بررسی اثر ریزنمونه و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر کالوس‌زایی در اکوتیپ‌های گیاه آنغوزه (Ferula assa-foetida L.)

. مقدمه

گیاهان دارویی دارای اهمیتی جهانی و فراگیر بوده و در شمار میراث‌های بومی کشورها هستند. این گیاهان در طول تاریخ جزء منابع اصلی پزشکی و داروسازی در اکثر نقاط جهان مانند ایران، چین، یونان، هندوستان و مصر بوده­اند (Ghasemi, 2009). امروزه تاکید فراوانی بر استفاده از داروهایی با منشاء طبیعی در درمان و حفظ سلامتی وجود دارد. تقریبا یک‌چهارم داروهای تولید­شده، حاوی عصاره‌های گیاهی یا ترکیباتی هستند که از مواد گیاهی به­دست­آمده و یا اینکه براساس ترکیبات گیاهی مدل‌سازی شده­اند (Shirazi et al., 2014). به علت بهره‌برداری‌های بی‌رویه و نامناسب از گیاه دارویی آنغوزه به روش سنتی نسل آن در معرض خطر انقراض قرارگرفته و تراکم آن در مراتع به­شدت کاهش یافته است. در نتیجه برخی از گونه­های این گیاه به­عنوان گونه‌­ی آسیب‌پذیر در کتاب گیاهان در حال انقراض ایران ثبت شده­اند (Zare et al., 2010). از سوی دیگر، تنها روش تکثیر این گیاه از طریق بذر است، ولی به دلیل وجود خواب بذور و قوه نامیه کم، تکثیر و احیای این گیاه از طریق زراعت کاری سخت و مشکل است
 (Gupta, 2003). یکی دیگر از ابزارهای کلیدی برای برنامه‌های حفاظتی گیاهان در حال انقراض، جوانه‌زنی بذور آن­ها در شرایط آزمایشگاهی است. وجود خواب در بذور این گیاهان سبب کاهش موفقیت‌آمیز کشت زراعی آن­ها شده است. یک دوره سرما سبب حذف خواب اولیه بسیاری از گونه‌های گیاهی نیمکره شمالی می‌شود (Zare et al., 2011; Tieu et al., 2001). جوانه­زنی به وضعیت فیزیولوژیکی بذر (خواب) و تا حدودی تعادل بین هومورن­های داخلی جیبرلین و آبسیزیک­اسید بستگی دارد. آنزیم‌های GA3ox1،GA3ox2 ، GA2ox2 به دلیل نقش کلیدی خود در سیگنال­دهی جیبرلین نقش مهمی در طول جوانه­زنی دارند. ژن­های بسیار زیادی در جوانه­زنی و شکست خواب تاثیرگذار هستند، از جمله این ژن­ها می­توان به ژن OsABI5، در پاسخ‌گویی اسید­آبسیزیک و ژن­های GAI و GAMYB در پاسخگویی به اسید­جیبرلیک اشاره کرد که در بذر فعال هستند که نشان‌دهنده یک مسیر بالقوه درگیر در فرآیند جوانه‌زنی اولیه بذر است (Li et al., 2022).

در حال حاضر، فناوری­های کشت بافت گیاهی به عنوان یک ابزار قوی جهت مطالعه مشکلات اساسی و کاربردی زیست­شناسی گیاهی است. مهم‌ترین موارد استفاده از کشت بافت و سلول­های گیاهی شامل تکثیر انبوه و سریع گیاهان، اصلاح ارقام، تولید گیاهان عاری از بیماری و تهیه اکوتیپ­های مقاوم به تنش­های محیطی می­باشد. در سال‌های اخیر تکنیک کشت بافت به عنوان ابزاری مناسب برای حفظ ژرم‌پلاسم گیاهان دارویی کمیاب و در معرض خطر، به شمار می­رود (He et al., 2007;
Martin et al., 2003). ایجاد کالوس و بهینه‎سازی آن و باززایی گیاه در این ارتباط حائز اهمیت می‎باشد. از جمله عواملی که در تولید کالوس موثرند، اکوتیپ، تنظیم‎کننده‎های رشد، محیط کشت، نوع کربوهیدرات، نوع جداکشت، سن جداکشت و شرایط محیطی می‎باشد. نتایج نشان داده است که وابستگی خاص القاء کالوس و باززایی گیاه به اکوتیپ اجتناب‌ناپذیر و کلی است و القاء کالوس و باززایی گیاه با اکوتیپ گیاه تغییر می‎کند. رشد کالوس در یک گونه گیاهی بر اساس نوع جداکشت آن گیاه متفاوت بوده و علت آن به درستی مشخص نشده ‎است (Han et al., 2011). بنابراین، به نظر می­رسد که پاسخ­های مشاهده­شده در کشت بافت به طور مستقیم با خصوصیات کلی گیاه با اندام­های گیاهی، برای مثال خصوصیات مورفولوژیک در شرایط طبیعی، ارتباط داشته باشد؛ در­حالی­که تعیین خصوصیاتی از گیاه کامل که در سایر ویژگی­های کشت­های درون­شیشه­ای، برای مثال سرعت رشد کالوس تاثیر می­گذارند، مشکل­تر است. به احتمال زیاد خصوصیاتی که از لحاظ ژنتیکی تعیین می­شوند، حاصل اثر ثانویه فعالیت یک ژن هستند. این یک نوع اثر چند­گرایی است که در آن اثر اصلی یک یا چند ژن سبب بروز سایر صفات و ویژگی­های نامرتبط می­شود.

