انتخاب بهترین محیط باززایی و بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی ریزنمونه‌های تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens در گیاه گوجه‌فرنگی(Solanum lycopersicum)

مقدمه

گوجه‌فرنگی، با نام علمی Solanum lycopersicum متعلق به خانواده سولاناسه می‌باشد. گوجه‌فرنگی گیاهی است دیپلوئید که با 95 % خودگشنی جزو گیاهان خودگشن محسوب می‌شود (Shankara, 2005) این گیاه، یکی از مهم‌ترین سبزیجات در سراسر دنیا محسوب شده و امروزه عواملی مانند بازار وسیع مصرف داخلی و امکان صادرات به کشورهای همسایه، سبب توجه بیشتر به این محصول و افزایش سطح زیر کشت آن در مناطق مختلف کشورمان شده است (Mohseni fard et al., 2009). علاوه بر این، گوجه‌فرنگی به خاطر داشتن خصوصیات بیولوژی مانند داشتن ژنوم نسبتاً کوچک (Mb950) و انتقال ژن راحت، به میزان زیادی به عنوان یک گیاه مدل برای مطالعات ژنتیکی، پاتولوژی و فیزیولوژی مورد استفاده قرار می‌گیرد (Cruz-Mendı vil, 2011). کشت بافت، یک ابزار مهم در بیوتکنولوژی به شمار می‌رود و به عنوان یک پیش نیاز اصلی در فرآیند انتقال ژن به گیاه مطرح می‌شود. در گیاه گوجه ‌فرنگی، مهم‌ترین عامل محدود کننده انتفال ژن، به دست آوردن یک دستورالعمل کشت بافت مطلوب با میزان نرخ باززایی بالا می‌باشد (Jamous & Abu-qaoud, 2015) بنابراین کشت بافت گیاه گوجه‌فرنگی به دلیل ارزش تجـاری ایـن محصول و اهمیت اصلاح آن از طریق دستکاری ژنتیکی، لازم و ضروری است (Piri et al., 2011). مطالعات مختلف نشان می‌دهد که سه عامل نوع و غلظت هورمون‌های تنظیم‌کننده رشد، نوع ریزنمونه و نوع ژنوتیپ، بیشترین تأثیر را در باززایی گیاه گوجه‌فرنگی دارند et al., 2010) Nasher Mohamed ; Gerszberg et al., 2015).

در مطالعه‌ای که در سال2010 توسط ناشر محمد و همکاران صورت گرفت، تأثیر دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل و همچنین غلظت‌های مختلف هورمون BAP، بر روی میزان باززایی دو رقم Pearl و Beril گوجه‌فرنگی، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تحقیقات نشان داد که هورمون BAP با غلظت چهار میلی‌گرم در لیتر در هر دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل، موجب کالوس‌زایی شد اما میزان کالوس‌زایی در هیپوکوتیل نسبت به کوتیلدون بیشتر بود. همچنین غلظت دو میلی‌گرم در لیتر هورمون BAP موجب ساقه‌زایی در هر دو ریزنمونه شد. میزان ساقه‌زایی در دو نوع ریزنمونه با هم تفاوت معناداری نداشت اما این میزان در دو رقم با هم متفاوت بود. در این مطالعه استفاده از غلظت-های مختلف هورمون BAP به عنوان سیتوکینن سبب القای ساقه‌زایی و کالوس‌زایی گردید)  (Mohamed Nasher et al., 2010.

آشاکاریان و همکاران در سال 2011، تأثیر غلظت‌های مختلف هورمون‌های  BAP، TDZ و کینتین به عنوان سیتوکینن و غلظت‌های مختلف هورمون IAA به عنوان اکسین را بر روی میزان باززایی دو رقم Shalimar و MHTM و دو ریزنمونه کوتیلدون و برگ، مورد بررسی قرار دادند. نتایج تحقیقات آن‌ها نشان داد که بیشترین میزان ساقه‌زایی در رقم MHTM، با استفاده از هورمون TDZ با غلظت 74/0 میلی‌گرم در لیتر و بدون حضور هورمون اکسین اتفاق افتاد. بین این دو محیط اختلاف معناداری دیده نشد. میزان باززایی در دو ریزنمونه کوتیلدون و برگ نیز اختلاف معناداری با هم نداشت. در مورد رقم Shalimar نیز همین نتایج به دست آمد. اما میزان باززایی آن نسبت به رقم MHTM کمتر بود(Ashakiran et al., 2011).

در مطالعه‌ی دیگری که بر روی چهار رقم گوجه‌فرنگی به نام‌هایRio، Grande، Moneymaker و Roma انجام شد، میزان کالوس‌زایی و میزان ساقه‌زایی در دو ریزنمونه هیپوکوتیل و برگ مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه، تأثیر هورمون‌های رشد شامل IAA، NAA و توفوردی به عنوان اکسین و زاتین، کینتین و BAP نیز به عنوان سیتوکینن در غلظت‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد میزان کالوس‌زایی در ریزنمونه هیپوکوتیل و میزان ساقه-زایی در ریزنمونه برگ بیشتر اتفاق افتاد. بیشترین میزان تولید کالوس در رقم Rio، سپس به ترتیب در ارقام Roma و Moneymaker با محیط کشت MS پایه به علاوه دو میلی‌گرم در لیتر IAA و 5/2 میلی‌گرم در لیتر BAP، به دست آمد. بیشترین میزان ساقه‌زایی نیز در دو رقم Rio و Roman به دست آمد. بهترین محیط ساقه‌زایی شامل MS پایه به علاوه 1/0 میلی‌گرم در لیتر IAA، یک میلی‌گرم در لیتر زاتین و دو میلی‌گرم در لیتر BAP بود. در مورد رقم Moneymaker بیشترین میزان ساقه‌زایی در محیط MS پایه حاوی 1/0 میلی‌گرم در لیتر IAA و سه میلی‌گرم در لیتر  BAP اتفاق افتاد (Shah et al., 2015).

