بررسی اثر کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و قارچ تریکودرما هارزانیوم بر برخی صفات مورفوفیزیولوژیکی و فیتوشیمیایی گیاه دارویی بادرنجبویه (Melissa officinalis)

مقدمه

گیاهان دارویی بخش ضروری مراقبت‌های بهداشتی هستند و اکثر مردم در سراسر جهان از آن‌ها جهت درمان مسائل مربوط به سلامت، تسکین درد و رنج بشر بهره می‌برند. تقریبا همه جوامع سطح بالایی از وابستگی به گیاهان دارویی دارند (Acharya, 2022). روند رو به افزایش مصرف گیاهان دارویی به­عنوان مواد اولیه تولید داروهای گیاهی بدون توسعه روش‌های مناسب کاشت و مدیریت برنامه­ریزی صحیح پیامدی نگران­کننده، یعنی تخریب طبیعت را دربر خواهد داشت. بدین­منظور تولید گیاهان دارویی چه به صورت خام و یا به شکل فرآوری­شده با حفظ کیفیت و استاندارد بالا امری ضروری به نظر می‌رسد
 (Najafi, 2010). بادرنجبویه با نام علمی
 Melissa officinalis گیاهی داروئی چند­ساله از خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است (Pressi, 2021). بادرنجبویه گیاهی بوته‌ای افراشته است که ارتفاع آن به حدود یک متر می‌رسد. برگ­ها نرم، کرک­دار و به طول 2 تا 8 سانتی­متر و به شکل قلب هستند. سطح برگ درشت و دارای رگبرگ عمیق و لبه برگ دندانه­دار است. گل­ها به رنگ سفید یا صورتی کم­رنگ متشکل از خوشه‌های کوچک 4 تا 12 شکوفه در فصل تابستان می­باشند. معمولا به دلیل عطر و طعم لیمو مانند آن به عنوان بادرنجبویه شناخته می‌شوند (Moradkhani, 2010). بادرنجبویه به طور گسترده در شرق آسیا جنوب اروپا و آمریکای شمالی رشد می­کند که به­دلیل وجود مقادیر بالای متابولیت‌های ثانویه مانند ترکیبات فنولی‌، فلاونوئیدها و اسانس در اندام‌های هوایی گیاهی در صنایع مختلف دارویی، غذایی، آشامیدنی و آرایشی کاربرد فراوان دارد (Hatami et al., 2021).

ترکیب شاخص اسانس بادرنجبویه سیترونلال ترکیبی از دسته ترپن‌هاست و یک مونوترپنوئید محسوب می­شود. یکی دیگر از ترکیبات این گیاه سیترال است که متعلق به ترپنوئیدها است (Rahim Malek & Khorsandi, 2015). متابولیت­های ثانویه دیگری نظیر اوژنول، اکتینول، اکتین، اکتینون، سیترال هگزنول و هارامین به فعالیت قدرتمند اسانس بادرنجبویه کمک می‌کنند (Hajlaoui et al., 2021). مطالعات بالینی کاربرد بادرنجبویه را جهت درمان تحریکات عصبی و بی‌خوابی، زونا، آکنه، بیش فعالی، اختلال تمرکز، رفتارهای تکانشی، تبخال عود­کننده، دندان قورچه، بی­قراری و اختلال خواب در کودکان، عفونت‌های پوستی، آرام­بخش عصبی در میگرن و همچنین نفخ تایید کرده‌اند (Ghorbani Ghozhadi et al., 2021). بیوسنتز متابولیت­های ثانویه به­صورت ژنتیکی کنترل می­شود ولی ساخت آن­ها به­شدت توسط عوامل محیطی تحت تأثیر قرار می‌گیرد
 (Omid Beigi, 2000). تولید متابولیت­های ثانویه به­طور طبیعی بسیار ناچیز است (Murthy et al., 2014). یکی از استراتژی­های مهم برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه استفاده از تکنیک­های ویژه نظیر محرک­ها است (Expósito et al., 2009). محرک‌های زیستی محصولات ارگانیک یا معدنی حاوی مواد فعال زیستی و یا میکروارگانیسم‌ها هستند که وقتی روی گیاه یا ریزوسفر اعمال می­شوند رشد و بهره­وری گیاه را با بهبود راندمان جذب مواد مغذی، تحمل به تنش­های غیر زیستی و یا کیفیت را تحریک می­کنند (Franzoni et al., 2022). بر اساس مقررات اتحادیه اروپا محرک زیستی گیاه، محرکی است که فرآیندهای تغذیه را مستقل از محتوای مواد مغذی محصول تحریک می­کند و اهداف آن شامل بهره وری از مواد مغذی، تحمل استرس غیر زنده، بهبود ویژگی های کیفی و در­ دسترس­قرار­دادن مواد مغذی محدود در ریزوسفر می باشد (Baltazar et al., 2021). محققان اظهار داشتند که محلول­پاشی گیاه دارویی علف لیمو با کاراگینان تحت تابش گاما خصوصیات بیوشیمیایی‌، کیفی و ترکیبات فعال (سیترال و ژرانیول) را به میزان قابل توجهی بهبود می­بخشد. استفاده از 80 میلی­گرم در لیتر کاراگینان باعث افزایش محتوای اسانس به میزان 9/18و 5/2 درصد، محتوای سیترال 3/7 و 9/8 درصد و محتوای ژرانیول 2/9 و 9/8 درصد در 90 و 120روز پس از کاشت شدند (Singh et al., 2017). کاراگینان جایگزین مناسبی برای کود‌های شیمیایی است و به­طور قابل توجهی با افزایش جوانه­زنی بذر، سرعت رشد، طول ساقه، تولید گل، رشد ریشه، سرکوب استرس فلزات سنگین و فعالیت ضدمیکروبی در گیاهان مرتبط است (, 2022Hossain & Shourove).