گیاه آنغوزه تلخ (spp. Ferula) سومین جنس بزرگ خانواده Apiaceae با 180-185 گونه است که از نظر جغرافیایی از آسیای مرکزی به سمت غرب در سراسر منطقه مدیترانه تا شمال آفریقا پراکنده شده است. کشور ایران خاستگاه اصلی و یکی از مراکز مهم جنس Ferula است که بیش از 30 گونه Ferula در آن وجود دارد که حدود نیمی از آن­ها بومی هستند که از بین آن­ها می‌توان به F. assafoetida، F. gummosa، F. persica، F. tabasensis و F. latisecta اشاره کرد (Salehi et al., 2019;
Yaqoob & Nawchoo, 2016). برخی از گیاهان جنس Ferula قرن‌ها به عنوان گیاهان دارویی در بسیاری از کشورها مورد استفاده قرار می‌گیرند (Ahmed et al., 2007). متابولیت‌های جنس Ferula دارای فعالیت‌های بیولوژیکی از جمله ویژگی­های ضد ویروسی، ضد التهابی، ضد توموری، ضد سرطانی، ضد زخم، ضد دیابت، ضد باکتری، ضد قارچی، سیتوتوکسیک، استروژنیک، کنه‌کشی، ضد پروتوزوئال و ضد گلیکاسیون هستند ( Zhou et al., 2017; Soltani et al., 2018).

براساس نتایج حاصل از تحقیق Kumar et al. (2020) دامنه جوانه‌زنی بذور اکوتیپ­های آنغوزه تلخ بین 69/16تا 71/42 روز (میانگین 14/30 روز) متغیر است. بیشترین میانگین زمان جوانه‌زنی (9/66 درصد) در اکوتیپ  EC966538و کمترین میانگین زمان جوانه‌زنی (85/20 درصد) در اکوتیپ EC968469 و دمای پنج درجه سانتی‌گراد مشاهده شده است. همچنین
 .Rajabiyan et al (2007) نیز گزارش کردند که کاربرد تیمـار سـرمادهی بـرای بـذور گیاه آنغوزه تلخ در هـر دو جمعیت شیرکوه و طبس سبب افزایش درصد جوانه‌زنی در آن­ها شد؛ به­طوری­که حداکثر درصـد جوانه‌زنی در جمعیت‌ شـیرکوه و طبس به­ترتیب 84 و 56 درصد بود که نشان‌دهنده تاثیر متفاوت سرما روی انواع اکوتیپ‌ها است. براساس مطالعات متعددی که پژوهشگران روی انواع گونه­های Erythronium و Osniorhiza انجام داده­اند، مشخص شده است که این گیاهان دارای درجات متفاوتی از خواب فیزیولوژیکی می‌باشند که با اعمال دوره‌های سرمادهی مناسب شکسته می‌شود. طبق نظریه‌ای که مورد قبول بسیاری از متخصصین مسائل بذر است، سرما باعث افزایش بیان ژن‌های مربوط به محتوای جیبرلیک­اسید (GA3) یا سبب کاهش محتوای آبسیزیک­اسید و یا هر دو تغییر به­طور همزمان شده و با ایجاد تعادل هورمونی موجب پایان خواب بذر می­شود (Yamauchi et al., 2004). نتایج حاصل از تحقیقات Zare et al. (2010) در گیاه آنغوزه نشان داد که بهترین ریز­نمونه برای کالوس­زایی ریز­نمونه ریشه بوده و بهترین سطح هورمونی نیز مربوط به سطح یک میلی‌گرم NAA و دو میلی‌گرم BAP بود. بر اساس پژوهشی که
 Janghorbaniyan et al.  (2014) روی گیاه آنغوزه تلخ داشتند، مشخص شد که ریشه توانایی بیشتری برای القاء کالوس داشته و کالوس حاصل از این ریز­نمونه وزن و میانگین قطر بیشتری نسبت به ریز­نمونه‌های دیگر داشت. همچنین آن­ها بیان کردند که کالوس حاصل از ریشه‌چه و هیپوکوتیل پتانسیل جنین­زایی دارند. با بررسی Hasani et al.  (2007) روی گیاه آنغوزه تلخ، بیشترین درصد کالوس­زایی در ریز­نمونه هیپوکوتیل و با استفاده از چهار میلی‌گرم در لیتر هورمون Kin به­همراه 5/0 میلی‌گرم هورمون NAA مشاهده شد. این تحقیق با هدف تعیین میزان تاثیر سرما بر اکوتیپ‌های مختلف و مقایسه اثرات بهترین هورمـون­ها بر ریزنمونه­ها و در عـین حـال اثر متقابل بین هورمون‌ها و اکوتیپ­ها به منظور کالوس­زایی این گیاه در شـرایط کشت درون شیشه انجام شده است.