نظر به اینکه ژنوتیپ‌های متفاوت در باززایی عکس‌العمل متفاوتی نشان می‌دهند، در این مطالعه به منظور بهینه نمودن شرایط کشت بافت سه رقم نیوتون، دافینس و این‌فینیتی گیاه گوجه‌فرنگی، تأثیر محیط کشت‌های مختلف حاوی تنظیم کننده‌های رشد متفاوت و دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل مورد بررسی قرار گرفتند.

همان‌طور که اشاره شد یکی از کاربردهای مهم کشت بافت، انتقال ژن می‌باشد. انتقال ژن با استفاده از Agrobacterium tumefaciens در گوجه‌فرنگی برای اولین بار توسط(1986)  Mccormick گزارش شد. از آن زمان تاکنون گزارشات متعددی در مورد انتقال ژن برای اهداف مختلفی مانند افزایش عملکرد، مقاومت به آفات و بیماری‌ها، مقاومت به علف‌کش‌ها، افزایش کیفیت میوه و غیره ارائه شده است
 (Sharma et al., 2009).در انتقال ژن با استفاده از Agrobacterium tumefaciens، یکی از موانعی که موجب کاهش کارایی انتقال ژن می‌شود، پاسخ دفاعی گیاه می-باشد که موجب انفجارهای اکسیداتیوی و در نتیجه قهوه‌ای شدن و مرگ سلول‌ها می‌شود (Kuta, 2005 & Tripathi). سیگنال‌دهی یون کلسیم یکی از وقایع اولیه و البته مهم‌ترین واقعه در ایجاد پاسخ دفاعی گیاه در مقابل پاتوژن‌هاست. مشخص شده است که شروع پاسخ دفاعی گیاه بستگی به انتقال یون‌های کلسیم از آپوپلاست به سیتوسول دارد. پس از ایجاد مسیر سیگنال‌دهی کلسیم، تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS)، تجمع فیتوهورمون‌هایی مانند آبسیزیک اسید (ABA)، سالیسیلیک اسید (SA) و اتیلن (ET) موجب شکل‌گیری پاسخ دفاعی برنامه‌ریزی شده‌ای در مقابل تنش‌های زنده و غیر زنده خواهد شد. گیاه در مقابل Agrobacterium tumefaciens نیز به عنوان یک پاتوژن عکس-العمل نشان می‌دهد که این موضوع منجر به کاهش باززایی و کاهش راندمان تحویل ژن به درون ژنوم گیاه می‌شود. .(Lecourieux et al., 2006; Rejeba et al., 2014) بنابراین، به نظر می‌رسد که هنگام تلقیح ریزنمونه‌ها با Agrobacterium tumefaciens، بسته ماندن کانال‌های کلسیمی به صورت موقت می‌تواند سبب کاهش و یا تأخیر در شروع پاسخ دفاعی گیاه و در نتیجه کاهش میزان قهوه‌ای شدن بافت و مرگ سلول‌ها شود.

وراپامیل جزء داروهای بلوکه‌کننده کانال‌های کلسیمی در انسان می‌باشد. در پزشکی از این دارو برای بسته نگه داشتن موقت کانال‌های کلسیمی به منظور درمان انواع بیماری‌های عصبی استفاده می‌شود. در بدن انسان پنج نوع کانال کلسیمی به نام‌های L، N، P/Q، R و T وجود دارد و مشخص شده است که بلوکه‌کننده کانال‌های کلسیمی  مانند وراپامیل که بر روی کانال‌های L در بدن انسان تأثیر می‌گذارند، قادر خواهند بود که بر روی کانال‌های کلسیمی در گیاهان نیز تأثیر بگذارند
(.(Pasko & Flynn, 2000; Ram & Elliott, 2011

 این مطالعه، با فرض اینکه با بسته نگه داشتن کانال‌های کلسیمی به صورت موقت با استفاده از وراپامیل و در نتیجه تأخیر در ورود یون‌های کلسیم به سیتوسول می‌تواند سبب کاهش پاسخ دفاعی گیاه در مقابل Agrobacterium tumefaciens گردد، به انجام رسید.