تیمار 200 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانو ذره نقره سنتز سبز از ریشه دو گیاه ریشه طلایی
(Rhodiola imbricate) و پنیرباد
 (Withania somnifera) به طور قابل توجهی باعث افزایش شاخص جوانه‌زنی، تعداد ریشه، طول ساقه، رنگدانه‌های فتوسنتزی، کلروفیلa، کلروفیل b و کارتنوئید در گیاه جو در مقایسه با تیمار شاهد شد
 (Kapoor et al., 2022). مطالعه دیگری در رابطه با تنش خشکی در سه سطح 25، 50 و 100 درصد ظرفیت زراعی و تریکودرما هارزانیوم در سه سطح 5، 10 و 20 درصد روی گل مریم
 (Polianthes taberrosel.cv. Doble) نشان داد که تنش خشکی باعث افزایش میزان آنتی­اکسیدان و پرولین شده و بر وزن تر و خشک ریشه، پیازچه، محتوای نسبی آب، تعداد برگ و قطر گلچه­های باز اثر منفی داشت. اما تریکودرما هارزانیوم تا حد زیادی این اثرات منفی را تعدیل کرد به­طوری‌که بیشترین میزان رطوبت نسبی آب برگ (8/5 درصد) در سطح ۱۰ درصد قارچ تریکودرما هارزانیوم و در بقیه صفات بیشترین سطوح در سطح ۲۰ درصد قارچ تریکودرما مشاهده شد (Zekavati et al., 2021).

با­توجه­به اهمیت تولید گیاهان دارویی سالم، توسعه کشاورزی پایدار و تمایل روزافزون جمعیت جهانی به استفاده از گیاهان دارویی، هدف از انجام این تحقیق بررسی تأثیر محرک­های زیستی کاراگینان، تریکودرما هارزانیوم، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره بر خصوصیات مورفوفیزیولوژیکی و فیتوشیمیایی گیاه دارویی بادرنجبویه در شرایط گلخانه­ای است.

مواد و روش‌ها

مکان و زمان اجرای طرح و نحوه اعمال تیمار‌ها

این آزمایش در سال زراعی 1400-1399 در شرایط گلخانه­ای و در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با ده تیمار و در سه تکرار در شرایط گلخانه‌ای، در شهرستان فریدونکنار اجرا شد. این پژوهش شامل ده تیمار که شامل: کاراگینان 100 پی‌پی‌ام، کاراگینان 300 پی‌پی‌ام، کاراگینان 600 پی‌پی‌ام، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 پی‌پی‌ام، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 پی‌پی‌ام، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 پی‌پی‌ام، تریکودرما هارزانیوم 100 پی‌پی‌ام، تریکودرما هارزانیوم 200 پی‌پی‌ام، تریکودرما هارزانیوم 400 پی‌پی‌ام و آب مقطر (شاهد) بودند که روی گیاه بادرنجبویه اعمال شد. اندازه‌گیری پارامترهای مورفوفیزیولوژیکی (طول ساقه، وزن تر و خشک شاخساره، وزن تر و خشک ریشه، طول گل­آذین و سطح برگ) و فیتوشیمیایی (رنگیزه های فتوسنتزی کلروفیل a، کلروفیل b، آنتوسیانین، کارتنوئید، فنول کل، فلاونوئید کل و فعالیت آنتی­اکسیدانی) در مرحله شروع گلدهی انجام شد.

ارزیابی صفات مورفوفیزیولوژیکی

طول ساقه: پنج بوته به طور تصادفی از نزدیک سطح خاک (طوقه گیاه) قطع شده و ارتفاع گیاه از سطح بریده­شده تا انتهای گل­آذین به وسیله متر اندازه­گیری شد.

وزن تر و خشک شاخساره و ریشه: بعد از اینکه 90 درصد بوته­ها وارد فاز گلدهی شدند؛ بوته­ها از روی طوقه قطع شده و به آزمایشگاه انتقال یافته به کمک ترازوی دیجیتال با دقت 0001/0 گرم توزین شد. سپس بوته­ها در شرایط سایه و دمای معمولی اتاق در جریان هوا خشک شده و وزن خشک بوته به کمک ترازوی دیجیتال با دقت 0001/0 گرم اندازه‌گیری شد.

تعداد انشعابات جانبی شاخه: تعداد شاخه­های فرعی متصل به تنه اصلی در نمونه­های برداشت­شده (سه گیاه) شمارش شدند.

طول، عرض و سطح برگ: جهت اندازه­گیری این پارامترها، ابتدا سطح برگ اسکن شده و سپس توسط نرم­افزار دیجی‌مایزر (Digimizer ver. 793940) مقدار حقیقی سطح برگ سنجش شده و میانگین داده­ها به عنوان سطح برگ گزارش شد.