2. روش‎شناسی پژوهش

بذور گیاه آنغوزه تلخ در تیرماه 1400 از جمعیت‌های طبیعی استان‌های اصفهان، یزد و کرمان که توسط پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی کرج جمع‌آوری شدند، تهیه شد. در ابتدا بذور سالم و بدون شکستگی انتخاب و در ارلن ریخته شد و به مدت 24 ساعت زیر آب جاری قرار گرفت. سپس مراحل بعدی سترون­سازی انجام گرفت. آب جاری به عنوان یک پیش­تیمار برای تمامی تیمارها اعمال شد. پس از سترون­سازی بذرها زیر هود لامینار، آن­ها به داخل شیشه­های مربای حاوی محیط کشت MS  (بدون هورمون) منتقل شدند و به مدت 40 روز داخل یخچال چهار درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. 40 روز بعد از کشت بذور درصد جوانه‌زنی آن­ها محاسبه شد .(Otroshy et al., 2009) پس از جوانه‌زنی بذور، از بخش­های مختلف گیاهچه­های درون شیشه­ای شامل ریشه، ساقه و برگ به­عنوان ریزنمونه­های گیاهی جهت القاء کالوس در محیط­های هورمونی مختلف استفاده شد. نمونه­ها به قطعات یک سانتی­متری برش داده شدند و در هر شیشه پنج قطعه نمونه قرار داده شد.

به­منظور القاء کالوس هورمون­های NAA و BAP با غلظت­های مختلف طبق جدول 1 به محیط اضافه و کشت­های انجام­شده تحت شرایط دمایی 25 درجه سانتی‌گراد و تاریکی نگه‌داری شدند. هر 15 روز یک‌بار ریزنمونه‌ها به محیط‌های جدید منتقل و با استفاده از کاغذ میلیمتری یادداشت‌برداری انجام شد. در این مرحله طول، عرض، ارتفاع و حجم کالوس­ها محاسبه شد.

جدول 1. غلظت هورمون­های استفاده­شده جهت القاء کالوس­زایی (برحسب میلی­گرم در لیتر).

این آزمایش در دو مرحله مختلف انجام شد. هر دو مرحله بر پایه آزمایش فاکتوریل در دو فاکتور و در قالب طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار و چهار ریز نمونه در هر تکرار انجام شد. فاکتورهای مرحله اول شامل فاکتور مربوط به ریزنمونه گیاهی در سه سطح (ریشه، برگ و ساقه) و فاکتور دوم نوع محیط کالوس­زایی در 5 سطح بود (جدول 1). فاکتور­های مرحله دوم شامل فاکتور اکوتیپ­ها (یزد، کرمان و اصفهان) و فاکتور دوم که مربوط به زمان­های مختلف یادداشت­برداری در چهار سطح (هفته دوم، چهارم، ششم و هشتم) بود. در این مرحله نیز برای اندازه­گیری صفات از کاغذ میلی­متری استفاده شد. در پایان آزمایش، داده­ها با استفاده از نرم­افزار SAS 9.2 مورد آنالیز قرار گرفته و میانگین­ها نیز مطابق آزمون چند­دامنه­ای دانکن در سطح احتمال یک درصد با یکدیگر مقایسه شدند.