مواد و روش‌ها

باززایی

در این مطالعه، از سه رقم مختلف گوجه‌فرنگی به نام‌های نیوتون، دافینس و این‌فینیتی استفاده شد. بذرهای رقم‌های انتخاب شده ابتدا در محلول یک درصد هیپوکلریت سدیم به مدت 10 دقیقه ضد عفونی شدند، سپس با استفاده از آب مقطر اتوکلاو شده دو بار و هر بار به مدت 10 دقیقه به خوبی شسته شدند. بذور ضد عفونی شده پس از خشک شدن با استفاده از کاغذ صافی، بر روی محیط کشت0.5X MS  (Murashige & Skoog, 1962) کشت شدند. محیط مورد استفاده علاوه بر MS، حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و سه گرم در لیتر ژل رایت نیز بود. سپس شیشه‌های حاوی بذور کشت شده به مدت پنج روز در تاریکی و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند، و پس از آن در نور فلورسنت با شدت 60 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه با دوره فتوپریود 16/8 (به ترتیب روشنایی/تاریکی)، قرار گرفتند. در ادامه کوتیلدون‌های 11-8 روزه و هیپوکوتیل‌های 16-14 روزه، برای این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند

 (Dan et al., 2006; Sharma et al., 2009; Ajenifujah-Solebo et al., 2012; Durosomo et al., 2014; Popoola et al., 2015).

به منظور انجام باززایی، از محیط کشت پایه MS به همراه 30 گرم در لیتر ساکارز و سه گرم در لیتر ژل رایت استفاده شده و pH محیط بر روی 8/5 تنظیم شد. همچنین، به منظور به دست آوردن دستورالعمل مناسب جهت باززا نمودن ارقام مورد استفاده، تأثیر 13 ترکیب هورمونی‌ مختلف به همراه دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 1). پس از گذشت چهار هفته، میانگین تولید ساقه برای هر ریزنمونه محاسبه شد، و بر اساس آن محاسبات آماری جهت تعیین بهترین محیط کشت و بهترین ریزنمونه انجام شد. این مطالعه در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و در هر پتری تعداد شش ریزنمونه انجام شد. نتایج به دست آمده با استفاده از نرم‌افزار9.4  SAS و با استفاده از آزمون مقایسه میانگین دانکن آنالیز گردید.

جدول 1- نسبت تنظیم کننده­های رشد مورد استفاده جهت باززایی ارقام گوجه­فرنگی

Table 1- The ratio of growth regulators used to regenerate tomato cultivars

بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه

مواد گیاهی و باکتری

در این مطالعه، به منظور بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه، تلقیح ریز نمونه­ها با باکتری Agrobacterium tumefaciens سویهLBA4404 ، حاوی پلاسمید pBI121 (کلون تک) انجام شد. این پلاسمید حامل ژن گزارشگر گیاهی بتاگلوکورونیداز (gus) uidA و نشانگر انتخابی نئومایسین فسفوترانسفراز (nptII)، رمزکننده مقاومت به کانامایسین می­باشد. بر اساس نتایج حاصل از باززایی، برای انجام این مطالعه از رقم دافینس و ریزنمونه کوتیلدون استفاده شد.

تلقیح ریزنمونه­ها

به منظور تلقیح ریزنمونه­ها، از دستورالعمل   Dan et al.(2006) با کمی تغییرات استفاده شد. برای تهیه محیط تلقیح ابتدا یک کلونی از باکتری Agrobacterium tumefaciens کشت شده در محیط کشت جامد را در پنج میلی­لیتر محیط  LB[1]مایع (Miller, 1972) ریخته و درون انکوباتور 28 درجه سانتی­گراد با دور 200 دور در دقیقه قرار دادیم. محیط LB مایع حاوی 50 میلی­گرم در لیتر از هریک از آنتی­بیوتیک­های کانامایسین و ریفامپسین نیز بود. نظر به اینکه ژن مقاومت به آنتی­بیوتیک ریفامپسین در ژنوم سویه LBA4404 وجود دارد، به منظور جلوگیری از رشد سایر باکتری­ها و در نتیجه کنترل آلودگی از آن در محیط کشت استفاده ­شد. پس از گذشت 22-18 ساعت، دو میلی­لیتر از سوسپانیسون باکتری برداشته شد و در یک فالکون جدید که حاوی 30 میلی­لیتر محیطLB  مایع و50 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک ریفامپسین بود، ریخته شد و به مدت چهار ساعت مجدداً در انکوباتور 28 درجه سانتی­گراد و 200 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از آن محیط تلقیح به مدت 10 دقیقه با 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل در 10 میلی­لیتر MS مایع که حاوی 100 میکرومولار استوسرینگون بود حل شد و در انکوباتور 28 درجه با دور 200 دور در دقیقه قرار گرفت. زمانی که [2]OD باکتری به 5/0-3/0رسید برای تلقیح ریزنمونه­ها مورد استفاده قرار گرفت. کوتیلدون­ها پس از این که خراش خوردند به مدت سه تا پنج دقیقه در سوسپانسیون تلقیح غوطه­ور شدند، سپس با استفاده از کاغذ صافی خشک و بر روی محیط هم­کشتی (جدول 2) قرار گرفتند. محیط­های هم­کشتی به مدت دو شب در تاریکی و در فیتوترون با دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. کوتیلدون­ها پس از خشک شدن با کاغذ صافی از محیط هم­کشتی به محیط انتخابی (جدول 2) منتقل شدند. نمونه­های باززا شده پس از 38 روز به محیط ساقه­زایی (جدول 2) منتقل شدند و پس از دو هفته گیاهچه­های رشد کرده به محیط ریشه­زایی (جدول 2) انتقال یافتند. شرایط اتاق کشت برای محیط­های باززایی، ساقه­زایی و ریشه­زایی داری شرایط فتوپرویود 16/8 (به ترتیب روشنایی/ تاریکی) و نور فلورسنت با شدت 60 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه بود.