ارزیابی صفات فیتوشیمیایی

سنجش میزان کلروفیل a، b و کارتنوئید

پس از ورود گیاهان به فاز گلدهی، گرم از بافت تازه برگ از هر تکرار با 10میلی­لیتر استون 80 درصد سائیده و سپس با سرعت 6000 دور در دقیقه به مدت ده دقیقه سانتریفیوژ شد. برای عصاره فوقانی پس از سانتریفیوژ، میزان کلروفیل a در طیف جذبی 663 نانو‌متر و کلروفیلb در طیف جذبی 645 نانو‌متر و کارتنوئید در طیف جذبی 470 نانو‌متر توسط اسپکتروفتومتر (مدل JENWAY 6300) قرائت شدند. ضمنا دستگاه اسپکتروفتومتر با استون 80 درصد کالیبره شد. غلظت رنگیزه­ها با استفاده از فرمول­های ذیل و بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر محاسبه شدند (Arnon, 1967).

در رابطه‌های فوق، A میزان جذب قرائت­شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، Chl a مقدار کلروفیل a، Chl b میزان کلروفیل b،Total Chl  میزان کلروفیل کل، C میزان کارتنوئید، V حجم نهایی عصاره­ی استون 80% و W وزن تازه بافت برای عصاره‌گیری بر حسب میلی­گرم است.

سنجش میزان آنتوسیانین

جهت سنجش میزان آنتوسیانین یک گرم از وزن تر با 10 میلی‌لیتر متانول اسیدی سائیده شد. عصاره­ها به مدت 24 ساعت در یخچال و در شرایط تاریکی انکوبه شدند. سپس جذب محلول در طول موج 550 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. از محلول متانول اسیدی به­عنوان شاهد استفاده شد (Khaleghnezhad et al., 2019).

سنجش میزان فنل کل

ابتدا عصاره متانولی 80 درصد از پودر خشک به روش خیساندن گیاه با نسبت 1:10 تهیه شد. مقادیر ترکیب­های فنولی در عصاره متانولی گیاهی توسط روش Lee et al. (2017) اندازه­گیری شد. بر طبق این روش مقدار 2/0میلی­لیتر از عصاره‌ها در لوله‌های آزمایش ریخته شدند و یک میلی­لیتر معرف فولین سیوکالتو و 8/0 میلی­لیتر کربنات سدیم 7 درصد به مخلوط اضافه شد. بعد از 30 دقیقه نگهداری در دمای محیط جذب نوری آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 765 نانو‌متر قرائت شد. از غلظت­های مختلف گالیک­اسید به­عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده شد. میزان فنول کل بر اساس میزان معادل میلی‌گرم گالیک­اسید در گرم ماده خشک گزارش شد.

سنجش میزان فلاونوئید کل

محتوی فلاونوئیدی عصاره‌­ی متانولی بادرنجبویه به روش رنگ­سنجی آلومینیوم کلراید اندازه­گیری شد. در این روش به 5/0 میلی‌لیتر از عصاره متانولی، 1/0 میلی‌لیتر کلرید آلومینیوم (10 درصد)، 1/0 میلی‌لیتر استات پتاسیم یک مولار و 8/2 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد. نمونه­ها به مدت 40 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس جذب مخلوط در طول موج 415 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر قرائت شدند. ضمنا بلانک محلول نیز به­همین­صورت و بدون عصاره آماده شد (Chang et al., 2002). منحنی استاندارد بر اساس محلول غلظت‌های متفاوت کوئرستین رسم شده و میزان فلاونوئید معادل میلی­گرم کوئرستین در هر گرم وزن خشک گیاه محاسبه شد. تمامی سنجش­ها در سه تکرار انجام شد.

سنجش میزان آنتی­اکسیدان

سنجش فعالیت رادیکال‌های آزاد به روش باروس و همکاران صورت گرفت. 250 میکرو‌لیتر از عصاره با 750 میکرو‌لیتر از محلول DPPH (این محلول از انحلال 2 میلی­گرم DPPH در 50 میلی­لیتر متانول تهیه گردید) مخلوط شد. این نمونه­ها به مدت 30 دقیقه در شرایط تاریکی و در دمای اتاق انکوبه و سپس میزان جذب آن‌ها در طول موج 517 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شدند
(Barros et al., 2007). درصد مهار رادیکال­های آزاد با فرمول زیر محاسبه شد:

رابطه 5:

تجزیه داده­ها

داده­های این پژوهش با استفاده از نرم­افزار SAS تجزیه شده و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. همچنین نمودارهای مورد نیاز با استفاده از نرم­افزار اکسل ترسیم شد.

نتایج و بحث

طول، عرض و سطح برگ

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تأثیر سطوح مختلف محلول­پاشی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر طول، عرض و سطح برگ در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 1). مقایسه میانگین ها نشان داد که بیشترین طول برگ (3/6 سانتی­متر) از تیمار محلول­پاشی با عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره در غلظت 125 پی­پی­ام به­دست آمد. در مقابل کمترین طول برگ (9/3 سانتی­متر) از تیمار شاهد به­دست آمد (شکل 1). همچنین بیشترین عرض برگ (3/4 سانتی­متر) از تیمار محلول­پاشی با 125میلی‌گرم بر لیتر عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره به­دست آمد که نسبت به تیمار شاهد 61 درصد افزایش نشان داد (شکل 2). مقایسه میانگین­های اثر محرک‌­ها‌ی زیستی مورد نظر نشان داد که بیشترین سطح برگ (4/19 سانتی‌متر مربع) از محلول­پاشی با عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره در غلظت 125 پی­پی­ام و کمترین سطح برگ (4/7 سانتی‌متر مربع) از تیمار شاهد به­دست آمد (شکل 3).