3. یافته­های پژوهش و بحث

نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که میزان جوانه‌زنی سه اکوتیپ اصفهان، کرمان و یزد بسیار متفاوت بود. در ماه اول، هیچ جوانه‌زنی در بذور اکوتیپ­ها مشاهده نشد؛ اما به­تدریج در اواخر مـاه اول تیمار سرما سبب شکستن خواب اکثر اکوتیپ­های یزد و کرمان شد، ولی هیچ جوانه­زنی در اکوتیپ اصفهان در ماه اول مشاهده نشد. در ماه دوم، جوانه­زنی بذور در اکوتیپ­های کرمان، یزد و اصفهان به­ترتیب 85، 73 و 45 درصد بود. در بین اکوتیپ­های مـورد استفاده، بیشترین درصد جوانه‌زنی مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین آن مربوط به اکوتیپ اصفهان بود. با­توجه­به اینکه رشد و شکستن خواب اکوتیپ اصفهان به­کندی صورت گرفت از ادامه کار حذف شد. از مهمترین عوامل اصلی جوانه‌زنی هر گیاهی نداشتن خواب بذر است که وابسته به نوع خواب از روش‌های مختلف جهت شکستن خواب آن استفاده می­کنند. علاوه­بر تعادل هورمونی بین جیبرلین و آبسیزیک‌اسید، ژن‌های پروتئین کیناز (CIPK) مانند CIPK13، CIPK14 و CIPK17 با تعامل CBL، به­طور بالقوه با پروتئین‌های دیگر برهمکنش داشتند که نشان‌دهنده نقش محوری آن­ها در جوانه‌زنی اولیه بذر است (Li et al., 2022). براساس مطالعات انجام شده توسط سایر محققان بهترین روش شکستن خواب بذر گیاه آنغوزه سرمادهی است (Zare et al., 2011). با­توجه­به ماهیت ژنتیکی و فیزیولوژیکی متفاوت بذور، درصد جوانه‌زنی اکوتیپ­ها متفاوت بود. نتایج حاصل ازKumar et al.  (2020) نیز نشان داد که درصد جوانه­زنی بذور آنغوزه در اکوتیپ­های مختلف متفاوت بود؛ به­طوری­که بیشترین درصد جوانه‌زنی در دمای 5 درجه سانتی­گراد و بذور مربوط به اکوتیپ EC966538 و کمترین درصد جوانه‌زنی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و بذور مربوط به اکوتیپ EC968469 بود که با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت داشت. همچنین Radjabian et al.  (2007) نشان دادند که تیمـار سـرمادهی چهار درجه سانتی­گراد بـرای بـذرهای هـر دو جمعیت مورد مطالعه سبب افزایش درصد جوانه­زنی آن­ها شد. پس از 12 هفته حداکثر میزان درصـد جوانـه­زنـی در جمعیت­هـای شـیرکوه و طبس به­ترتیب 84 و 56 درصد بود. آن­ها بیان کردند که افـزایش غلظـت GA3 درون‌زا در نتیجه تیمار سرمادهی عامل مؤثر بر افزایش درصد جوانه‌زنی بذرها می­باشد.

نتایج تجزیه واریانس حجم، طول، عرض و ارتفاع کالوس­زایی برای انواع مختلف ریزنمونه و غلظت­های هورمونی در جدول 2 آمده است. اثرات اصلی هورمون­ها و ریز­نمونه بر صفات اندازه‌گیری­شده شامل ارتفاع، عرض و حجم کالوس در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود؛ در­حالی­که در اثر متقابل بین ریزنمونه و سطوح هورمونی برای صفات طول، عرض و ارتفاع تفاوت معنی­داری مشاهده نشد. تشکیل کالوس در محیط کشت، ابتدا در لبه­های برش­یافته که تماس مستقیمی با محیط کشت داشتند، انجام شده و به­تدریج طی روزهای بعد سرتاسر نمونه را فراگرفت. چهار هفته پس از کشت، در تمام تیمارهای هورمونی روی ریزنمونه­های ریشه، ساقه و برگ کالوس مشاهده شد. کالوس­های مشاهده­شده در اندام ریشه در تمامی تیمارهای هورمونی نرم، آبکی و سفید تا شیری‌رنگ بودند؛ ولی کالوس­های ایجاد­شده از اندام ساقه ترد و شکننده بودند که پس از چندین هفته نکروزه شده و از بین رفتند. کالوس­های ایجاد­شده در ریزنمونه برگ نسبت به سایر ریزنمونه­ها بسیار کوچک­تر بودند به­طوری­که بعد از مدت کوتاهی نکروزه شده و از بین رفتند. حجم کالوس در ریزنمونه ریشه در تمام تیمارهای هورمونی بیشتر از ریزنمونه ساقه و برگ بود. به نظر می‌رسد عاملی که سبب حذف کالوس­های برگ و ساقه شد، غیر فعال­بودن ژن­های مربوط به کالوس­زایی باشد. الگوی بیان ژن­ها تحت تاثیر هورمون­های درونی و ریزنمونه­ها بسیار متفاوت است؛ به­طوری­که می­توان اشاره کرد منبع تجمع اکسین در گیاهان در ریشه­ها است؛ به همین دلیل القاء کالوس­زایی در ریشه­ها نسبت به سایر ریزنمونه­ها بیشتر بود.

جدول 2. میانگین مربعات تجزیه واریانس اثر نوع ریزنمونه و تنظیم‌کننده‌های رشدی بر طول، عرض، ارتفاع، و حجم کالوس­های گیاه آنغوزه تلخ در شرایط درون­شیشه­ای.