جدول 2- ترکیب محیط کشت­های مختلف با محیط پایه MS در طی انتقال ژن با Agrobacterium tumefaciens

Table 2- Compound of different media based on MS medium used in Agrobacterium mediate   transformation

مطالعات هیستوشیمیایی

به منظور بررسی انتقال و بیان ژن gus، از مطالعات هیستوشیمیایی استفاده شد (Jefferson, 1987). در این روش برگ نمونۀ ترانسفورم شده در یک ویال قرار داده شد، سپس محلول X-Gluc به نحوی به هر نمونه اضافه شد که کل نمونه در محلول قرار گرفت و نمونه­ی مورد نظر به مدت 15-10 ساعت در انکوباتور 37 درجه در تاریکی، نگهداری شد. پس از آن محلول X-Gluc خارج شده و روی نمونه الکل 99% (اتانول) ریخته شد. پس از این که نمونه کلروفیل خود را از دست داد عکس­برداری انجام گرفت.

به منظور بررسی تأثیر ترکیب دارویی وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه در مرحله هم­کشتی از این ماده در چهار غلظت0-50-100 و 150 میلی­گرم در لیتر به عنوان تیمار با هشت ریزنمونه در هر پتری دیش با سه تکرار انجام شد. ترکیب این دارو شامل 5/2 میلی­گرم در لیتر وراپامیل و 5/8 میلی­گرم در لیتر NaCl می­باشد که در آب حل، و pH آن بین چهار تا شش تنظیم می­شود. در این مطالعه نیز از همین ترکیب استفاده شد. از هر تیمار، دو کالوس تصادفی به منظور بررسی میزان قهوه­ای شدن و سوختگی ریزنمونه­ها انتخاب شد. میانگین باززایی با تقسیم تعداد ریزنمونه­های باززاشده بر تعداد کل ریزنمونه­ها محاسبه گردید. این آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام و نتایج به دست آمده با استفاده از نرم­افزار9.4   SAS آنالیز گردید. از تلقیح ریزنمونه­ها با Agrobacterium tumefacien فاقد پلاسمید نیز به عنوان شاهد استفاده شد.

 نتایج و بحث

باززایی

در این مطالعه مشخص شد که ریزنمونه کوتیلدون در مورد دو رقم دافینس و نیوتون، و ریزنمونه هیپوکوتیل در مورد رقم این­فینیتی، در زمینه باززایی بهتر عمل می­کند (جدول 5). در مورد دو رقم نیوتون و دافینس، محیط کشت حاوی نسبت هورمونی 68/0 TDZ= و 1/0NAA= میلی­گرم در لیتر با میانگین تولید 9/11 و شش ساقه در هر ریزنمونه به ترتیب برای ارقام دافینس و نیوتون، بهترین ترکیب هورمونی در باززایی می­باشد. در مورد رقم نیوتون علاوه بر محیط فوق، محیط 2BAP= و 1/0IAA= میلی­گرم در لیتر نیز بهترین محیط کشت در باززایی به شمار می­رود. بین این دو نوع محیط برای رقم نیوتون تفاوت معناداری دیده نشد (جدول 4). نوع و نسبت ترکیب هورمونی مورد استفاده در محیط کشت مهم­ترین عامل تأثیرگذار در میزان باززایی می­باشد (Pawar et al., 2012). در طی دهه­های گذشته، هورمون­های متعددی به منظور افزایش باززایی سلول­های گیاهی به صورت مصنوعی ساخته شده است. TDZ، به خاطر داشتن نقش مؤثر در کشت بافت و کشت سلول­های گیاهی، در طی چند دهه گذشته بسیار مورد توجه قرار گرفته است. اگرچه این هورمون جزو سیتوکین­ها طبقه­بندی می­شود، اما مشخص شده است که اکسین­ها نیز تأثیرات مشابه در سلول ایجاد می­کنند. نکته جالب در مورد این هورمون این است که ساختار شیمیایی آن شبیه به هیچ یک از هورمون­های اکسین و سیتوکینن که تاکنون مورد استفاده قرار گرفته­اند، نمی­باشد (Guo et al., 2011). در این مطالعه، ترکیب این هورمون با اکسین نفتالین استیک اسید، تأثیر مطلوبی در باززایی دو رقم نیوتون و دافینس گیاه گوجه­فرنگی داشت.& Abu-qaoud  Jamous  (2015) از این ترکیب هورمونی با غلظت­های به ترتیب چهار میکرومولار و 5/0 میلی­گرم در لیتر به ترتیب برای TDZ و نفتالین استیک اسید، به طور موفقیت­آمیزی جهت باززایی گیاه گوجه­فرنگی استفاده نمودند. در مورد هورمون نفتالین استیک اسید نیز باید به این نکته اشاره نمود که این هورمون نیز یک اکسین مصنوعی می­باشد و یکی از پرکاربردترین اکسین­ها در کشت بافت گیاهی به شمار می­رود (Guo et al., 2011). اما در مورد رقم این­فینیتی، نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین محیط کشت­های مختلف از جمله محیط کشت حاوی هورمون­های 2= Zeatin و 1/0IAA=   میلی­گرم در لیتر اختلاف معنی­داری وجود نداشت. میزان باززایی رقم این­فینیتی در مقایسه با دو رقم دافینس و نیوتون کم­تر بود، به گونه­ای که میانگین تولید ساقه برای این رقم در محیط مذکور سه ساقه در هر ریزنمونه برآورد گردید (جدول 4). بهترین ریزنمونه جهت باززایی برای ارقام دافینس و نیوتون کوتیلدون و برای رقم این فینیتی هیپوکوتیل می­باشد (جدول 5). در گزارشات متعددی نیز به این موضوع اشاره شده است که میزان و شرایط باززایی برای ارقام مختلف گوجه­فرنگی متفاوت بوده، و تاکنون یک دستورالعمل یکسان برای تمام ارقام مختلف گوجه­فرنگی ارائه نشده است (Jedi et al., 2004). بدین ترتیب، بهترین رقم از لحاظ باززایی رقم دافینس بوده و پس از آن رقم نیوتون و رتبه بعدی متعلق به رقم این­فینیتی می­باشد (جدول 6). مدت زمان ایجاد ساقه در هر سه رقم، چهار هفته، و مدت زمان طویل شدن ساقه­ها نیز به مدت سه هفته به طول انجامید. در نهایت گیاهچه­های ایجاد شده از محل اتصال به کالوس جدا شده و در محیط ریشه­زایی قرار گرفتند. محیط ریشه­زایی MS کامل بود.