محققان بیان کردند که در برگ‌های گیاهان تیمار­شده با نانو کلات آهن مقدار کلروفیل افزایش می­یابد؛ که در نتیجه سبب تولید مواد فتوسنتزی و رشد بیشتر برگ­ها می‌شوند. نانو­ذرات به دلیل اندازه کوچکشان به مولکول‌های فعال بیولوژیکی متصل می‌شوند و به­راحتی از غشا سلولی عبور می‌کنند و به­علت کوچک­بودن وحلالیت بالا، به­سرعت توسط گیاهان جذب شده و در نتیجه سبب افزایش رشد می‌شوند
 (Rasht, 2013).

جدول 1- تجزیه واریانس صفات مورفوفیزیولوژیکی گیاه بادرنجبویه تحت تیمارهای مختلف محرک زیستی.

Table 1. Analysis of variance of morphophysiological traits of lemon balm under different biostimulants treatments.

^{*، ** و ns}: به­ترتیب به مفهوم تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد و بدون اختلاف معنی‌دار می باشد.

 ^{*, **, ns}: Significantly differences at the 5 and 1% of probability levels, and non-significantly difference, respectively.

نتایج مطالعه­ای نشان داد که کاربرد نانو­ذرات نقره سنتز­شده با استفاده از صمغ عربی به­طور قابل توجهی جوانه­زنی بذر و سیستم آنتی­اکسیدانی، طول ساقه، طول ریشه، وزن تر گیاهچه در غلظت 100 پی‌پی‌ام گیاه شنبلیه، پیاز و ذرت را افزایش داده است. همچنین نانو­نقره سنتز­شده بیان آنزیم­های آنتی­اکسیدانی SOD، CAT و APX₂ را به­طور قابل توجهی افزایش داد. نانو­ذرات از طریق ارائه‌ی ریز­مغذی­ها و تنظیم بیان ژن می‌توانند در متابولیسم گیاه تأثیر بگذارند (Soliman et al., 2020).

ارتفاع بوته: نتایج تجزیه واریانس داده‌های حاصل از آزمایش نشان داد که اثر محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر ارتفاع بوته در سطح احتمال پنج درصد معنی­دار بود (جدول 1). به­طوری­که بیشترین ارتفاع بوته (108 سانتی‌متر) در تیمار تریکودرما هارزانیوم در غلظت200 میلی­گرم در لیتر و کمترین ارتفاع بوته در تیمار شاهد (73 سانتی­متر) مشاهده شد (شکل 4). محققان اذعان کردند که همزیستی قارچ تریکودرما با گیاه ریحان منجر به افزایش ارتفاع بوته شد. آن­ها علت این امر را کمک تریکودرما به جذب مواد غذایی و تولید ترکیبات شبه اکسینی و جبرلین دانستند که سبب تحریک مکانیسم­ها‌ی مقاومت، رشد و نمو و افزایش حلالیت عناصر معدنی برای جذب توسط گیاه می‌شود؛ که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابقت داشت
 (Salahi Ostad et al., 2020).

وزن تر و خشک بوته: نتایج تجزیه واریانس داده­ها بیانگر این بود که اثر تیمار محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر وزن تر بوته در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 1). بیشترین وزن تر بوته (3/509 گرم) در تیمار محلول­پاشی با کاراگینان در غلظت 600 میلی‌گرم در ‌لیتر مشاهده شد که نسبت به تیمار شاهد (8/82گرم) بیش از پنج برابر افزایش داشت (شکل 5). همچنین بیشترین وزن خشک (59 گرم) در محلول­پاشی با تیمار کاراگینان در غلظت 600 پی­پی­ام به­دست آمد که نسبت به تیمار شاهد 9/4 برابر افزایش داشت (شکل 6). محققان بیان کردند که کاراگینان جایگزین مناسبی برای کود‌های شیمیایی است و به­طور قابل توجهی با جوانه­زنی بذر، افزایش رشد، افزایش طول ساقه، تولید گل، رشد ریشه، سرکوب استرس فلزات سنگین و فعالیت ضد میکروبی در گیاهان مرتبط است. جلبک دریایی باعث بهبود کارایی مصرف آب و دریافت مواد مغذی شده در نتیجه باعث افزایش رشد گیاه می‌شود (Hossain & Shourove, 2022). تیمار کاراگینان در نهال‌های برنج (Oryza sativa) سبب افزایش زیست­توده اندام هوایی و ریشه و افزایش بیان ژن­های کد­کننده‌کینازهای وابسته به سیکلین، آنزیم­های دخیل در سنتز و انتقال اکسین ایندول 3- استیک­اسید شد. علاوه­بر­این سطح رونوشت آنزیمی که تجزیه­کردن اکسین را کد می‌کند کاهش یافت
 (Zhang et al., 2014). بنابراین کاراگینان با افزایش فتوسنتز، جذب کربن و نیتروژن، تقسیم سلولی، سطح اکسین و محتوای متابولیت‌های ثانویه فعالیت‌های ضد­بیماری‌زایی و دارویی را در گیاهان تحریک می‌کند (Moenne & Gonzalez., 2021). تیمار 80 میلی­گرم در لیتر کاراگینان پرتو دیده­شده روی گیاه خاراگوش چینی (Artemisia annua) پارامترهای رشدی نظیر وزن خشک، وزن تر، میزان کلروفیل کل و کارانوئید را افزایش داد (Naeem et al., 2020) که با نتایج این پژوهش مطابقت داشت.