^ns، ^*و ^** به­ترتیب غیر معنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

تحقیقات متعددی، گویای تاثیرگذاری عوامل خارجی و داخلی بر نتایج حاصل از کشت بافت است که از جمله این عوامل می­توان به نوع ریزنمونه، ترکیبات محیط کشت و شرایط فیزیکی محیط اشاره کرد.(Lal et al., 2016) بیشترین ارتفاع کالوس (43/0 سانتی­متر) و کمترین ارتفاع آن (24/0 سانتی­متر) به­ترتیب در محیط دو میلی­گرم BAP و یک میلی­گرم NAA و محیط یک میلی­گرم BAP و دو میلی­گرم NAA بود. از نظر طول کالوس بیشترین مقدار مربوط به محیط چهار میلی­گرم BAP و یک میلی­گرم NAA (33/1 سانتی­متر) و کمترین مقدار آن (10/1 سانتی­متر) مربوط به محیط یک میلی­گرم BAP و یک میلی­گرم NAA بود. همچنین بیشترین مقدار عرض کالوس (53/0 سانتی­متر) مربوط به محیط دو میلی­گرم BAP و یک میلی­گرم NAA و کمترین مقدار آن (26/0 سانتی­متر) مربوط به یک میلی­گرم BAP و دو میلی­گرم NAA بود (شکل 1). بر اساس نتایج حاصله حداکثر حجم، طول و عرض کالوس با استفاده از یک میلی­گرم در لیتر NAA در ترکیب با دو میلی­گرم در لیتر BAP به دست آمد. با­توجه­به اینکه کمترین زمان برای شروع کالوس­زایی در همین ترکیب هورمونی به­دست آمد، می­توان با استفاده از این سطح هورمونی به بیشترین میزان کالوس در کمترین زمان دست یافت. بدیهی است که تولید کالوس بیشتر در مدت زمان کمتر، یکی از اهداف مهم روش­های کشت بافت می­باشد و این امر، علاوه­بر صرفه جویی در وقت و هزینه، از تنوع سوماکلونی احتمالی در نتیجه طولانی­شدن مدت زمان کشت جلوگیری می­کند؛ بنابراین استفاده از ترکیبات هورمونی فوق در مقایسه با ترکیبات دیگر از پتانسیل خوبی برخوردار هستند.

واکنش متفاوت ریزنمونه­ها از لحاظ کالوس­زایی به تغییرات غلظت تنظیم­کننده­های رشدی می‌تواند مربوط به فیزیولوژی و ژنتیک گیاه منبع ریزنمونه­ها (گیاه پایه) باشد که تاثیر عمیقی روی پاسخ­دهی در شرایط درون­شیشه­ای دارد. اگرچه گیاهان حاصل از تکثیر رویشی (کلون­ها)، از لحاظ ژنتیکی کاملا شبیه گیاه مادری هستند، اما توده کلونی حاصل از یک گیاه مادری با توده کلونی حاصل از گیاه مادری دیگر متفاوت است (Merkle et al., 1990). براساس تحقیق انجام­شده توسط Zare et al. (2010) مشخص شد که ریزنمونه برگ به مراتب درصد کالوس­زایی کمتری نسبت به ریزنمونه­های میانگره، قطعات گرهی و جوانه انتهایی داشته که این امر احتمالاً مربوط به شرایط فیزیولوژیکی ریزنمونه و مقدار هورمون­های درون­زا (اکسین و سیتوکینین) است که با نتایج ما مطابقت دارد.

با وجود اینکه هر دو هورمون به­کار­رفته در این پژوهش (NAA و BAP) بر حجم، عرض و ارتفاع کالوس تاثیر قابل توجهی داشتند، غلظت متوسط هورمون BAP (دو میلی‌گرم در لیتر) توانست نقش مهمی در القاء کالوس از نظر صفات مورد اندازه­گیری ایفا کند. غلظت­های بالای هورمون BAP (سه و چهار میلی‌گرم در لیتر) به شدت اثر بازدارنده داشته و سبب کاهش رشد و تشکیل کالوس و در نهایت سبب افزایش مدت زمان القاء کالوس شدند (شکل 1). غلظت اکسین مورد استفاده در محیط کشت نیز عامل مهمی در القاء کالوس­زایی بود؛ بـه­طـوری­کـه کالوس تولید­شده در غلظت یک میلی­گرم بر لیتر NAA بیشتر از غلظت دو میلـی­گـرم بر لیتر NAA بود. در غلظت­های بین سه و چهار میلی‌گرم در لیتر BAP برای صفت حجم کالوس تفاوت معنی­داری مشاهده نشد. همچنین در غلظت‌های یک و دو میلی‌گرم NAA نیز تفاوت معنی­داری در حجم کالوس مشاهده نشد (شکل 1).
.Moafeghi et al (2008) نیز گزارش کردند غلظت­های بالای هورمون NAA سبب توقف رشد و تشکیل کالوس شد که با نتایج حاصل از پژوهش ما مطابقت دارد. حضور همزمان اکسین و سیتوکینین و ایجاد تعادل بین هورمون­های داخلی ریزنمونه­ها سبب افزایش تقسیم و تمایز سلولی ضروری شد. تقسیم سلولی نیز، موجب تشکیل کالوس و تمایز سلولی شد. تنوع در فراوانی تولید کالوس در پاسخ به سطوح مختلف هورمونی، می­تواند به دلیل تمایز در بیان ژن­های کنترل­کننده تولید کالوس (نظیر ARF7 و ARF19) باشد.