مدت زمان ریشه­زایی نیز دو هفته طول کشید (شکل 1).

شکل 1- مراحل مختلف رشد گیاه گوجه­فرنگی الف: رقم دافینس بر روی محیط MS پایه با ترکیب هورمونی 68/0TDZ=، 1/0NAA= میلی­گرم در لیتر ب: رقم نیوتون بر روی محیط MS پایه با ترکیب هورمونی 68/0 TDZ= 1/0NAA= میلی­گرم در لیتر  ج: گوجه­فرنگی باززا شده پس از جدا شدن از کالوس در محیط ریشه­زایی قرار گرفت. د: محیط ریشه­زایی

Figure 1- Different stages of growth of tomato plant A: Regeneration of The Dafines cultivar on MS medium with combination hormone TDZ=0.6, NAA==0.1 mg/Lit. B: Regeneration of The Newton cultivar on MS medium with combination hormone TDZ=0.6, NAA==0.1 mg/Lit. C: Regenerated tomato isolated from callus and placed in rooting medium. D: Rooting medium

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس میزان باززایی برای ارقام، هورمون­­ها و ریزنمونه­های مختلف مورد مطالعه در گیاه گوجه فرنگی

Table 3- the results of analysis of variance for regeneration rate for different cultivars, hormones and microelements studied in the tomato plant

** معنی­داری در سطح 1% (p<0.01)

T1:ریزنمونه٬ T2:هورمون٬ V: رقم

• T1: Explant, T2: Hormon, V: cultivar

جدول 2- مقایسه میانگین باززایی (تعداد ساقه­ها تقسیم بر تعداد ریزنمونه در هر پتری دیش) ارقام مختلف گوجه­فرنگی برای محیط کشت­های مختلف

Table 4 - Comparison of mean regeneration (The number of stems divided by the number of explant per petridish) of different tomato varieties for different culture media

*عددهای 1تا 13 نوع محیط کشت­های مختلف است که دز جدول 1 جزئیات هورمونی هر محیط کشت نشان داده شده است.

حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنی­دار میانگین­ها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.

* The numbers range of 1 to 13 are different types of culture mediums that in Table 1 shows the hormonal

details of each culture medium.

Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the

Duncan test.

جدول 3- مقایسه میانگین باززایی ارقام مختلف برای ریزنمونه­های کوتیلدون و هیپوکوتیل

Table 5- Comparison of mean regeneration of different cultivars for cotyledon and hypocotyl explants

حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنی­دار میانگین­ها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.

Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the Duncan test .

جدول 4- مقایسه میانگین میزان باززایی برای ارقام این­فینیتی، نیوتون و دافینس

Table 6- Comparison of mean total regeneration for Infinity, Newton and Dafines

حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنی­دار میانگین­ها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.

Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the Duncan test .

بر اساس نتایج به دست آمده از باززایی، به منظور بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه از رقم دافینس، از ریزنمونه کوتیلدون و محیط کشت حاوی هورمون­های TDZ و NAA با غلظت­های به ترتیب 68/0 و 1/0 میلی­گرم در لیتر استفاده شد.

تأثیر وراپامیل بر روی ریزنمونه­های تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens

بررسی میزان قهوه­ای شدن کالوس­ها

میزان سوختگی و قهوه­ای شدن کالوس­هایی که در محیط­های حاوی وراپامیل رشد کرده بودند نسبت به کالوس­های شاهد یعنی کالوس­هایی که در محیط­های فاقد وراپامیل رشد کرده بودند، به طور محسوسی کمتر بود (شکل 2). ورود Agrobacterium به سلول گیاهی به علت تجمع H₂O_2، موجب مرگ سلول و در نتیجه کاهش نرخ انتقال ژن خواهد شد. قهوه­ای شدن بافت و مرگ سلول در اثر ورود  Agrobacterium tumefaciensبه گیاه، در بسیاری از گیاهان مثل سویا، گوجه­فرنگی، آفتابگردان، انگور، چغندرقند و غیره گزارش شده است.  Hansen (2000) نشان داده است که در ذرت پس از تلقیح با Agrobacterium tumefaciens، مرگ برنامه­ریزی شده سلول، به علت تکه تکه شدن DNA اتفاق افتاده است.et al.(2002) Parrott نشان دادند که پس از تماس جنین و ریشه گندم با Agrobacterium tumefaciens مرگ سلول همزمان با تجمع  H₂O₂در سلول اتفاق می­افتد (Dan et al., 2016).