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

طول گل­آذین: نتایج تجزیه واریانس بیانگر این است که اثر محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو­ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر طول گل­آذین بادرنجبویه در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 1). به­طوری­که بیشترین طول گل­آذین (3/44سانتی­‌متر) در تیمار تریکودرما هارزانیوم با غلظت 200 پی­پی­ام و کمترین طول گل­آذین در تیمار شاهد (27 سانتی‌متر) مشاهده شد (شکل 7). محرک­های زیستی با تنظیم فعالیت­های متابولیکی مختلف مانند فتوسنتز همچنین مسیر­های متابولیکی در جذب نیتروژن و گوگرد رشد را بهبود می­بخشند
 (Hatami, 2021; Shukla et al., 2016). گزارش شده است که محرک‌های زیستی به خودی خود مواد مغذی نیستند در عوض جذب مواد مغذی را تسهیل می­کنند (Brown & Saa, 2015). تیمار بوته گوجه­فرنگی با قارچ تریکودرما هارزانیوم به صورت محلول‌پاشی به­طور معنی­داری باعث افزایش کلیه پارامترهای رشدی نظیر ارتفاع و وزن خشک اندام هوایی و ریشه در مقایسه با شاهد شد (., 2011Mwangi et al). در مطالعه‌ دیگری گزارش شد که تریکودرما در تعامل با ریشه گیاه و بهبود رفتار کلونیزاسیون ریشه و تولید متابولیت‌ هایی مانند اکسین منجر به افزایش رشد و عملکرد گیاهان می شودVinale, 2008) ).

تعداد شاخه‌های گل­دهنده: نتایج تجزیه واریانس نشان داد که محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر تعداد شاخه گل­دهنده گیاه بادرنجبویه در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 1). مقایسه میانگین­ها نشان داد که تیمار عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره با غلظت 500 پی­پی­ام سبب ظهور بیشترین تعداد شاخه گل‌دهنده (21 شاخه) شد که نسبت به تیمار شاهد (3/7 شاخه) افزایش سه­برابری داشت (شکل 8). محققان اذعان کردند که محلول­پاشی گل گاوزبان اروپایی (Borago officinalis L.) با نانوذرات سبز آهن و نقره سنتز­شده در عصاره چای سبز منجر به افزایش پارامترهای مورفولوژیکی نظیر تعداد برگ در بوته و تعداد انشعابات جانبی ساقه شد (Dahmardeh et al., 2018).

کلروفیل a، b و کل: بررسی تغییرات کلروفیل در تیمار محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم نشان داد که تغییرات میزان کلروفیل a، b و کل در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بودند (جدول 2).

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

جدول 2- تجزیه واریانس صفات فیتوشیمیایی گیاه بادرنجبویه تحت تیمارهای مختلف محرک زیستی.

Table 2. Analysis of variance of phytochemical traits of lemon balm under different biostimulants treatments.

^{*، ** و ns}: به­ترتیب به مفهوم تفاوت معنی­دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد و بدون اختلاف معنی‌دار می باشد.

 ^{*, **, ns}: Significantly differences at the 5 and 1% of probability levels, and non-significantly difference, respectively.

به ­طوری­که بیشترین میزان کلروفیل a (98/31 میلی‌گرم در گرم ماده تر) در تیمار با کاراگینان در غلظت 100 پی­پی­ام مشاهده شد. در­حالی­که کمترین میزان در تیمار شاهد (6/6 میلی‌گرم در گرم ماده تر) مشاهده شد (شکل 9). در این آزمایش بیشترین میزان کلروفیل b (30 میلی‌گرم در گرم وزن تر) در تیمار با کاراگینان در غلظت 300 میلی‌گرم در ­لیتر به­دست آمد؛ درحالی­که کمترین میزان کلروفیل b (1/5 میلی­گرم در گرم وزن تر) در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 10). همچنین تیمار با محرک زیستی کاراگینان در غلظت 300 میلی‌گرم در میلی­لیتر منجر به تجمع بیشترین میزان کلروفیل کل (3/61 میلی‌گرم در گرم وزن تر) شد؛ درصورتی­که در تیمار شاهد کمترین میزان کلروفیل کل (6/10 میلی‌گرم در گرم وزن تر) مشاهده شد (شکل 11).

نتایج تحقیقی نشان داد کاراگینان با تأثیر بر محتوای کلروفیل گیاه میزان فتوسنتز را افزایش می‌دهد .(Khan, 2009) محلول­پاشی کاراگینان محتوی کلروفیل، زیست­توده (بیوماس) و فتوسنتز را از طریق افزایش فعالیت فتوسیستم 2 بهبود می‌بخشد و باعث افزایش آنزیم­های روبیسکو و دیگر آنزیم­های دخیل در متابولیسم پایه مانند گلوتامات­دهیدروژناز، آنزیم­های سنتز­کننده‌ (H) NADP، پیروات­دهیدروژناز، ایزوسیترات­دهیدروژناز، گلوکوز 6-فسفات­دهیدروژناز می‌شود و از این طریق فتوسنتز را بهبود می‌بخشد (Castro, 2012).