شکل 1. اثرات اصلی تیمارهای هورمونی بر طول، عرض، ارتفاع و حجم کالوس.

با­این­وجود، ممکن است که در بعضی از سطوح هورمونی مورد استفاده، برخی از ژن­های مسئول در سنتز کالوس، به­طور کامل بیان نشوند Mahmood et al., 2012)). نتایج حاصل از پژوهش Sarabadani et al. (2008) روی گیاه کما نشان داد که بهترین ریزنمونه برای القاء کالوس مربوط به ریشه و بهترین سطوح هورمونی مربوط به 2/1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 10 میلی‌گرم در لیتر NAA بود. با­توجه­به نتایج به­دست­آمده، اندام ریشه در غلظت هورمونی دو میلی‌گرم بر لیتر BAP و یک میلی‌گرم بر لیتر NAA بهترین محیط کشت بوده که برای مرحله دوم مطالعه انتخاب شد. در این مرحله از اکوتیپ­های مختلف در بررسی سرعت رشد کالوس استفاده شد. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی اکوتیپ بر صفات اندازه‌گیری­شده شامل طول و حجم کالوس در سطح احتمال یک درصد و ارتفاع کالوس در سطح احتمال پنج درصد معنی­دار بود؛ ولی برای عرض کالوس تفاوت معنی­داری مشاهده نشد. نتایج نشان داد که اکوتیپ کرمان نسبت به اکوتیپ یزد دارای حجم کالوس بیشتری بود که علت اصلی آن می­تواند تفاوت ژن‌های هسته­ای، ژن­های سیتوپلاسمی و برهمکنش­های ژنی و سطوح هورمونی درونی بین اکوتیپ­ها باشد. رفتار گیاهان در شرایط درون­شیشه‌ای نسبت به فرایندهایی همچون تشکیل کالوس و رشد و باززایی عمدتا اساس ژنتیکی داشته و سهم دیگر عوامل محیطی بسیار ناچیز است. نتایج تجزیه واریانس حجم، طول، عرض و ارتفاع کالوس­زایی برای انواع مختلف اکوتیپ و زمان یادداشت‌برداری در جدول 3 آمده است. اثرات اصلی زمان یادداشت‌برداری برای صفات ارتفاع، عرض و حجم کالوس در سطح یک درصد معنی‌دار بود ولی برای حجم کالوس تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. اثرات اصلی اکوتیپ برای صفات طول و حجم کالوس در سطح یک درصد و صفت ارتفاع کالوس در سطح پنج درصد معنی‌دار بود ولی برای عرض کالوس هیچ تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. اثر متقابل زمان یادداشت­برداری و اکوتیپ برای تمامی صفات مورد ارزیابی در سطح پنج درصد معنی‌دار بود. نتایج حاصل از مقایسه میانگین­ها برای طول کالوس اندازه­گیری­شده نشان داد که بیشترین آن­ها مربوط به اکوتیپ کرمان و هفته هشتم یادداشت‌برداری (برابر با 42/1 سانتی‌متر) و کمترین آن مربوط به اکوتیپ یزد و هفته هشتم یادداشت‌برداری (برابر با 1/1 سانتی­متر) بود (شکل 2 و 3). با­توجه­به اینکه محیط و نوع ریزنمونه مورد استفاده در هر دو اکوتیپ یکسان بود، عامل اصلی این تفاوت را می‌توان به هورمون­های داخلی و نحوه تعامل هر اکوتیپ با محیط نسبت داد. نتایج حاصل از تحقیق Hassani et al. (2008) نشان داد که 12 هفته بعد از کشت روی ریزنمونه­های هیپوکوتیل کالوس تشکیل شد که این کالوس­ها سخت، سفید و متمایل به سبز تا شفاف بودند. همچنین آنها بیان کردند که درصد القاء کالوس با اکوتیپ متفاوت بود که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابقت دارد. نتایج حاصل نشان داد که در هفته دوم، ششم و هشتم اندازه‌گیری صفات، اکوتیپ کرمان نسبت به اکوتیپ یزد در تمامی صفات مورد بررسی مقادیر بالاتری داشت (شکل 3). بیشترین تغییرات بین اکوتیپ­ها مربوط به صفت حجم کالوس بود؛ به­طوری­که در هفته هشتم اندازه­گیری، اکوتیپ کرمان نسبت به اکوتیپ یزد60 درصد حجم کالوس بیشتری داشت؛ اما در هفته چهارم اندازه‌گیری، برای صفات عرض، ارتفاع و حجم کالوس، اکوتیپ یزد مقادیر بالاتری نسبت به اکوتیپ کرمان داشت. به­ترتیب از بیشترین به کمترین مقادیر به­دست­آمده در صفات یاد­شده مربوط به هفته هشتم، ششم، دوم و چهارم بود (شکل 2 و 3).