همان­طور که قبلاً اشاره شد، وراپامیل با تأثیر بر روی کانال­های L در انسان برای درمان بیماری­های عصبی مورد استفاده قرار می­گیرد. کانال­های کلسیمی نوع L کانال­های نسبتاً بزرگی هستند که دارای فعالیت ولتاژ بالایی نیز می­باشند. این کانال­ها دارای وزن مولکولی 400 کیلودالتون با پنج زیرواحد 1α، 2α، ẞ، γ و δ هستند. این نوع از کانال­های کلسیمی از طریق مسیرهای فسفریله کننده پروتئین CAMP فعال می­شوند و به وسیله بلوکه­کننده­های کلسیمی هم سریع غیر فعال می­شوند (Pasko & Flynn, 2001; Ram & Elliott, 2011). در این مطالعه برای اولین بار مشخص شد که با استفاده از بلوکه­کننده کانال­های کلسیمی-وراپامیل-می­توان با کاهش پاسخ دفاعی گیاه میزان قهوه­ای شدن و مرگ برنامه­ریزی شده سلول­ها را کاهش داد. تجمع H₂O₂ که به دنبال پاسخ دفاعی گیاه اتفاق می­افتد نقش کلیدی را در مرگ برنامه­ریزی شده سلول بازی می­کند (Dan et al., 2016). از این روet al.(2014)  Dan  برای اولین بار تأثیر ماده­ای به نام ملاتونین و 17 ترکیب دیگر شامل پنج آنتی­اکسیدان و 12 غیرآنتی­اکسیدان را بر روی افزایش میزان کارایی انتقال ژن با استفاده از Agrobacterium tumefaciens بر روی گوجه­فرنگی و سویا، مورد بررسی قرار دادند. نتایج مطالعات آنها نشان داد که ملاتونین زمانی که به محیط انتخابی اضافه می­شود، بیش از سایر ترکیبات میزان انتقال ژن را افزایش می­دهد. آنها بیان نمودند که ملاتونین با خاصیت آنتی­اکسیدانی که دارد، از ایجاد پاسخ دفاعی گیاه و قهوه­ای شدن ناشی از آن جلوگیری می­کند و بدین ترتیب میزان باززایی پس از انتقال ژن را افزایش می­دهد. ملاتونین یک هورمون انسانی است که توسط مغز ترشح می­شود و در طیف وسیعی از فعالیت­های بیولوژیکی مانند فعایت­های عصبی، سیستم ایمنی بدن، فعالیت قلب، سیستم تناسلی و غیره ایفای نقش می­کند. مشخص شده است که ملاتونین بیشتر فعالیت­های خود را از طریق خاصیت آنتی­اکسیدانی ایفا می­کند (Munik & Ekmekcioglu, 2015). Levine et al. (1995) نیز نشان دادند که تجمع H₂O₂، به دنبال سیگنال­دهی یون کلسیم اتفاق می­افتد. بنابراین به نظر می­رسد وراپامیل این قابلیت را دارد که یک گام جلوتر از ملاتونین حرکت کند و با به تعویق انداختن سیگنال­دهی یون کلسیم، افزایش میزان H₂O₂ و مرگ برنامه­ریزی شده سلول را کاهش دهد.

شکل 1- مقایسه بین کالوس­ها در محیط با و بدون وراپامیل؛: سمت راست :کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های گوجه­فرنگی تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens رشد کرده در محیط دارای وراپامیل، سمت چپ: کالوس­های حاصل از ریزنمونه­های گوجه­فرنگی تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens رشد کرده در محیط فاقد وراپامیل

Figure 2- Comparison between calluses in mediums contaioning and free verapamil. Right: The calluses derived from inoculated tomato explants with Agrobacterium tumefaciens that grows in medium containing verapamil and Left: The calluses derived from inoculated tomato explants with Agrobacterium tumefaciens that grows in medium free verapamil.

باززایی

در جدول (7)، مقایسه میانگین باززایی نمونه­های رشد کرده بر روی غلظت­های مختلف وراپامیل نشان داده شده است. میزان باززایی به علت تنش ناشی از تلقیح ریزنمونه­ها با Agrobacterium tumefaciens، در مقایسه با حالت کشت بافت به شدت کاهش یافته است. زمانی که از محیط هم­کشتی دارای 50 میلی­گرم در لیتر وراپامیل استفاده شد، نرخ باززایی نسبت به شاهد و سایر غلظت­های وراپامیل بیشتر بود. کاهش پاسخ دفاعی گیاه به واسطه وجود وراپامیل سبب افزایش نرخ باززایی شده است. یون­های کلسیم به عنوان پیغام­رسان ثانویه در بسیاری از مسیرهای سیگنال­دهی در گیاهان و همین­طور در جانوران فعالیت می­کنند و سبب ایجاد پاسخ­های فیزیولوژی مناسب گیاه به دامنه وسیعی از محرک­های محیطی می­شوند. تغییرات غلظت کلسیم در پاسخ به محرک­های مختلفی شامل هورمون­ها، نور، تنش­های غیرزنده و الیستورهای میکروبی، می­تواند اتفاق افتد. در حالت عادی میزان غلظت کلسیم در سیتوسول 100 تا 200 نانومولار، یعنی 10⁴ بار کمتر از آپوپلاست و 10⁴ تا 10⁵ بار کمتر از اندامک­های سلولی است. این موضوع سبب ایجاد اختلاف پتانسیلی خواهد شد که در صورت نیاز، منجر به ورود یون کلسیم به درون سیتوسول یعنی جایی که به عنوان پیغام­رسان ثانویه عمل می­کند، می شود
(Ben Rejeba et al., 2014)