کارتنوئید: نتایج تجزیه واریانس حاکی از آن است که تأثیر سطوح مختلف محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر مقدار کارتنوئید در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 2). مقایسه میانگین­ها نشان داد که بر اثر محلول­پاشی محرک­‌های زیستی مختلف بیشترین میزان کارتنوئید (6/8 میلی­گرم در گرم بافت تر) از تیمار محلول­پاشی با عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره در غلظت 125 میلی­گرم در لیتر و در مقابل کمترین میزان کارتنوئید (9/2 میلی‌گرم در گرم وزن تر) در تیمار شاهد به­دست آمد (شکل 12). نتایج نشان داد که محلول­پاشی بابونه کبیر
 (Tanacetum parthenium) با نانوذرات سبز نقره سنتز­شده در عصاره رزماری منجر به افزایش میزان کارتنوئید شد (Mehdinejad et al., 2019).

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

آنتوسیانین: نتایج تجزیه واریانس داده­های حاصل از آزمایش نشان دادکه تأثیر سطوح مختلف محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر میزان آنتوسیانین در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 2). به طوری­که بیشترین میزان آنتوسیانین (4/80 میلی­گرم در گرم وزن تر) در تیمار محلول­پاشی تریکودرما هارزانیوم با غلظت 400 میلی‌گرم در لیتر حاصل شد و کمترین میزان آنتوسیانین (3/15 میلی­گرم در گرم وزن تر) در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 13). گروهی از محققین بیان کردند که محتوای رنگدانه‌ها در گوجه­فرنگی (Lycopersicum esculentum) در تمام تیمار­ها‌ی همراه با القا­کننده­ها‌ی شیمیایی (سالسیلیک­اسید، اسیدآبسیزیک، سیلیکات پتاسیم) همراه با قارچ تریکودرما هارزانیوم به طور معنی­داری افزایش یافت (Adass, 2021). در پژوهشی تجمع پلی فنل‌ها در گیاه گل ساعتی (Passiflora caerulea) در تیمار با تریکودرما هارزانیوم در مقایسه با شاهد افزایش یافت
Şesan, 2020)).

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

فنل کل: نتایج تجزیه واریانس نشان دادکه تأثیر سطوح مختلف محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر صفت فنل کل در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 2). به­طوری‌که بیشترین میزان فنل (1/41 میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن خشک) در محلول­پاشی با تریکودرما هارزانیوم در غلظت 200 میلی‌گرم بر ‌لیتر و کمترین میزان آن (88/21میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن خشک) در تیمار شاهد به­دست آمد (شکل 14). محرک‌های زیستی با تنظیم فعالیت­های متابولیکی مختلف مانند فتوسنتز و مسیر­های جانبی، تقسیم سلولی، مسیر­های مصنوعی ساخت پورین و پیرمیدین و همچنین مسیر­های متابولیکی در جذب نیتروژن و گوگرد رشد را بهبود می­بخشند
 (Hatami, 2021 & Shukla et al., 2016).

فلاونوئید: نتایج تجزیه واریانس حاکی از آن است که تأثیر سطوح مختلف محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم در مورد میزان فلاونوئید در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 2). مقایسه میانگین­ها نشان داد که در اثر محلول­پاشی محرک­های زیستی مختلف بیشترین میزان فلاونوئید (4/1معادل میلی­گرم کوئرستین بر گرم ماده خشک) از تیمار محلول­پاشی با عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره با غلظت 500 میلی‌گرم در لیتر حاصل شد و در مقابل کمترین میزان فلاونوئید کل (27/0میلی­گرم کوئرستین بر گرم ماده خشک) در تیمار شاهد به­دست آمد (شکل 15). پژوهشگران اذعان کردند که تأثیر نانو نقره سبز سنتز­شده در عصاره گیاه رزماری (Salvia rosmarinus) بر صفاتی مانند کربوهیدرات، کلروفیل a، کلروفیل b، فلاونوئید، پرولین و کارتنوئیدگیاه بابونه کبیر اثر معنی­داری داشته و علت آن را افزایش فعالیت نیترات­ردوکتاز و گلوتامات­دهیدروژناز و در نتیجه افزایش رشد و میزان فتوسنتز دانستند (Mehdinejad et al., 2019).

فعالیت آنتی­اکسیدانی: نتایج تجزیه واریانس داده­ها بیانگر آن است که تأثیر سطوح مختلف محرک­های زیستی کاراگینان، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره و تریکودرما هارزانیوم بر فعالیت آنتی­اکسیدانی عصاره بادرنجبویه در تیمارهای مختلف در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 2). به­طوری‌که بیشترین میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی (1/78 درصد مهار رادیکال­ها‌ی آزاد DPPH) در محلول­پاشی با تریکودرما هارزانیوم در غلظت 400 پی­پی­ام و کمترین میزان فعالیت آنتی­اکسیدانی (56 درصد مهار رادیکال­ها‌ی آزاد DPPH) در تیمار شاهد به‌دست آمد (شکل 16). محرک‌های زیستی مختلف بر مسیرها‌ی بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه در سلول‌های گیاهی تأثیر می‌گذارند Hatami, 2021)) که وجود این متابولیت‌های ثانویه در گیاهان سبب افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی خواهد شد. رشد ریشه از مزایای مشترک گونه­های مختلف تریکودرماست که با تولید هورمون­های گیاهی نظیر اکسین، اسید­هارزیانیک و هارزیونالید کنترل می‌شود (Caei et al., 2013). عصاره­های گوجه‌فرنگی که تحت تیمار تریکودرما قرار گرفتند فعالیت مهار‌کنندگی بالاتری بر رادیکال‌های آزاد DPPH  نسبت به شاهد نشان دادندکه بیان­کننده‌ فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالاتر عصاره متانولی حاصل از گوجه‌فرنگی تیمار­شده با تریکودرما در مقایسه با شاهد است (Singh, 2013).