شکل 2. سرعت رشد کالوس در طی چهار واکشت مختلف در اکوتیپ­های مختلف. کالوس­های تولید­شده در بازه­های زمانی مختلف. a تا d) در اکوتیپ یزد، e تا h) اکوتیپ کرمان، i و k) اکوتیپ اصفهان (با­توجه­به اینکه سرعت رشد کالوس اکوتیپ اصفهان به­شدت کم بود، از پژوهش حذف شد).

جدول 3. میانگین مربعات تجزیه واریانس اثر نوع اکوتیپ و زمان ‌بر صفات مورد ارزیابی در گیاه آنغوزه تلخ در شرایط درون­شیشه­ای.

^ns، ^*و ^** به­ترتیب غیر معنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

برخی از ژن­ها نقش‌های کلیدی را در طول القا و رشد کالوس ایفا می‌کنند که بسته به نوع رقم یا اکوتیپ میزان بیان آن­ها متفاوت است. از ژن­های مهم می­توان به خانواده فاکتورهای رونویسی LBD اشاره کرد که سبب فعال­شدن ژن­های مربوط به پاسخ اکسین (ARF7 و ARF19) می­شود. براساس مطالعاتی که توسط Zhang et al. (2022) انجام شد حدود 135 ژن مهم در القاء کالوس و 15 ژن مهم و موثر در رشد کالوس در گیاه اکالیپوس شناسایی شدند. در یک تحقیق از 18 اکوتیپ مورد استفاده در گیاه آرابیدپسیس تالیانا فقط سه اکوتیپ و از 43 اکوتیپ گیاه جو فقط در ریزنمونه­های یک اکوتیپ کالوس مشاهده شد
Soltani et al., 2019)).

شکل 3. اثرات متقابل اکوتیپ و زمان بر صفات طول، عرض، ارتفاع و حجم کالوس.

4. نتیجه‌گیری

براساس نتایج حاصل از اکوتیپ‌های مورد بررسی، اکوتیپ کرمان بیشترین و اکوتیپ اصفهان کمترین درصد جوانه‌زنی را نشان داد. بین ریزنمونه­های مختلف ریشه، برگ و ساقه، ریزنمونه ریشه نسبت به سایر ریزنمونه­ها کالوس بهتری تولید کرد. همچنین در بین غلظت­های هورمونی مورد بررسی، بیشترین طول، عرض، ارتفاع و حجم کالوس مربوط به غلظت هورمونی دو میلی­گرم بر لیتر BAP و یک میلی­گرم بر لیتر NAA بود. ریزنمونه‌های برگ و ساقه بعد از تشکیل کالوس نکروزه و از بین رفتند. در غلظت­های بالای هورمون BAP سرعت رشد کالوس به شدت کاهش یافت. در بین اکوتیپ­های مورد پژوهش اکوتیپ کرمان نسبت به یزد دارای سرعت رشد بیشتری بود. همچنین بیشترین صفات مورد بررسی در هفته هشتم و کمترین آن­ها در هفته چهارم به دست آمد.

