isoprene production by leaves protects the photosynthetic

apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid

peroxidation of cellular membranes. Plant Physiology. 127, 1781–1787.

28. Mahfoozi, S., Limin, A. E. & Fowler, D. B. (2001). Developmental regulation of low-temperature tolerance in winter wheat. Annals of Botany, 87, 751-757.
29. Mahfoozi, S., Limin, A. E., Ahakpaz, F. & Fowler, D. B. (2006). Phenological development and expression of freezing resistance in spring and winter wheat under field conditions in north-west Iran. Field crops Research, 97, 182-187.
30. Mecozzi, M. (2005). Estimation of total carbohydrate amount in environmental samples by the phenol–sulphuric acid method assisted by multivariate calibration. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,79, 84-90.
31. Mignolet-Spruyt, L., Xu, E., Idänheimo, N., Hoeberichts, F. A., Mühlenbock, P., Brosché, M., Van Breusegem, F. & Kangasjärvi, J. (2016). Spreading the news: subcellular and organellar reactive oxygen species production and signalling. Journal of Experimental Botany, 67, 3831-3844.
32. Nazari, M., Amiri, R. M., Mehraban, F. H. & Khaneghah, H. Z. (2012). Change in antioxidant responses against oxidative damage in black chickpea following cold acclimation. Russian Journal of Plant Physiology, 59, 183-189.
33. Ortega-García, F. & Peragón, J. (2009). Phenylalanine ammonia-lyase, polyphenol oxidase, and phenol concentration in fruits of Olea europaea cv. Picual, Verdial, Arbequina, and Frantoio during ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 10331-10340.
34. Ranieri, A., Castagna, A., Pacini, J., Baldan, B., Mensuali-Sodi, A. & Soldatini, G. F. (2003). Early production and scavenging of hydrogen peroxide in the apoplast of sunflower plants exposed to ozone. Journal of Experimental Botany, 54, 2529-2540.
35. Rekarte-Cowie, I., Ebshish, O. S., Mohamed, K. S. & Pearce, R. S. (2008). Sucrose helps regulate cold acclimation of Arabidopsis thaliana. Journal of experimental botany, 59, 4205-4217.
36. Sami, F., Yusuf, M., Faizan, M., Faraz, A. & Hayat, S. (2016). Role of sugars under abiotic stress. Plant Physiology and Biochemistry,109, 54-61.
37. Sasaki, H., Ichimura, K., Imada, S. & Yamaki, S. (2001). Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase, but not acid invertase, are regulated by cold acclimation and deacclimation in cabbage seedlings. Journal of Plant Physiology, 158, 847-852.
38. Shen, Y., Li, J., Gu, R., Yue, L., Wang, H., Zhan, X. & Xing, B. (2018). Carotenoid and superoxide dismutase are the most effective antioxidants participating in ROS scavenging in phenanthrene accumulated wheat leaf. Chemosphere,197, 513-525.
39. Solanke, A. U. & Sharma, A. K. (2008). Signal transduction during cold stress in plants. Physiology and Molecular Biology of Plants, 14, 69-79.

[1] Critical adaptive feature