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

نتیجه­گیری کلی

نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده از محرک زیستی عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره با غلظت 125 پی‌پی‌ام سبب بهبود ویژگی‌های مورفولوژیکی گیاه شد به­طوری­که افزایش 61 درصدی در مقادیر عرض برگ در مقایسه با تیمار شاهد مشاهد شد. همچنین در تیمار کاراگینان 600 پی‌پی‌ام افزایش 9/4 برابری در مقادیر وزن خشک بوته در مقایسه با تیمار شاهد مشاهده شد. از لحاظ مقادیر آنتوسیانین و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی برگ، تیمار تریکودرما هارزانیوم در غلظت 400 پی‌پی‌ام بیشتر از سایر تیمارها مؤثر بود.

کاراگینان 100 (k100)، کاراگینان 300 (k300)، کاراگینان 600 (k600)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 125 (N125)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 250 (N250)، عصاره زعفران محتوی نانو ذرات نقره 500 (N500)، تریکودرما هارزانیوم 100 (T100)، تریکودرما هارزانیوم 200 (T200)، تریکودرما هارزانیوم 400 (T400)، و آب مقطر (شاهد).

REFERENCES

1. Acharya, S., Sigdel, S., Kandel, G. & Adhikari, P. (2022). Climate change: Threats on the medicinal plants in Nepal. Asian Journal of Pharmacognosy, 1(4), 41-48.
2. Adass, I. A., Amer, G., Bayoumy, S. R. & Eid, R. (2021). Effect of abscisic acid, salicylic acid, potassium silicate, and Trichoderma harzianum as biocontrol agent to induce the tomato resistance against early blight disease caused by Alternaria solani. Alexandria Science Exchange Journal, 42(3), 773-787.
3. Baltazar, M., Correia, S., Guinan, K. J., Sujeeth, N., Bragança, R. & Gonçalves, B. (2021). Recent advances in the molecular effects of biostimulants in plants: An overview. Biomolecules, 11(8), 1096.
4. Brown, P. & Saa, S. (2015). Biostimulants in agriculture. Frontiers in Plant Science, 6, 671.
5. Cai, F., Yu, G., Wang, P., Wei, Z., Fu, L., Shen, Q. & Chen, W. (2013). Harzianolide, a novel plant growth regulator and systemic resistance elicitor from Trichoderma harzianum. Plant Physiology and Biochemistry, 73, 106-113.
6. Castro, J., Vera, J., González, A. & Moenne, A. (2012). Oligo-carrageenans stimulate growth by enhancing photosynthesis, basal metabolism, and cell cycle in tobacco plants (var. Burley). Journal of Plant Growth Regulation, 31(2), 173-185.
7. Dahmardeh, M. T., Taji, R., Khammari, I. & Haddad, T. (2018). Synthesis of green iron and silver nanoparticles using green tea extract (Camellia sinesis) and its effect on quantitative and qualitative characteristics of European borage (Borago officinalis L.). Iranian Medicinal and Aromatic Plants Research, 330-345. (In Persian)
8. Franzoni, G., Cocetta, G., Prinsi, B., Ferrante, A. & Espen, L. (2022). Biostimulants on crops: Their impact under abiotic stress conditions. Horticulturae, 8(3), 189.
9. Ghorbani Ghozhadi, H. M., Mohkami, Z. & Estaji, A. (2021). Medicinal herbal medicine in traditional the victim of Iranian medicine. First Edition, Tehran: Marz Danesh Publications, page 152. (In Persian)
10. Hajlaoui, H., Arraouadi, S., Noumi, E., Snoussi, M. & Kadri, A. (2021). Melissa officinalis essential oil: Chemical composition, antioxidant, antibacterial and antifungal activities-in vitro study. Journal of Pharmaceutical Research International, 33(60B), 1529-1537.
11. Hatami, M., Khanizadeh, P., Bovand, F. & Aghaee, A. (2021). Silicon nanoparticle-mediated seed priming and Pseudomonas spp. inoculation augment growth, physiology and antioxidant metabolic status in Melissa officinalis plants. Industrial Crops and Products, 162, 113-238.
12. Hossain, M. A. & Shourove, J. H. (2022). Prospects and probabilities of irradiated cellulose and carrageenan in food and agricultural industries. In radiation-processed polysaccharides (pp. 155-177), Academic Press.
13. Kapoor, S., Sood, H., Saxena, S. & Chaurasia, O. P. (2022). Green synthesis of silver nanoparticles using Rhodiola imbricata and Withania somnifera root extract and their potential catalytic, antioxidant, cytotoxic and growth-promoting activities. Bioprocess and Biosystems Engineering, 1-16.
14. Khan, W., Rayirath, U. P., Subramanian, S., Jithesh, M. N., Rayorath, P., Hodges, D. M. & Prithiviraj, B. (2009). Seaweed extracts as biostimulants of plant growth and development. Journal of Plant Growth Regulation, 28(4), 386-399.
15. Lee, S. H., Jeong, Y. S., Song, J., Hwang, K. A., Noh, G. M. & Hwang, I. G. (2017). Phenolic acid, carotenoid composition, and antioxidant activity of bitter melon (Momordica charantia) at different maturation stages. International Journal of Food Properties, 20(sup3), S3078-S3087.