5. منابع

1. Ahmed, A.A., Hegazy, M.E.F., Zellagui, A., Rhouati, S., Mohamed, T.A., Sayed, A., & Hirata, T. (2007). Ferulsinaic acid, a sesquiterpene coumarin with a rare carbon skeleton from FerulaPhytochemistry, 68(5), 680-686.
2. Gupta, V. (2003). Seed germination and dormancy breaking techniques for indigenous medicinal and aromatic plants. Journal of Medicinal and Aromatic Plants Science, 25, 402-407.
3. Hadi, N., Omideygi, R., & Amini, A. (2011). In vitro conservation of Ferula Gummosa germplasm and its callus induction.Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 19(1), 28-38. (In Persian)
4. Han, Y., Jin, X.L., Wu, F.B., & Zhang, G.P. (2011). Genotypic differences in callus induction and plant regeneration from mature embryos of barley (Hordeum vulgare). Journal of Zhejiang University Science, 12(5), 399-407.
5. Hasani, B., Saboura, A., Rajabian, T., & Falah, H.H. (2008). Somatic embryogenesis of Ferula assa-foetida.‏ Journal of Science, 33(4), 15-23
6. He, S.S., Liu, C.Z., & Saxena, P.K. (2007). Plant regeneration of an endangered medicinal plant Hydrastis canadensisScientia Horticulturae,113(1), 82-86.
7. Kumar, A., Kumar, R., Singh, S., Sharma, S., Singh, S., & Kumar, S. (2020). Evaluation of Ferula Assa-Foetida accessions for germination parameters under cold stratification to overcome seed dormancy and effect of media mixtures on seedling growth. Journal of Science, 2(22), 150-162.
8. Li, H., Li, X., Wang, G., Zhang, J., & Wang, G. (2022). Analysis of gene expression in early seed germination of rice: landscape and genetic regulation. BMC Plant Biology, 22(1), 1-14.
9. Martin, K.P. (2003). Rapid axillary bud proliferation and ex vitro rooting of Eupatorium triplinerve. Biologia Plantarum, 47(4), 589-591.
10. Movafeghi, A., Habibi, G., & Ali, A.M. (2008). Plant regeneration of Capparis Spinosa using hypocotyl explants.‏ Iranian Journal of Biology, 21(2), 289-297. ‏(In Persian)
11. Otroshi, M., & Ghehsareh, N.M. (2013). The effect of plant growth regulators and different type of explants on organogenesis of pepper (Capsicum annuum) in vitro. Technical Journal of Engineering and Applied Sciences, 3(3), 271-278.
12. Radjabian, T., Saboora, A., Hhasani, B., & Fallah-Hosseini, H. (2007). Effects of GA3 and chilling on seed germination of Ferula assa-foetida, as a medicinal plant. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic PlantsFall, 23(37), 391-404. ‏(In Persian)
13. Salehi, M., Naghavi, M.R., & Bahmankar, M. (2019). A review of Ferula species: Biochemical characteristics, pharmaceutical and industrial applications, and suggestions for biotechnologists.Industrial Crops and Products, 139, 111-115‏
14. Sarabadani, R., Omidi, M., & Bihamta, M. (2008). Evaluation of in vitro embryo culture and the effect of medium culture, hormone levels and explant types on callus induction and shoot organogenesis of Ferula gummosaJournal of Medicinal Plants, 7(27), 71-81. ‏(In Persian)
15. Soltani, S., Amin, G.R., Salehi-Sourmaghi, M.H., Schneider, B., Lorenz, S., & Iranshahi, M. (2018). Sulfur-containing compounds from the roots of Ferula latisecta and their cytotoxic activities.Fitoterapia, 124, 108-112.
16. Tieu, A., Dixon, K.W., Meney, K.A., & Sivasithamparam, K. (2001). The interaction of heat and smoke in the release of seed dormancy in seven species from southwestern Western Australia. Annals of Botany, 88(2), 259-265.
17. Traore, A, Guiltinan, M.J. (2006). Effects of carbon source and explant type on somatic embryogenesis of four cacao genotypes. HortScience, 41, 753-758.
18. Tripathi, L., & Tripathi, J.N. (2003). Role of biotechnology in medicinal plants. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2, 243-253.
19. Yaqoob, U., & Nawchoo, I.A. (2017). Conservation and cultivation of Ferula jaeschkeana Vatke: A species with deep complex morphophysiological dormancy. Biological Sciences, 87(2), 315-325.
20. Zare, A.R., Solouki, M., Omidi, M., Irvani, N., Abasabadi, A.O., & Nezad, N.M. (2011). Effect of various treatments on seed germination and dormancy breaking in Ferula assa-foetida(Asafetida), a threatened medicinal herb. Trakia Journal of Sciences, 9(2), 57-61.
21. Zare, A.R., Solouki, M., Omidi, M., Irvani, N., Nezad, N.M., & Rezazadeh, S. (2010). Callus induction and plant regeneration in Ferula assa-foetida(Asafetida), an endangered medicinal plant. Trakia Journal of Sciences, 8(1), 11-18.
22. Zhang, Y., Li, J., Li, C., Chen, S., Tang, Q., Xiao, Y., ..., & Chen, B. (2022). Gene expression programs during callus development in tissue culture of two EucalyptusBMC Plant Biology, 22(1), 1-18.
23. Zhou, Y., Xin, F., Zhang, G., Qu, H., Yang, D., & Han, X. (2017). Recent advances on bioactive constituents in Ferula. Drug Development Research, 78(7), 321-331.