بنابراین به نظر می­رسد با توجه به نقش کانال­های کلسیمی در رشد و نمو گیاه، هرچند غلظت مناسبی از وراپامیل سبب تأخیر در باز شدن کانال­های کلسیمی و در نتیجه کاهش پاسخ دفاعی گیاه می­شود، اما استفاده از غلظت بالای آن سبب اختلال در فعالیت کانال­های کلسیمی و در نتیجه اختلال در فرآیند رشد گیاه خواهد شد.

جدول 5- مقایسه میانگین باززایی نمونه­های گوجه فرنگی رقم دافینس ترانسفورم شده با Agrobacterium tumefaciens در غلظت­های مختلف وراپامیل به عنوان بلوکه کننده کانال­های کلسیمی.

Table 7- Average regeneration of transformed tomato Dafines variety explants with Agrobacterium tumefaciens on different concentrations of verapamil as blocker of calcium channels

• The number of shoots divided by the number of explant per Petri dish

    حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنی­دار میانگین­ها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.

Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the

Duncan test.

مطالعات هیستوشیمیایی

نتایج حاصل از مطالعات هیستوشیمیایی نشان داد که از تعداد هشت نمونه باززا شده شش تای آن­ها در تماس با محلول X-gluc، آبی شدند (شکل 3).

شکل 2- نمونه­های برگ حاصل از تست هیستوشیمیایی که به علت بیان پروتئین gus آبی شده­ااند.

Figure 3- Leaf samples resulted from a histochemical test, which is blued due to the expression of gus protein.

نتیجه­گیری کلی

نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از ترکیب هورمونی TDZ و NAA نتیجه بسیار مطلوبی در باززایی دو رقم دافینس و نیوتون ایجاد می­کند. اما در مورد رقم این­فینیتی باززایی آن در چند ترکیب هورمونی مختلف، تفاوت چندانی با هم نداشت. علاوه بر این مشخص شد که در بین سه رقم مورد مطالعه، میزان باززایی رقم دافینس بیشتر و میزان باززایی رقم این­فینیتی کمتر می­باشد. در این مطالعه برای اولین بار مشخص شد که وجود غلظت مناسبی از وراپامیل در محیط کشت سبب تأخیر و یا کاهش باز شدن کانال­های کلسیمی و در نتیجه کاهش پاسخ دفاعی می­شود. کاهش پاسخ دفاعی خود عامل مهمی برای افزایش میزان باززایی و همچنین کاهش میزان قهوه­ای شدن ریزنمونه­ها به حساب می­رود. اما به نظر می­رسد از آنجا که کانال­های کلسیمی در بسیاری از فعالیت­های حیاتی سلول نقش دارند، استفاده از غلظت بالای وراپامیل در محیط کشت احتمالاً منجر به اختلال در فعالیت­های حیاتی سلول و کاهش رشد و نمو آن شود. در نتیجه اگر از وراپامیل در غلظت بالا استفاده شود، خود یک عامل بازدارنده برای باززایی و در نتیجه انتقال ژن خواهد بود. به گونه­ای که در این مطالعه مشخص شد، غلظت 50 میلی­گرم در لیتر غلظت مناسبی است و در غلظت­های بالاتر نتیجه عکس خواهد بود. در این جا باید به این نکته نیز اشاره نمود که به دلیل اهمیت سیگنال­دهی یون کلسیم در سایر فعالیت­های حیاتی گیاه، تأثیر وراپامیل در محیط هم­کشتی مورد بررسی قرار گرفت، چون به نظر می­رسید وجود این ماده در محیط انتخابی سبب اختلال در رشد و نمو گیاه شود.

References:

1. Ahsan, N., Lee, S. H. M., Anisuzzaman, D. G., Alam, M. F., Yoon, H. S., Choi, M. S., Yang, J. K. & Lee, B. H. (2007). The effects of wounding type, preculture, infection method and co-cultivation temperature on the Agrobacterium-mediated gene transfer in tomatoes. Annals of Applied Biology, 151, 363-
2. Ajenifujah-Solebo, S. O. A., Isu, N. A., Olorode, O., Ingelbrecht, I. & Abiade, O. (2012). Tissue culture regeneration of three Nigerian cultivars of tomatoes. African Journal of Plant Science, 6(14), 370-375.
3. Ben, R. I., Pastor, V. & Mauch-Mani, B. (2014). Plant responses to simultaneous biotic and abiotic stress. Molecular Mechanisms Plants, 3, 458-475.
4. Cruz-Mendivil, A. (2011). A Simple and efficient protocol for plant regeneration and genetic transformation of tomato cv. Micro-Tom from leaf explant. Horticultural Science, 46(12), 1655-1660.
5. Dan, Y., Hua, Y., Munyikwa, T., Dong, J., Zhang, Y. & Armsrtrong, C. (2006). MicroTom-a high-throughput model transformation system for functional genomics. Plant Cell Reports, 25, 432-444.
6. Dan, Y., Zhang, S. & Matherly, A. (2016). Regulation of hydrogen peroxide accumulation and death of Agrobacterium-transformed cells in tomato transformation. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 127, 229-236.
7. Durosomo, H. A., Popoola, A. R., Afolabi, C. G. & Idehen, E. O. (2014). Germination and in vitro regeneration response of local Nigerian Tomato Cultivar using different explant sources. Nigerian Journal of Biotechnology, 28, 35-42.
8. Elliott, W. & Ram, V. (2011). Calcium Channel Blockers. Clinical Hypertension, (13)9, 687-689.
9. Flynn, J. T. & Pasko, D. A. (2001). Calcium channel blockers: pharmacology and place in therapy of pediatric hypertension. Pediatric Nephroogyl, 15, 302-316.
10. Gerszberg, A., Hnatuszko-Konka, K., Kowalczyk, T. & Kononowicz, A. K. (2015). Tomato (Solanum lycopersicum) in the service of biotechnology. Plant Cell Tissue Organ Culture, 120, 881-902.
11. Guo1, B. X., Abbasi, B. H., Zeb, A., Xu, L. L. & Wei, Y. H. (2011). Thidiazuron: A multi-dimensional plant growth regulator. African Journal of Biotechnology, 10(45), 8984-9000.
12. Jamous, F. & Abu-Qaoud, H. (2015). In vitro Regeneration of Tomato (Lycopersicum esculentum Mill). Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology, 16, 181-190.
13. Jedi, L., Davarani Oliaie, A. & Farsi, M. (2009). Optimizing of factors influencing Agrobacterium tumefaciens transformation in tomato (Solanum lycopersicum). Iranian Journal of Field Crops Research, 8, 368-374. (In Persian)
14. Jefferson, R .A., Kavanagh, T. A. & Bevan, M. W. (1989). Gus fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fysion marker in higher plants. The EMBO Journal, 6(13), 3901-3907.
15. Kuta, D. D. & Tripathi, L. (2005). Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology, 4(8), 752-757.
16. Lecourieux, D., Ranjeva, R. & Pugin, A. (2006). Calcium in plant defence-signaling pathways. New Phytologist Journal, 171, 249-269.
17. Levine, A., Pennell, R. I., Alvarez, M. E., Palmer, R. & Lamb, C. (1995). Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response. Current Biology, 4, 427-437.
18. Mccormick, S., Niedermeyer, J., Fry, J., Barnason, A., Horsh, R. & Fraley, R. (1986). Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reporter, 5, 581-584.
19. Miller, J. H. (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York.
20. Mohseni fard, A., Farsi, M., Nematie, H. & Malekzadeh, K. H. (2009). Evaluation of Genetic Diversity of 16 Lycopersicon esculentum Lines Using the SSR Molecular Marker and its Correlation with Heterosis. First National Conference on Tomato Production and Processing, 11-12 Feb., Mashhad University, IRAN. (In Persian).
21. Munik, M. S. & Ekmekcioglu, C. (2015). Prooxidant effects of melatonin: a brief review. Turkish Journal of Biology, 39, 832-839.
22. Murashige, T. & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15, 473-49.
23. Nasher Mohamed, A., Ismail, M. R. & Rahman, M. H. (2010). In vitro response from cotyledon and hypocotyls explants in tomato by inducing 6-benzyl amino purine. African Journal of Biotechnology, 9(30), 4802-4807.
24. Pawar, B. D., Jadhav, A. S., Kale, A .A., Chimote, V. P. & Pawar, S. D. (2012). Zeatin induced direct shoot regeneration in tomato (Solanum Lycopersicum). The Bioscan, 7(2), 247-250.
25. Piri zirkouhi, , Mashayekhi, K., Kamkar, B., Hemmati, K. H. & Vahdatpour, F. (2010). Embryogenesis of a commercial and a native tomato cultivar using different culture media. The Journal of Plant Production, 16(1), 102-114. (In Persian)
26. Thorpe, T. A., Loyola-Vargas, V. M. & Vazquez-Flota, F. (2006). History of plant tissue culture methods in molecular biology (2nd ed.). Humana Press Inc.
27. Shah, S. H., Ali, S., Jan, S. A., Din, J. & Ali, G. M. (2015). Callus induction in vitro shoot regeneration and hairy root formation by the assessment of various plant growth regulators in tomato (Solanum lycopersicum). The Journal of Animal and Plant Sciences, 25(2), 528-538.
28. Shahpiri, A., Omidi, M., Ahmadian Tehrani, P. & Davoodi, D. (2004). Study of tissue culture and diversity of Somaclon in potatoes. Iranian Journal of Field Crops Research, 2, 323-335. (In Persian)
29. Shankara, N., Jeude, J. V., Goffau, M. D., Hilmi, M. & van Dam, B. (2005). Cultivation of tomato production processing and marketing (5th ed.). Wageningen Agromisa Foundation and CTA.
30. Sharma, M .K., Solanek, A. K,. Jandi, D., Singh, Y. & Sharma, A. K. (2009). A simple and efficient Agrobacterium-mediated procedure for transformation of tomato. Journal of Bioscience, 34, 423-433.

[1] Luria-Bertani Broth

 [2]Optical Density