16. Mehdinejad, N., Mousavi, H., Fakheri, B. & Heidari, F. (2019). Evaluation of the effect of nanoparticles on changes in some physiological traits, photosynthetic pigments and the active ingredient of chamomile parthenolide under dehydration stress. Plant Process and Function, 219-227. (In Persian)
17. Moenne, A. & González, A. (2021). Chitosan-, alginate-carrageenan-derived oligosaccharides stimulate defense against biotic and abiotic stresses, and growth in plants: A historical perspective. Carbohydrate Research, 503, 108298.
18. Moradkhani, H., Sargsyan, E., Bibak, H., Naseri, B., Sadat-Hosseini, M., Fayazi-Barjin, A. & Meftahizade, H. (2010). Melissa officinalis, a valuable medicine plant: A review. Journal of Medicinal Plants Research, 4(25), 2753-2759.
19. Mwangi, M. W., Monda, E. O., Okoth, S. A. & Jefwa, J. (2011). Inoculation of tomato seedlings with Trichoderma harzianum and arbuscular mycorrhizal fungi and their effect on growth and control of wilt in tomato seedlings. Brazilian Journal of Microbiology, 42(2), 508-513.
20. Murthy, H. N., Lee, E. J. & Paek, K. Y. (2014). Production of secondary metabolites from cell and organ cultures: strategies and approaches for biomass improvement and metabolite accumulation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 118(1), 1-16.
21. Naeem, M., Nabi, A., Aftab, T. & Khan, M. (2020). Oligomers of carrageenan regulate functional activities and artemisinin production in Artemisia annua exposed to arsenic stress. Protoplasma, 257(3), 871-887.
22. Najafi, Sh. (2010). Medicinal plants. Marandiz Publications. Mashhad, Iran. 390 p. (In Persian)
23. Omid Beigi, R. (2000). Approaches to the production of medicinal plants. First Edition, Tehran: Publishing Designers Publications, 37-38. (In Persian)
24. Pressi, G., Bertaiola, O., Guarnerio, C., Barbieri, E., Guzzo, F., Durand, C., Peno-Mazzarino, L., Cocetta, V., Giacomini, I. & Semenzato, A. (2021). In vitro cultured Melissa officinalis cells as effective ingredient to protect skin against oxidative stress, blue light, and infrared irradiations damages. Cosmetics, 8(1), 23.
25. Rahim Malek, M. & Khorsandi, D. (2015). Knowledge of compounds and biotechnology of medicinal plants. Isfahan: Academic Center for Education, University of Isfahan, Isfahan, Iran. 176 p. (In Persian)
26. Rasht, I. (2013). Effect of application of iron fertilizers in two methods′ foliar and soil application’on growth characteristics of Spathyphyllum illusion. European Journal of Experimental Biology, 3, 232-242.
27. Salahi Ostad, M., Abedi, B. & Selahverzi, Y. (2020). The effect of Trichoderma (Trichoderma harzianum) on the coexistence of basil populations. The 7th National Congress of Biology and Natural Sciences of Iran. Iran.
28. Singh, S. P., Singh, H. B., & Singh, D. K. (2013). Effect of Trichoderma harzianum on mineral component and antioxidant activity of tomato fruits. Vegetos, 26(2), 237-244.
29. Singh, M., Khan, M. M. A., Uddin, M., Naeem, M. & Qureshi, M. I. (2017). Proliferating effect of radiolytically depolymerized carrageenan on physiological attributes, plant water relation parameters, essential oil production and active constituents of Cymbopogon flexuosus under drought stress. PLoS One, 12(7), e0180129.
30. Şesan, T. E., Oancea, A. O., Ştefan, L. M., Mănoiu, V. S., Ghiurea, M., Răut, I. & Oancea, F. (2020). Effects of foliar treatment with a Trichoderma plant biostimulant consortium on Passiflora caerulea yield and quality. Microorganisms, 8(1), 123.
31. Soliman, M., Qari, S. H., Abu-Elsaoud, A., El-Esawi, M., Alhaithloul, H. & Elkelish, A. (2020). Rapid green synthesis of silver nanoparticles from blue gum augment growth and performance of maize, fenugreek, and onion by modulating plants cellular antioxidant machinery and genes expression. Acta Physiologiae Plantarum, 42(9), 1-16.
32. Vinale, F., Sivasithamparam, K., Ghisalberti, E. L., Marra, R., Barbetti, M. J., Li, H. & Lorito, M. (2008). A novel role for trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants. Physiological and Molecular Plant Pathology, 72(1-3), 80-86.
33. Zekavati, H. R., Mansouri, N. & Fatemi, S. R. (2021). Effect of Trichoderma harzianum fungus on the physiology traits and some‎ vegetative and reproductive characteristics of tuberose (Polianthes tuberose cv.‎ Double) under drought stress conditions‎. Iranian Journal of Horticultural Science, 51(4), 1017-1026.
34. Zhang, Y., Yin, H., Zhao, X., Wang, W., Du, Y., He, A. & Sun, K. (2014). The promoting effects of alginate oligosaccharides on root development in Oryza sativa mediated by auxin signaling. Carbohydrate Polymers, 113, 446-454.